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    葉酸修飾的聚乙烯亞胺聚合物載PD-L1 siRNA體外靶向胃癌細(xì)胞的研究*

    2017-12-22 09:09:51陳廣成侯婧瑛吳淑云王凌云
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:胃癌實(shí)驗(yàn)

    羅 信, 彭 霞, 陳廣成, 侯婧瑛, 吳淑云, 王凌云△

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 1消化內(nèi)科, 2急診科, 廣東 廣州 510120; 3中山大學(xué)腫瘤防治中心胸外科, 廣東 廣州 510060)

    葉酸修飾的聚乙烯亞胺聚合物載PD-L1 siRNA體外靶向胃癌細(xì)胞的研究*

    羅 信1, 彭 霞1, 陳廣成1, 侯婧瑛2, 吳淑云3, 王凌云1△

    (中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院1消化內(nèi)科,2急診科, 廣東 廣州 510120;3中山大學(xué)腫瘤防治中心胸外科, 廣東 廣州 510060)

    目的構(gòu)建高效的siRNA納米載體靶向SGC-7901胃癌細(xì)胞,并下調(diào)胃癌表達(dá)的程序性死亡配體1(PD-L1)。方法檢測葉酸(FA)-PEG-SS-PEI-SPION納米載體與siRNA復(fù)合后的粒徑、電位等表征;體外實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)siRNA的結(jié)合能力、復(fù)合物細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝入能力及轉(zhuǎn)染效率;磁共振(MR)成像檢測示蹤能力;檢驗(yàn)胃癌細(xì)胞PD-L1下調(diào)效應(yīng)及共培養(yǎng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子水平。結(jié)果N/P比值為10時(shí),F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION完全復(fù)合siRNA,形成電位為(9.14±0.80) mV、粒徑為(116.7±2.5) nm的多聚復(fù)合物。靶向組的轉(zhuǎn)染率為(95.06±0.44)%,與非靶向組的(93.87±1.05)%相當(dāng);平均熒光強(qiáng)度為1 892.67±81.51,高于非靶向組的1 324.33±186.58 (P<0.05)。普魯士藍(lán)染色和激光共聚焦顯微鏡成像證實(shí)了復(fù)合物的細(xì)胞攝入。體外MR成像驗(yàn)證了聚合物的MR造影成像能力。靶向組PD-L1 的mRNA最低相對表達(dá)量為9.07%±0.79%,Western blot顯示PD-L1的表達(dá)顯著降低。共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)顯示IFN-γ和TNF-α的分泌水平增加,IL-10的分泌水平降低(P<0.05)。結(jié)論本研究構(gòu)建了FA-PEG-SS-PEI-SPION納米載體,并證明了其體外靶向細(xì)胞及載siRNA下調(diào)PD-L1表達(dá)的能力和MR示蹤的能力,是一種高效和安全的靶向治療納米載體。

