• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    CFTR對(duì)TF1細(xì)胞活力和凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制

    2017-12-22 09:15:08南虎松尹明姬金春姬
    中國(guó)病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:檢測(cè)

    南虎松, 尹明姬, 金春姬

    (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科, 吉林 延吉 133000)

    CFTR對(duì)TF1細(xì)胞活力和凋亡的影響及相關(guān)機(jī)制

    南虎松△, 尹明姬, 金春姬

    (延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科, 吉林 延吉 133000)

    目的探討囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(CFTR)在急性髓系白血病中的表達(dá)情況并探討其對(duì)人紅白血病細(xì)胞株TF1生物學(xué)功能的影響及潛在作用機(jī)制。方法Real-time PCR技術(shù)檢測(cè)急性髓系白血病患兒骨髓單個(gè)核細(xì)胞中CFTR的表達(dá)水平。常規(guī)培養(yǎng)的TF1細(xì)胞中加入CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172,然后分別采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡情況;Western blot檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果CFTR在急性髓系白血病患者及白血病細(xì)胞中均呈高表達(dá)。TF1細(xì)胞中加入CFTR特異性抑制劑后,細(xì)胞的活力下降,G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高而S期細(xì)胞比例降低,細(xì)胞凋亡率顯著增加,細(xì)胞中β-catenin、c-Myc及cyclin D1的蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。結(jié)論CFTR在急性髓系白血病中表達(dá)顯著升高;抑制CFTR可通過(guò)經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路抑制白血病細(xì)胞株TF1的生長(zhǎng),并促進(jìn)其凋亡。

    囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子; 急性髓系白血病; 細(xì)胞活力; 細(xì)胞周期; 細(xì)胞凋亡; Wnt信號(hào)通路

    急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一組血液系統(tǒng)的惡性腫瘤,起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆,通過(guò)抑制正常造血和免疫功能,造成發(fā)熱、貧血和感染等臨床事件,嚴(yán)重威脅了人類(lèi)的生命健康[1]。而其治療方式仍以聯(lián)合化療為主,總的完全緩解率及生存率依舊較低[1-3],尋找更有效的治療手段已成為目前亟待解決的問(wèn)題之一。

    材 料 和 方 法

    1 材料與試劑

    人紅白血病細(xì)胞系TF1、人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系THP-1及人支氣管上皮樣細(xì)胞HBE由本實(shí)驗(yàn)室凍存;淋巴細(xì)胞分離液Ficoll購(gòu)自GE Healthcare;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、RPMI-1640培養(yǎng)基及DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)于Gibco;CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172購(gòu)于Sigma; 抗CFTR抗體購(gòu)于Abcam;抗β-catenin、c-Myc、cyclin D1及β-actin抗體購(gòu)于CST;CCK-8細(xì)胞活力分析試劑盒購(gòu)于廣州賴(lài)德生物技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒及細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京凱基公司;SYBR Green I Real-time PCR Kit由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司提供。

    2 方法

    2.1臨床標(biāo)本制備 收集由本院收診的32例經(jīng)MICM分型診斷的初診AML患兒(實(shí)驗(yàn)組,AML組)和10例健康志愿者(對(duì)照組,control組)的骨髓樣本。所選取的AML患兒依據(jù)FAB分型包括M1(7例)、M2(14例)、M3(10例)和M5(1例)。所有實(shí)驗(yàn)均經(jīng)家屬知情同意,并報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。骨髓穿刺抽取初診或者臨床化療前患兒新鮮骨髓2~4 mL,置于EDTA抗凝管中。依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求采用Ficoll法分離患者骨髓中的單個(gè)核細(xì)胞,步驟簡(jiǎn)述如下:取離心管按照1∶2或者2∶3的比例加入淋巴細(xì)胞分離液Ficoll和骨髓液,100×g離心20 min,吸取界面層的單個(gè)核細(xì)胞,而后PBS洗2次。收集細(xì)胞凍存于-80 ℃冰箱中備用。

    2.2細(xì)胞培養(yǎng)、分組及處理 實(shí)驗(yàn)用TF1細(xì)胞和THP-1細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于預(yù)先配制好并濾過(guò)除菌的含10% FBS RPMI-1640 完全培養(yǎng)基中,實(shí)驗(yàn)用HBE細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于預(yù)先配制好并濾過(guò)除菌的含10% FBS DMEM完全培養(yǎng)基中;培養(yǎng)箱條件設(shè)置為飽和濕度、37 ℃、5% CO2,間隔1~2 d換液。