    程序性死亡配體1; 胃癌; 葉酸; 磁共振成像; siRNA

    胃癌在亞洲、東歐和拉丁美洲的許多國家中是發(fā)病率最高的惡性腫瘤,是腫瘤死亡的第3大病因[1-2]。目前胃癌的主要治療手段是手術(shù)和化療,而免疫檢查點(diǎn)的靶向治療是一種具有前景的胃癌治療方法。其中,程序性死亡配體1(programmed death ligand-1,PD-L1)能和表達(dá)在活化T細(xì)胞上面的程序性死亡受體1(programmed death 1,PD-1)結(jié)合,參與逃逸腫瘤中免疫細(xì)胞的監(jiān)視[3]。PD-L1可以通過促進(jìn)對調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)的誘導(dǎo)和維持來抑制T細(xì)胞反應(yīng)[4]。胃癌中具有過表達(dá)PD-1/PD-L1的特征[5-7],而且PD-L1的高表達(dá)與胃癌的不良預(yù)后密切相關(guān)[8-10]。以上均提示PD-L1在胃癌的進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用,阻斷PD-1/PD-L1可以逆轉(zhuǎn)免疫逃逸和改善預(yù)后。目前的臨床研究多集中于使用多克隆抗體阻斷PD-L1治療胃癌,但是還沒有使用聚合物基因載體進(jìn)行胃癌PD-L1阻斷治療的報(bào)道。小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)作為一種較成熟的基因治療手段,具有安全性好、特異性高等優(yōu)勢,因此本實(shí)驗(yàn)探究并構(gòu)建一種多功能siRNA載體聚合物靶向輸送于葉酸受體(folic acid receptor,F(xiàn)R)和PD-L1過表達(dá)的胃癌細(xì)胞系SGC-7901中[11],以驗(yàn)證該聚合物載體對胃癌的應(yīng)用價(jià)值。非病毒載體中,聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)類陽離子聚合物的體外基因轉(zhuǎn)染效率是最高的。PEI的正電荷含量較高,可以和帶負(fù)電荷的siRNA結(jié)合,并且通過“質(zhì)子海綿效應(yīng)”使PEI/siRNA復(fù)合物逃逸溶酶體降解[12-13]。然而,PEI高陽離子電荷密度也造成了細(xì)胞毒性的增大。為了降低細(xì)胞毒性,我們把PEI和聚乙二醇[poly(ethylene glycol),PEG]通過二硫鍵(-SS-)連接。PEG修飾降低了細(xì)胞毒性并增強(qiáng)了靜脈應(yīng)用時(shí)的血清中穩(wěn)定性,而二硫鍵使PEI-siRNA可以敏感地在細(xì)胞胞漿中的高谷胱甘肽環(huán)境中釋放。葉酸(folic acid,F(xiàn)A)可以與過表達(dá)于多數(shù)腫瘤表面的FR結(jié)合[14-15],增加內(nèi)吞作用介導(dǎo)的細(xì)胞攝入,因此,F(xiàn)A可以作為FR過表達(dá)的腫瘤的理想特異靶向配體。超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide,SPIO)Fe3O4是磁共振(magnetic resonance,MR)成像T2加權(quán)增強(qiáng)造影劑,可以使基因載體具備MR成像的功能,有助于監(jiān)控藥物體內(nèi)循環(huán)分布,并增強(qiáng)病灶的MR成像對比度。本研究通過復(fù)合FA、PEG、PEI和SPIO構(gòu)建FA-PEG-SS-PEI-SPION,形成多功能基因載體納米顆粒,又通過載siRNA阻斷胃癌PD-L1表達(dá),使之具備潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

    材 料 和 方 法

    1 材料和試劑

    大部分化學(xué)材料,如PEI (25 kD)、單甲氧基PEG (mPEG-OH, 2 kD)、丁二(酸)酐、二環(huán)己基碳二亞胺(N,N’-dicyclohexylcarbodiimide,DCC)和N-羥基丁二酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)購自Sigma-Aldrich。平均測量直徑為6 nm的疏水SPION 根據(jù)前述的方法合成[16]。α-羥基-ε-氨基-聚乙二醇(HO-PEG-NH2;Mn=3.6 kD,Mw/Mn=1.3)根據(jù)前述的方法制備[17]。 PD-L1和對照siRNA(scrambled siRNA,siSCR) 購自蘇州吉瑪基因公司。siRNA的序列如下:siRNA-1的正義鏈為5’-GGAUCCAGUCACCUCUGAATT-3’,反義鏈為5’-UUCAGAGGUGAC-UGGAUCCTT-3’;siRNA-2的正義鏈為5’-CCAGCACACUGAGAAUCAATT-3’,反義鏈為5’-UUGAUUCUCAGUGU GCUGGTT-3’;siRNA-3的正義鏈為5’-GGCACAUCCUCCAAAUGAATT-3’,反義鏈為5’-UUCAUUUGGAGGAUGUGCCTT-3’;siRNA-4的正義鏈為5’-GGAGAAUGAUGGAUGUGAATT-3’,反義鏈為5’-UUCACAUCCAUCAUUCUCCTT-3’;scrambled siRNA的正義鏈為 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’, 反義鏈為 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。qPCR 引物購自北京六合華大。 PD-L1的正義鏈為5’- GTGGCATCCAAGATACAAACTCAA-3’,反義鏈為 5’- TCCTTCCTCTTGTCACGCTCA-3’; GAPDH的正義鏈為5’-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3’,反義鏈為5’-GGGTCATTGATGGCAACAATATC-3’。人胃癌細(xì)胞系SGC-7901 來自上海生物化學(xué)與細(xì)胞研究所,培養(yǎng)于無葉酸 RPMI-1640,并添加10%胎牛血清和5% L-谷氨酰胺-盤尼西林-鏈霉素溶液 (Sigma-Aldrich)。