    2.3CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力 將細(xì)胞以2×108/L的密度接種于96孔板,按0、50、100、150和200 μmol/L的濃度梯度依次加入CFTRinh-172,于培養(yǎng)箱中孵育22 h。之后按照說(shuō)明書(shū)要求,加入10 μL CCK-8試劑,置于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)反應(yīng)2 h,經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔取均值,另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基作空白對(duì)照。

    2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 各組細(xì)胞經(jīng)CFTRinh-172(0、50和100 μmol/L)孵育24 h后,離心收集細(xì)胞,后用預(yù)冷的PBS漂洗并再次離心棄上清;加70%的冰乙醇于4 ℃固定24 h,1 000×g離心洗去乙醇。依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū),先后加入RNase(37 ℃反應(yīng)30 min)及碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色液(4 ℃避光孵育30 min),用流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處紅色熒光強(qiáng)度,分析DNA周期及各期細(xì)胞比例。

    2.5Annexin V/PI 雙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 各組細(xì)胞經(jīng)CFTRinh-172(0、50和100 μmol/L)處理后,依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求,加不含EDTA的胰酶消化并離心收集細(xì)胞,而后加Binding Buffer重懸細(xì)胞。先后加入Annexin V-FITC(室溫避光孵育10 min)和PI染液(室溫避光孵育5 min)。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)激發(fā)波長(zhǎng)488 nm、發(fā)射波長(zhǎng)530 nm處的熒光強(qiáng)度,分析細(xì)胞的凋亡率。

    2.6Western blot測(cè)定蛋白水平 加RIPA裂解液提取細(xì)胞蛋白,BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量后,調(diào)整各組上樣蛋白總量至80 μg,加入4倍體積的Loading Buffer,95 ℃ 5 min變性,然后進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)束后將蛋白在200 mA恒流的條件下電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。用5%脫脂牛奶于搖床上室溫封閉2 h,依據(jù)說(shuō)明書(shū)要求加入相應(yīng)的 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜,次日復(fù)溫后,吸去 I 抗孵育液并加TBST洗滌3次,每次5 min;而后加入對(duì)應(yīng)的 II 抗室溫孵育2 h,TBST洗滌3次,每次10 min,暗室中加ECL發(fā)光液顯影、定影,沖洗膠片后經(jīng)ImageJ行蛋白半定量灰度分析。

    2.7Real-time PCR實(shí)驗(yàn) 依據(jù)Trizol一步法說(shuō)明書(shū)提取各組樣品的總RNA,并測(cè)定所提樣品的純度。定量后取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄至終體積20 μL的cDNA,然后依照SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒說(shuō)明檢測(cè)CFTR mRNA的表達(dá)。CFTR的上游引物為5’-TGAACACAGGATAGAAGCGATGTTG-3’,下游引物為 5’-GGAGCTAATGGCCTGCTGGA-3’; β-actin為內(nèi)參照,上游引物為5’-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3’,下游引物為5’-ATCCTTCTGACCCAT GCCCACCA-3’。PCR反應(yīng)條件為: 95 ℃ 預(yù)變性2 min; 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 20 s, 40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法分析基因相對(duì)表達(dá)量。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    所有數(shù)據(jù)錄入SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。兩組計(jì)量資料的組間差異采用t檢驗(yàn),多組計(jì)量資料行單因素方差分析,同時(shí)采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)進(jìn)行均數(shù)組間的兩兩比較,計(jì)數(shù)資料的比較采用2檢驗(yàn)。 以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 CFTR在急性髓系白血病中的表達(dá)

    Real-time PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示,急性髓系白血病患兒體內(nèi)CFTR的平均表達(dá)水平是對(duì)照組的(1.87±0.11)倍(P<0.05),見(jiàn)圖1A。同時(shí)相對(duì)于陰性對(duì)照組HBE細(xì)胞,白血病細(xì)胞系TF1及THP-1中CFTR的mRNA及蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05),見(jiàn)圖1B、C。上述結(jié)果表明CFTR在急性髓系白血病中高表達(dá)。

    Figure 1. CFTR expression in acute myeloid leukemia (AML) patients and leukemia cell lines. A: the mRNA expression of CFTR in AML patients; B: the mRNA expression of CFTR in leukemia cell lines; C: the protein expression of CFTR in leukemia cell lines. Mean±SD.n=6.#P<0.05vsnormal group;*P<0.05vsHBE cells.

    圖1CFTR在急性髓系白血病患者和白血病細(xì)胞系中的表達(dá)

    2 CFTRinh-172對(duì)TF1細(xì)胞活力和細(xì)胞周期分布的變化的影響

    在常規(guī)培養(yǎng)的TF1細(xì)胞中加入0~200 μmol/L的CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172,采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力的變化。結(jié)果顯示,加入100 μmol/L 的CFTRinh-172后,TF1細(xì)胞活力降低至(58.47±4.65)%(P<0.05),而HBE細(xì)胞活力沒(méi)有顯著變化,見(jiàn)圖2。進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了TF1細(xì)胞的周期分布情況,結(jié)果顯示, 100 μmol/L的CFTRinh-172孵育24 h后,G0/G1期的細(xì)胞所占百分比增加(P<0.05),S期細(xì)胞所占百分比減少(P<0.05),說(shuō)明CFTRinh-172可抑制TF1細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化,見(jiàn)圖3。

    3 CFTRinh-172對(duì)TF1細(xì)胞凋亡的影響

    細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示,100 μmol/L的CFTRinh-172孵育24 h后,TF1細(xì)胞的早期凋亡率由(7.21±0.62)%增加至(29.47±1.95)%(P<0.05),說(shuō)明CFTRinh-172可促進(jìn)TF1細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖4。

    Figure 2. The effects of CFTR specific inhibitor CFTRinh-172 on the viability of TF1 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

    圖2CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對(duì)TF1細(xì)胞活力的影響

    4 CFTRinh-172對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

    相較于對(duì)照組,100 μmol/L的CFTRinh-172孵育24 h后,TF1細(xì)胞中β-catenin、c-Myc及cyclin D1 的蛋白水平均顯著降低(P<0.05),提示CFTRinh-172可抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的激活,見(jiàn)圖5。

    討 論

    隨著對(duì)AML發(fā)病機(jī)制的深入研究,針對(duì)特定基因的靶向治療給AML的診療帶來(lái)了新的方向。目前在AML中發(fā)現(xiàn)了包括酪氨酸激酶(tyrosine kinases, TKs)相關(guān)基因及轉(zhuǎn)錄抑制因子AML1-ETO在內(nèi)的超過(guò)100種基因異常表達(dá),但是仍有大量病例缺乏特征性的標(biāo)記分子[6-7];而相當(dāng)多的研究顯示[8-11],CFTR在腫瘤中起著類(lèi)似原癌基因或者抑癌基因的作用。本研究檢測(cè)了急性髓系白血病中CFTR的表達(dá)情況,結(jié)果顯示急性髓系白血病患兒體內(nèi)及白血病細(xì)胞系TF1和THP-1中CFTR的表達(dá)均明顯升高,提示CFTR可能參與調(diào)控急性髓系白血病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。眾所周知,腫瘤的發(fā)生發(fā)展通常與腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性的改變密切相關(guān),大量研究顯示,腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是腫瘤形成及發(fā)展的關(guān)鍵[12]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步借助CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172探討了CFTR對(duì)白血病TF1細(xì)胞活力、細(xì)胞周期及凋亡等生物學(xué)特性的影響。CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)和流式細(xì)胞周期檢測(cè)的結(jié)果顯示,CFTRinh-172可降低TF1細(xì)胞活力,并抑制細(xì)胞周期由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)化;同時(shí)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示,CFTRinh-172可促進(jìn)TF1細(xì)胞凋亡。結(jié)果提示,在急性髓系白血病中,CFTR可通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)及凋亡,調(diào)控白血病的發(fā)展進(jìn)程。

    Figure 3. The effects of CFTR specific inhibitor CFTRinh-172 on cell cycle distribution of TF1 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

    圖3CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對(duì)TF1細(xì)胞周期的影響

    Figure 4. The effects of CFTR specific inhibitor CFTRinh-172 on the apoptosis of TF1 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

    圖4CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對(duì)TF1細(xì)胞凋亡的影響

    Figure 5. The effects of CFTR specific inhibitor CFTRinh-172 on the expression of Wnt signaling pathway-related proteins. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group.

    圖5CFTR特異性抑制劑CFTRinh-172對(duì)Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

    細(xì)胞生物學(xué)功能通常是受到細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)控,Wnt信號(hào)通路就是其中之一。根據(jù)是否依據(jù)依賴(lài)β-catenin,Wnt信號(hào)通路可分為經(jīng)典和非經(jīng)典通路[13]。經(jīng)典的Wnt通路被激活后可抑制效應(yīng)物β-catenin的降解,進(jìn)而激活下游通路;研究顯示,該通路與造血干細(xì)胞的自我更新有著密切的關(guān)系,且在各類(lèi)白血病中均出現(xiàn)異常[14-16]。此外,Le Henaff等[17]發(fā)現(xiàn) ΔF508-CFTR突變小鼠體內(nèi)成骨細(xì)胞分化及功能異常的出現(xiàn)與Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性降低密切相關(guān)。故而本研究進(jìn)一步分析了在白血病細(xì)胞系TF1中,CFTR與Wnt/β-catenin信號(hào)通路之間的關(guān)系。結(jié)果顯示, CFTRinh-172可下調(diào)TF1細(xì)胞中β-catenin、c-Myc及cyclin D1 的蛋白水平,提示CFTRinh-172可抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路的激活。由此我們推測(cè),CFTR對(duì)白血病細(xì)胞TF1生長(zhǎng)及凋亡的影響可能與Wnt信號(hào)通路相關(guān),但是兩者之間是否存在直接的相互作用以及其中具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。