    2 多功能納米多聚復(fù)合物的合成及制備

    2.1基因納米載體的合成 FA-PEG-SS-PEI 聚合物的合成和活化方法見前述[18]。為了讓葉酸和HO-PEG-NH2共軛[19],先把葉酸溶解于無水DMSO (20 mL)。然后加入NHS和DCC 并且在室溫下攪拌過夜。在氬氣環(huán)境下,混合物使用0.22 μm過濾器過濾以去除副產(chǎn)物1,3-二環(huán)己基脲(1,3-dicyclohexylurea,DCU),并和含TEA (pH 8.0)的HO-PEG-NH2DMSO溶液室溫下反應(yīng)24 h,用去離子水滲析(截留分子量為1 kD)、低壓凍干。然后把3-(2-羧基-乙基丙基二硫醚)-丙酸、NHS和二甲氨基吡啶溶解于無水DMSO(20 mL),室溫下攪拌過夜。加入FA-PEG-OH 并反應(yīng)24 h?;旌衔镌俅螌θルx子水滲析(截留分子量為1 kD), 并低壓凍干。最后,上述產(chǎn)物、NHS和DCC都用無水DMSO (20 mL)溶解并在室溫下攪拌過夜。然后,混合物用0.22 μm 過濾器過濾,去除副產(chǎn)物DCU。把超支化PEI加入混合物室溫反應(yīng)24 h以生成FA-PEG-SS-PEI產(chǎn)物?;旌衔镌谡麴s水中用膜透析(MWCO: 14 kD)純化3 d并低壓凍干。非靶向mPEG-SS-PEI以相同的方法合成。

    2.2mPEG-SS-PEI-SPION/FA-PEG-SS-PEI-SPION的合成 mPEG-SS-PEI/FA-PEG-SS-PEI 包裹的SPIO納米顆粒載體可通過配體交換的方法合成[20]。mPEG-SS-PEI/FA-PEG-SS-PEI (200 mg)溶解于2 mL的三氯甲烷,然后SPIO (10 mg)被分散到上述溶液中?;旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜反應(yīng),然后沉淀成大量的正己烷。沉淀用離心的方法收集并用正己烷洗滌2次、真空干燥,以去除有機(jī)溶劑。如上制備的產(chǎn)物在超聲下分散于雙蒸水并使用220 nm的過濾膜清除濾過較大的沉淀。

    2.3制備復(fù)合siRNA的陽離子膠束 RNA (4 mg)和適量的納米載體分別溶解于PBS。2種溶液用移液器混勻,然后放置室溫60 min復(fù)合。N/P比是納米載體中的氮原子數(shù)與siRNA中的磷原子數(shù)之比。復(fù)合siRNA的納米載體的量是由N/P比決定的。

    3 主要實(shí)驗(yàn)方法

    3.1粒徑大小和Zeta電位的測量 PD-L1 siRNA 和經(jīng)修飾的PEI在無RNA酶的水中通過把稀釋的siRNA溶液和聚合物溶液混合,以不同的N/P復(fù)合?;旌衔镌谑覝叵路跤? h,而后用無RNA酶水稀釋到1 mL。粒徑大小和zeta電位使用帶He-Ne激光的 Zetasizer Nano (Malvern Instruments),通過動(dòng)態(tài)光散射的方法測定。散射光在氣溫25 ℃、以90°成角檢測。測量重復(fù)3次。