    綜上所述,CFTR在急性髓系白血病患者及白血病細(xì)胞系TF1和THP-1中表達(dá)顯著升高。抑制CFTR可抑制白血病細(xì)胞株TF1的生長(zhǎng),并促進(jìn)其凋亡;其作用機(jī)制可能與經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路相關(guān)。

    [1] Enrico A, Bestach Y, Flores MG, et al. Influence of acute myeloid leukemia progression on the prognosis of 831 patients with myelodysplastic syndromes from the argentine database[J]. Clin Lymphoma Myeloma Leuk, 2017, 17(11):743-752.

    [2] Carneiro BA, Altman JK, Kaplan JB, et al. Targeted therapy of acute myeloid leukemia[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2015, 15(4):399-413.

    [3] Lam SS, He AB, Leung AY. Treatment of acute myeloid leukemia in the next decade: towards real-time functional testing and personalized medicine[J]. Blood Rev, 2017, 31(6):418-425.

    [4] Cant N, Pollock N, Ford RC. CFTR structure and cystic fibrosis[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2014, 52:15-25.

    [5] Farinha CM, Swiatecka-Urban A, Brautigan DL, et al. Regulatory crosstalk by protein kinases on CFTR trafficking and activity[J]. Front Chem, 2016, 4:1.

    [6] Pillinger G, Loughran NV, Piddock RE, et al. Targeting PI3Kδ and PI3Kγ signalling disrupts human AML survival and bone marrow stromal cell mediated protection[J]. Oncotarget, 2016, 7(26): 39784-39795.

    [7] Li Y, Ning Q, Shi J, et al. A novel epigeneticAML1-ETO/THAP10/miR-383 mini-circuitry contributes to t(8;21) leukaemogenesis[J]. EMBO Mol Med, 2017, 9(7): 933-949.

    [8] Than BLN, Linnekamp JF, Starr TK, et al. CFTR is a tumor suppressor gene in murine and human intestinal cancer[J]. Oncogene, 2017, 36(24):3504.

    [9] Xu J, Lin L, Yong M, et al. Adenovirus-mediated overexpression of cystic fibrosis transmembrane conductance re-gulator enhances invasiveness and motility of serous ovarian cancer cells[J]. Mol Med Rep, 2016, 13(1):265-272.

    [10] Zhang JT, Jiang XH, Xie C, et al. Downregulation of CFTR promotes epithelial-to-mesenchymal transition and is associated with poor prognosis of breast cancer[J]. Biochim Biophys Acta, 2013, 1833(12):2961-2969.

    [11] Li J, Zhang JT, Jiang X, et al. The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator as a biomarker in non-small cell lung cancer[J]. Int J Oncol, 2015, 46(5):2107-2115.

    [12] Kim TK, Gore SD, Zeidan AM. Epigenetic therapy in acute myeloid leukemia: current and future directions[J]. Semin Hematol, 2015, 52(3):172-183.

    [13] Malinauskas T, Jones EY. Extracellular modulators of Wnt signalling[J]. Curr Opin Struct Biol, 2014, 29:77-84.

    [14] Van Camp JK, Beckers S, Zegers D, et al. Wnt signaling and the control of human stem cell fate[J]. Stem Cell Rev, 2014, 10(2):207-229.

    [15] Wang Y, Krivtsov AV, Sinha AU, et al. The Wnt/β-catenin pathway is required for the development of leukemia stem cells in AML[J]. Science, 2010, 327(5973):1650-1653.

    [16] Franiak-Pietryga I, Maciejewski H, Ziemba B, et al. Blockage of Wnt/β-catenin signaling by nanoparticles reduces survival and proliferation of CLL cellsinvitro: preliminary study[J]. Macromol Biosci, 2017, 17(11):1700130.

    [17] Le Henaff C, Mansouri R, Modrowski D, et al. Increased NF-κB activity and decreased Wnt/β-catenin signaling mediate reduced osteoblast differentiation and function in ΔF508 cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mice[J]. J Biol Chem, 2015, 290(29):18009-18017.

    Effect of CFTR on viability and apoptosis of acute leukemia cells and its related mechanisms

    NAN Hu-song, YIN Ming-ji, JIN Chun-ji

    (DepartmentofPediatrics,YanbianUniversityHospital,Yanji133000,China.E-mail: 1569657202@qq.com)

    AIM: To investigate the expression of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) in acute myeloid leukemia (AML) and its effect on the biological function of human erythroleukemia cell line TF1, and to explore the underlying mechanism.METHODSThe abundance of CFTR in the bone marrow mononuclear cells of patients with AML was measured by real-time PCR. After TF1 cells were incubated with CFTR specific inhibitor CFTRinh-172, cell viability, cell cycle distribution and cell apoptosis were analyzed by CCK-8 assay and flow cytometry. The Wnt signaling pathway-related proteins were determined by Western blot.RESULTSCFTR was highly expressed in both patients with AML and leukemia cell lines. After incubated with CFTRinh172, the viability of TF1 cells was decreased, the proportion of the cells in G0/G1phase was increased, while that in S phase declined (P<0.05). Furthermore, the cells treated with CFTRinh-172 exhibited higher apoptotic rate, accompanied with lower protein expression of β-catenin, c-Myc and cyclin D1 (P<0.05).CONCLUSIONCFTR expression is dramatically increased in AML. Inhibition of CFTR restrains the growth and promotes the apoptosis of TF1 cells via classical Wnt signaling pathway.

    Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; Acute myeloid leukemia; Cell viability; Cell cycle; Apoptosis; Wnt signaling pathway

    1000- 4718(2017)12- 2202- 06

    2017- 08- 23

    2017- 11- 20

    △通訊作者 Tel: 0433-2660083; E-mail: 1569657202@qq.com

    R733.71; R363

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.014

    (責(zé)任編輯: 陳妙玲, 羅 森)