    3.2凝膠阻滯電泳 siRNA和FA-PEG-SS-PEI-SPION或PEG-SS-PEI-SPION的結(jié)合能力可以通過瓊脂糖凝膠電泳來確定。把PEG-SS-PEI-SPION 或FA-PEG-SS-PEI-SPION和人scrambled siRNA以不同N/P與去離子無RNA酶水混合,產(chǎn)生 PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA復(fù)合物。每個(gè)樣的siRNA量設(shè)定為10 pmol?;旌衔镌谑覝胤跤? h使聚合物完全復(fù)合。然后,聚合物與6× agarose gel loading buffer 混合,上樣到1% 瓊脂糖凝膠中并在TBE緩沖液、100 V電壓下電泳20 min。siRNA條帶用紫外光成像系統(tǒng)(Bio-Tanon)觀察。

    3.3聚合物的細(xì)胞毒性檢測 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)使用MTS分析(購自Promega)。SGC-7901細(xì)胞以每孔5.0×103種于96孔板過夜,并用前述形成的聚合物/siRNA處理。72 h后,細(xì)胞在含MTS溶液的培養(yǎng)基中37 °C孵育3.5 h。酶標(biāo)儀(Bio-Rad)于490 nm處于讀取吸光度(A490)。相對細(xì)胞存活率(%)=(樣品A490-空白A490)/(對照A490-空白A490) × 100%。每個(gè)N/P比值獨(dú)立重復(fù)3次。

    3.4流式細(xì)胞術(shù) SGC-7901細(xì)胞以每孔2×105的密度種在6孔板上。聚合物/FAM共軛的scrambled siRNA(siSCR-FAM)以不同的N/P復(fù)合并以100 pmol siRNA每孔的數(shù)量加進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)液中。經(jīng)過4 h孵育,轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液棄去,細(xì)胞使用PBS洗滌,并用FACSVerseTM流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson)分析。FAM陽性的細(xì)胞占收集的比例代表了轉(zhuǎn)染率的大小,F(xiàn)AM的幾何平均吸光度代表了平均熒光指數(shù)(mean fluorecence index,MFI),間接表示細(xì)胞攝入的平均數(shù)量。獨(dú)立重復(fù)3次。

    3.5普魯士藍(lán)染色 FA-PEG-SS-PEI-SPION/PEG-SS-PEI-SPION多聚物含F(xiàn)e3O4并且可以在普魯士藍(lán)染色下觀察到。為了明確(FA-)PEG-SS-PEI-SPION/siRNA多聚復(fù)合物的細(xì)胞攝入,我們進(jìn)行了普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)。SGC-7901細(xì)胞使用0~40 mg/L鐵濃度的FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR復(fù)合物轉(zhuǎn)染處理4 h;去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基,洗滌細(xì)胞并用4%多聚甲醛在室溫下固定10 min;細(xì)胞再次用PBS洗滌3次,并添加普魯士藍(lán)染色液;經(jīng)過30 min室溫下孵育,細(xì)胞用PBS洗滌3次并且在倒置顯微鏡下觀察。

    3.6體外MR成像 為了證明聚合物載體復(fù)合了SPIO并具備MR增強(qiáng)造影能力和具有增強(qiáng)MR診斷靈敏度的應(yīng)用潛力,我們進(jìn)行了SGC-7901細(xì)胞的體外MR成像。SGC-7901細(xì)胞以每孔2×105的密度接種于6孔板培養(yǎng)過夜并且分別使用0、5、10、20和40 mg/L鐵濃度的PEG-SS-PEI-SPION/siRNA或FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA處理。轉(zhuǎn)染后4 h,收集SGC-7901細(xì)胞并且用PBS洗滌3次。離心后,細(xì)胞使用500 μL 1% 瓊脂糖/PBS 溶液重懸并轉(zhuǎn)移到96孔板,待溶液冷卻,使細(xì)胞分散固定于孔板上凝固的瓊脂糖。接著,在室溫下使用帶11 cm環(huán)形線圈的Intera 1.5T MRI System (Philips)進(jìn)行體外MR掃描成像。