    猜你喜歡
    檢測(cè)
    QC 檢測(cè)
    “不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式”檢測(cè)題
    “一元一次不等式組”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “有理數(shù)的乘除法”檢測(cè)題
    “有理數(shù)”檢測(cè)題
    “角”檢測(cè)題
    “幾何圖形”檢測(cè)題
    悠悠久久av| 欧美午夜高清在线| 日本成人三级电影网站| 国产在线精品亚洲第一网站| 一区二区三区免费毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线观看舔阴道视频| 国产精品久久电影中文字幕| 成人鲁丝片一二三区免费| 久久久久国内视频| 我要搜黄色片| 天堂动漫精品| 一区二区三区高清视频在线| 亚洲最大成人中文| 级片在线观看| 精品熟女少妇八av免费久了| 成年人黄色毛片网站| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 女同久久另类99精品国产91| 国产探花极品一区二区| 国产伦精品一区二区三区四那| 日本撒尿小便嘘嘘汇集6| 熟女人妻精品中文字幕| 女警被强在线播放| 老司机午夜十八禁免费视频| 性欧美人与动物交配| 美女cb高潮喷水在线观看| АⅤ资源中文在线天堂| 久久人人精品亚洲av| 国语自产精品视频在线第100页| 久久人妻av系列| 亚洲av电影不卡..在线观看| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 免费在线观看亚洲国产| 国产欧美日韩一区二区精品| 老鸭窝网址在线观看| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 欧美又色又爽又黄视频| 欧美日韩黄片免| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产日本99.免费观看| 国产淫片久久久久久久久 | 99久久精品一区二区三区| 夜夜夜夜夜久久久久| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久国内视频| 91久久精品国产一区二区成人 | 一区福利在线观看| 亚洲自拍偷在线| 999久久久精品免费观看国产| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 欧美高清成人免费视频www| 国产精品永久免费网站| 在线观看日韩欧美| 极品教师在线免费播放| 丰满乱子伦码专区| 高清日韩中文字幕在线| 97超视频在线观看视频| 国产精品三级大全| 欧美黑人欧美精品刺激| 国产av不卡久久| 成人三级黄色视频| 动漫黄色视频在线观看| 中文字幕av成人在线电影| 国产精品久久久人人做人人爽| 中文字幕熟女人妻在线| 国产美女午夜福利| 亚洲成人久久爱视频| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 国产激情偷乱视频一区二区| 两个人的视频大全免费| 岛国视频午夜一区免费看| 99国产综合亚洲精品| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 成人性生交大片免费视频hd| 精品熟女少妇八av免费久了| 中国美女看黄片| 成人无遮挡网站| 欧美色欧美亚洲另类二区| www.熟女人妻精品国产| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品电影一区二区三区| 在线天堂最新版资源| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 亚洲内射少妇av| 在线观看午夜福利视频| av黄色大香蕉| 全区人妻精品视频| 久久人人精品亚洲av| 高清日韩中文字幕在线| 国产亚洲av嫩草精品影院| 色av中文字幕| 欧美日韩精品网址| 日本 av在线| 叶爱在线成人免费视频播放| 桃色一区二区三区在线观看| 免费在线观看成人毛片| 国产探花在线观看一区二区| 身体一侧抽搐| 天堂√8在线中文| 亚洲精品影视一区二区三区av| 美女高潮的动态| 欧美成人免费av一区二区三区| svipshipincom国产片| 内射极品少妇av片p| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品三级大全| 十八禁人妻一区二区| 久久久久性生活片| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲无线观看免费| 男人舔奶头视频| 88av欧美| 嫁个100分男人电影在线观看| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 欧美在线黄色| 两个人视频免费观看高清| 18美女黄网站色大片免费观看| 欧美成人免费av一区二区三区| 亚洲午夜理论影院| 亚洲美女黄片视频| 最近最新中文字幕大全免费视频| 老司机福利观看| 亚洲一区二区三区不卡视频| 亚洲专区中文字幕在线| 少妇的逼好多水| 中亚洲国语对白在线视频| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| svipshipincom国产片| 岛国在线观看网站| 男人舔女人下体高潮全视频| 老汉色av国产亚洲站长工具| 熟女人妻精品中文字幕| 波多野结衣巨乳人妻| av在线蜜桃| 婷婷六月久久综合丁香| 在线观看免费午夜福利视频| 9191精品国产免费久久| 啦啦啦免费观看视频1| 制服丝袜大香蕉在线| 免费在线观看亚洲国产| 日本熟妇午夜| 久久这里只有精品中国| 18禁美女被吸乳视频| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品 欧美亚洲| 国产成+人综合+亚洲专区| 欧美三级亚洲精品| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 两个人视频免费观看高清| 校园春色视频在线观看| 久久久久久久久中文| 在线观看av片永久免费下载| 国产精品女同一区二区软件 | 亚洲中文字幕日韩| www.色视频.com| 国产成年人精品一区二区| 美女cb高潮喷水在线观看| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 国产色婷婷99| h日本视频在线播放| 欧美av亚洲av综合av国产av| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 麻豆国产97在线/欧美| 中亚洲国语对白在线视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| 91在线观看av| 欧美+亚洲+日韩+国产| 露出奶头的视频| 久久久久性生活片| 成人国产综合亚洲| 亚洲激情在线av| 久久久久九九精品影院| 国产精品一区二区免费欧美| 久久久久久人人人人人| 国产精品精品国产色婷婷| 欧美丝袜亚洲另类 | 国模一区二区三区四区视频| 在线播放国产精品三级| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 18禁国产床啪视频网站| 日韩亚洲欧美综合| 在线国产一区二区在线| 3wmmmm亚洲av在线观看| 丝袜美腿在线中文| 精品一区二区三区av网在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 免费电影在线观看免费观看| 精品欧美国产一区二区三| 亚洲在线自拍视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久性生活片| 色老头精品视频在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 99国产综合亚洲精品| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 在线观看舔阴道视频| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产精品久久久久久精品电影| 亚洲五月天丁香| 成人鲁丝片一二三区免费| 色综合婷婷激情| 午夜福利18| 无遮挡黄片免费观看| 国产成人福利小说| 国产淫片久久久久久久久 | 九色成人免费人妻av| av女优亚洲男人天堂| 亚洲第一电影网av| 国产高清视频在线播放一区| 欧美在线黄色| 中国美女看黄片| 亚洲国产色片| 国产精品亚洲av一区麻豆| 日韩欧美在线乱码| 日韩欧美精品v在线| 99久久精品热视频| 男人的好看免费观看在线视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频 久久午夜综合久久蜜桃 | 亚洲黑人精品在线| av片东京热男人的天堂| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 久久精品国产亚洲av香蕉五月| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费大片18禁| 美女 人体艺术 gogo| 精品一区二区三区视频在线 | 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 国产亚洲精品久久久com| 亚洲一区二区三区不卡视频| 国产三级黄色录像| 黑人欧美特级aaaaaa片| avwww免费| 午夜激情福利司机影院| 日本黄大片高清| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 99久久成人亚洲精品观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 中文字幕人成人乱码亚洲影| 在线观看66精品国产| 国产高清视频在线播放一区| 黄色女人牲交| 免费观看人在逋| 好男人在线观看高清免费视频| 久久午夜亚洲精品久久| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲av成人精品一区久久| 在线a可以看的网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 黄色丝袜av网址大全| 成人一区二区视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 老司机福利观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 99久久精品一区二区三区| 午夜久久久久精精品| 怎么达到女性高潮| 国产欧美日韩精品一区二区| 欧美一级a爱片免费观看看| 高清在线国产一区| 国产成人啪精品午夜网站| 免费看日本二区| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 国产精品综合久久久久久久免费| 国产av在哪里看| 99久久精品热视频| 久久99热这里只有精品18| 十八禁网站免费在线| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 91麻豆精品激情在线观看国产| 亚洲自拍偷在线| 亚洲片人在线观看| 色吧在线观看| 九九热线精品视视频播放| 91在线精品国自产拍蜜月 | 欧美成狂野欧美在线观看| 操出白浆在线播放| 国产 一区 欧美 日韩| 欧美+日韩+精品| 黄色日韩在线| 久久久久久人人人人人| 中文字幕av成人在线电影| 在线视频色国产色| 哪里可以看免费的av片| 成人午夜高清在线视频| 欧美一级毛片孕妇| 欧美+日韩+精品| 亚洲美女黄片视频| 亚洲无线在线观看| 一区二区三区免费毛片| 美女高潮的动态| 给我免费播放毛片高清在线观看| 国产日本99.免费观看| 男女那种视频在线观看| 午夜日韩欧美国产| 国产在线精品亚洲第一网站| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 久久精品影院6| 色噜噜av男人的天堂激情| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日本精品一区二区三区蜜桃| 少妇的逼好多水| or卡值多少钱| 亚洲av免费高清在线观看| 热99re8久久精品国产| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久久免费精品人妻一区二区| 亚洲无线观看免费| 不卡一级毛片| 国产真实伦视频高清在线观看 | 99精品欧美一区二区三区四区| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 久久午夜亚洲精品久久| 脱女人内裤的视频| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲精品日韩av片在线观看 | 男女下面进入的视频免费午夜| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 国产精华一区二区三区| 十八禁人妻一区二区| 热99re8久久精品国产| 久久久久精品国产欧美久久久| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频| 国产精品亚洲美女久久久| 一个人看的www免费观看视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 久久国产乱子伦精品免费另类| 香蕉av资源在线| or卡值多少钱| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 精品福利观看| 97碰自拍视频| www.色视频.com| 成人特级av手机在线观看| 天天躁日日操中文字幕| 国产精品野战在线观看| 欧美最新免费一区二区三区 | 久久草成人影院| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利18| 久久精品影院6| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 亚洲精品国产精品久久久不卡| av视频在线观看入口| 久9热在线精品视频| 国产高清videossex| 看黄色毛片网站| 国产精品98久久久久久宅男小说| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久99热这里只有精品18| 九九热线精品视视频播放| 日韩欧美精品免费久久 | 国产一级毛片七仙女欲春2| 日韩精品青青久久久久久| 国产精品久久久久久精品电影| 免费观看人在逋| 亚洲最大成人手机在线| 桃色一区二区三区在线观看| 人妻久久中文字幕网| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 午夜精品一区二区三区免费看| 欧美激情久久久久久爽电影| 熟女电影av网| 国产男靠女视频免费网站| 色在线成人网| www.