    3.7RT-qPCR實(shí)驗(yàn) SGC-7901細(xì)胞的種板和轉(zhuǎn)染方法如前所述。RNA的提取、純化和逆轉(zhuǎn)錄成cDNA使用RNAiso Plus Kit和 PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa),并根據(jù)廠商的說明操作。qPCR使用SYBR? Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑操作,并且在CFX96 Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad)分析。數(shù)據(jù)分析方法使用2-ΔΔCt法。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

    3.8Western blot實(shí)驗(yàn) SGC-7901細(xì)胞以每孔2×105種于6孔板,并且轉(zhuǎn)染siRNA的方法同前所述。3 d后收集并用RIPA lysis buffer (Santa Cruz)裂解細(xì)胞,提取蛋白。蛋白樣品在12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上電泳濃縮分離,并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上,使用化學(xué)發(fā)光法曝光。在實(shí)驗(yàn)中使用了單克隆兔PD-L1抗體(Abcam)和多克隆兔β-tubulin抗體(CST)。

    3.9SGC-7901/活化T細(xì)胞共培養(yǎng)模型的建立 健康人的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)使用淋巴細(xì)胞梯度密度離心法(Sigma-Aldrich)分離。PBMCs以每孔2×105種于96孔板并用anti-CD3e (10 g/L)和 anti-CD28 (2 g/L)(eBioscience)刺激T細(xì)胞活化72 h。SGC-7901細(xì)胞使用FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA-2或FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR預(yù)處理4 h,3 d后收集并將純化活化的T細(xì)胞與SGC-7901細(xì)胞以10∶1的比例共培養(yǎng)48 h。收集共培養(yǎng)上清液,并用ELISA的方法檢測TNF-α、IFN-γ和IL-10的表達(dá)量。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    數(shù)據(jù)應(yīng)用 SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析,結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示,均數(shù)比較采用非配對的t檢驗(yàn)和方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA 表征檢測

    如圖1,隨著N/P比值的上升,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA復(fù)合物的zeta電位大小從N/P=5時(shí)的(3.12±0.50) mV逐漸上升,siRNA的復(fù)合更加完全,N/P=20時(shí)zeta電位達(dá)到(15.34±0.90) mV。N/P=1時(shí)復(fù)合物的粒徑為(195.4±2.0) nm,隨著N/P比值升高,粒徑逐漸減小,在較大N/P比值時(shí)達(dá)到約120 nm左右。N/P=10時(shí),復(fù)合物的平均直徑達(dá)到了(116.7±2.5) nm。納米載體的粒徑小于200 nm,能有效地穿透細(xì)胞膜被細(xì)胞攝取,并且適當(dāng)?shù)恼娢惶崾緎iRNA的負(fù)電荷被中和,使得復(fù)合物能在不破壞細(xì)胞膜完整性的情況下被細(xì)胞內(nèi)吞。

    2 凝膠阻滯電泳

    如圖2,N/P比值為1時(shí), siRNA電泳條帶相比裸siRNA對照暗,這表明了多聚物與部分siRNA的結(jié)合。隨著N/P比值的逐漸增大,siRNA電泳條帶逐漸變暗。當(dāng)N/P為4或5時(shí),無FA的非靶向組siRNA條帶較暗,此時(shí)siRNA結(jié)合程度比FA靶向組高;當(dāng)N/P為10或者以上的時(shí)候,2組siRNA電泳條帶都幾乎消失,表示此時(shí)多聚物完全結(jié)合了siRNA。

    Figure 1. The characterization of the FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA. Zeta potential and particle size of FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA at variousN/Pratios. Mean±SEM.n=3.

    圖1FA-PEG-SS-PEI-SPION的表征

    Figure 2. siRNA binding of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Agarose gel electrophoresis of PEG-SS-PEI-SPION/siRNA (A) and FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA (B) at variousN/Pratios. Na: naked siRNA.