色视频.com| 精品久久久久久久毛片微露脸| 日韩欧美精品免费久久 | 老熟妇仑乱视频hdxx| 嫩草影视91久久| 久久人人精品亚洲av| 精品乱码久久久久久99久播| 51午夜福利影视在线观看| 高清毛片免费观看视频网站| 色视频www国产| 一级毛片女人18水好多| 亚洲国产精品合色在线| 成人av一区二区三区在线看| 国内揄拍国产精品人妻在线| 国产精品爽爽va在线观看网站| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲人成网站在线播| 91在线观看av| 两个人的视频大全免费| 精品国产美女av久久久久小说| 90打野战视频偷拍视频| 欧美乱妇无乱码| 91麻豆av在线| 中文字幕高清在线视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女| 日韩欧美精品v在线| 久久久久久国产a免费观看| 毛片女人毛片| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 在线国产一区二区在线| 人妻夜夜爽99麻豆av| 午夜免费观看网址| а√天堂www在线а√下载| 美女 人体艺术 gogo| 亚洲国产欧美网| 久久久久久人人人人人| 十八禁网站免费在线| 最近最新免费中文字幕在线| 1024手机看黄色片| 国产精品野战在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 深夜精品福利| 欧美乱妇无乱码| 欧美国产日韩亚洲一区| 又黄又爽又免费观看的视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 麻豆国产97在线/欧美| 一边摸一边抽搐一进一小说| 欧美3d第一页| 午夜日韩欧美国产| 全区人妻精品视频| 亚洲精品色激情综合| 高清毛片免费观看视频网站| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美 | 全区人妻精品视频| 婷婷六月久久综合丁香| 日韩av在线大香蕉| 高清在线国产一区| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 在线观看一区二区三区| 一夜夜www| 国产成人影院久久av| 国产中年淑女户外野战色| 国产综合懂色| 色综合婷婷激情| 久久人人精品亚洲av| 精品久久久久久久末码| 久久伊人香网站| 757午夜福利合集在线观看| 草草在线视频免费看| 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲片人在线观看| 热99在线观看视频| 日韩高清综合在线| 午夜视频国产福利| 亚洲国产精品999在线| 18美女黄网站色大片免费观看| 窝窝影院91人妻| 啦啦啦免费观看视频1| 亚洲国产色片| 免费看光身美女| 免费高清视频大片| 国产成人欧美在线观看| 亚洲中文字幕日韩| 噜噜噜噜噜久久久久久91| svipshipincom国产片| 国产免费一级a男人的天堂| 叶爱在线成人免费视频播放| 级片在线观看| 国内精品美女久久久久久| 亚洲七黄色美女视频| www.熟女人妻精品国产| 91久久精品电影网| 在线观看美女被高潮喷水网站 | 国产国拍精品亚洲av在线观看 | 丁香六月欧美| 国产不卡一卡二| 精品熟女少妇八av免费久了| www日本在线高清视频| 宅男免费午夜| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 在线免费观看不下载黄p国产 | 香蕉丝袜av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 男人和女人高潮做爰伦理| 日本熟妇午夜| 有码 亚洲区| 国产成人a区在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 国内精品久久久久久久电影| 三级国产精品欧美在线观看| 天美传媒精品一区二区| 欧美最黄视频在线播放免费| 欧美在线黄色| 国产成人影院久久av| 国内精品一区二区在线观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 黄色丝袜av网址大全| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区 | 精品一区二区三区av网在线观看| 村上凉子中文字幕在线| 成人av在线播放网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 舔av片在线| 欧美中文综合在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 一边摸一边抽搐一进一小说| 成人永久免费在线观看视频| 成人特级av手机在线观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 亚洲五月婷婷丁香| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 亚洲熟妇熟女久久| 狂野欧美激情性xxxx| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 欧美黑人巨大hd| 特级一级黄色大片| 色吧在线观看| 亚洲人成网站高清观看| 香蕉av资源在线| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 成人三级黄色视频| 国产精品亚洲av一区麻豆| 国产视频一区二区在线看| av视频在线观看入口| 亚洲国产欧美网| 久久久国产精品麻豆| 国产色爽女视频免费观看| 男人舔女人下体高潮全视频| 99久久精品国产亚洲精品| 全区人妻精品视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 国产亚洲精品av在线| 亚洲av美国av| 内地一区二区视频在线| 久久国产乱子伦精品免费另类| 可以在线观看的亚洲视频| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 天美传媒精品一区二区| 丁香六月欧美| 亚洲av美国av| 日本三级黄在线观看| 亚洲国产精品999在线| 热99re8久久精品国产| 1000部很黄的大片| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲国产精品合色在线| 乱人视频在线观看| 丁香六月欧美| 深夜精品福利| 制服人妻中文乱码| eeuss影院久久| 日本黄色片子视频| 91字幕亚洲| 在线观看日韩欧美| 身体一侧抽搐| 俺也久久电影网| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 天美传媒精品一区二区| 国产熟女xx| 九九热线精品视视频播放| 国产精品电影一区二区三区| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9| 精品人妻1区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产一级毛片七仙女欲春2| 最后的刺客免费高清国语| 日韩精品中文字幕看吧| 香蕉丝袜av| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 91麻豆精品激情在线观看国产| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 少妇人妻一区二区三区视频| 精品无人区乱码1区二区| 在线观看av片永久免费下载| 午夜福利视频1000在线观看| 免费av不卡在线播放| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久久久国产精品人妻aⅴ院| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 99久久99久久久精品蜜桃| 色综合站精品国产| 成人一区二区视频在线观看| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 精品久久久久久久久久免费视频| 午夜免费观看网址| 99久久成人亚洲精品观看| 黄色女人牲交| 日本在线视频免费播放| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 欧美日本亚洲视频在线播放| 18美女黄网站色大片免费观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 亚洲avbb在线观看| 久久人人精品亚洲av| 少妇的丰满在线观看| 日韩成人在线观看一区二区三区| 欧美3d第一页| 丁香欧美五月| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品国产三级普通话版| 级片在线观看| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 中文字幕av成人在线电影| 美女 人体艺术 gogo| 国产三级在线视频| 国产精品久久久久久久久免 | 一级毛片女人18水好多| 麻豆国产97在线/欧美| 99久久99久久久精品蜜桃| 久久久精品欧美日韩精品| 亚洲无线观看免费| 69人妻影院|