    圖2PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION與siRNA的結(jié)合能力

    3 復(fù)合物的細(xì)胞毒性

    如圖 3所示,N/P為10的時(shí)候,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和PEG-SS-PEI-SPION/siRNA 復(fù)合物處理組的細(xì)胞存活率分別為(95.08±2.24)%和(94.47±2.04)%。隨著N/P比值的升高,納米多聚復(fù)合物的毒性逐漸增大。當(dāng)N/P比值等于或低于20時(shí),SGC-7901的72 h存活率比脂質(zhì)體復(fù)合物處理對照要高。此外,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA和PEG-SS-PEI-SPION/siRNA細(xì)胞毒性的差異并沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,這表示靶向的葉酸修飾具有良好的生物相容性和低毒性。

    Figure 3. The cytotoxicity of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Mean±SEM.n=3.

    圖3PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION的細(xì)胞毒性

    4 轉(zhuǎn)染效率

    當(dāng)N/P比值為4和6時(shí),由于siRNA還未完全結(jié)合, FA-PEG-SS-PEI-SPION的轉(zhuǎn)染率和MFI分別都比PEG-SS-PEI-SPION要低(P<0.05)。當(dāng)N/P比值升高到10時(shí),siRNA已經(jīng)完全結(jié)合,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION的轉(zhuǎn)染率達(dá)到95.06%±0.44%,和PEG-SS-PEI-SPION (93.88%±1.05%)比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性,并且擁有更高的MFI(P<0.05),提示細(xì)胞攝入聚合物的平均數(shù)量更多。這表明FA共軛修飾促進(jìn)了細(xì)胞的聚合物攝入,F(xiàn)A修飾的靶向組聚合物理論上擁有比非靶向聚合物更高的轉(zhuǎn)染效率,見圖4。

    5 聚合物的細(xì)胞攝入

    聚合物中的SPIO成分含鐵離子,使用普魯士藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)可以顯示納米聚合物的細(xì)胞攝入。隨著聚合物鐵濃度的上升,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR處理組SGC-7901細(xì)胞的胞漿里可見逐漸增多的藍(lán)染顆粒。此外,使用激光共聚焦顯微鏡可以觀察細(xì)胞對復(fù)合物的攝入。相比PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM處理,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM處理的細(xì)胞胞漿內(nèi)可見更多的綠色熒光。這提示FA-PEG-SS-PEI-SPION可以傳遞更多的siRNA進(jìn)入SGC-7901細(xì)胞,并且可能具有更高的PD-L1下調(diào)效力,見圖5。

    Figure 4. Transfection efficiency of PEG-SS-PEI-SPION and FA-PEG-SS-PEI-SPION. Transfection efficiency (A) and mean fluorescence index (B) of PEG-SS-PEI-SPION/siRNA, FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA and Lipofectamine/siRNA. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsPEG-SS-PEI-SPION at the sameN/Pratio.

    圖4PEG-SS-PEI-SPION和FA-PEG-SS-PEI-SPION的轉(zhuǎn)染效率

    6 體外MR成像

    為了驗(yàn)證聚合物載體的MR增強(qiáng)造影能力,使用不同鐵濃度的聚合物轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞并進(jìn)行體外MR成像實(shí)驗(yàn)。非靶向組處理和靶向組處理的細(xì)胞T2信號都隨著處理濃度升高而降低。2組T2值都隨著處理濃度升高而降低,F(xiàn)A-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR靶向組的降低幅度更高(P<0.01),見圖6。

    7 PD-L1的下調(diào)

    為平衡低細(xì)胞毒性和高轉(zhuǎn)染率,我們采用了N/P=10來復(fù)合siRNA和納米載體。在4條PD-L1 siRNA序列中,荷載siRNA-1和siRNA-2聚合物處理組的PD-L1 mRNA相對表達(dá)量分別為23.47%±4.59%和9.07%±0.79%。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SGC-7901細(xì)胞上的PD-L1蛋白表達(dá)水平變化和mRNA水平的變化是一致的。與對照組相比,荷載siRNA-1和siRNA-2處理組PD-L1的表達(dá)水平均顯著減少,其中荷載siRNA-2處理組具有最顯著的下調(diào)PD-L1蛋白表達(dá)水平的效果。SGC-7901細(xì)胞的PD-L1蛋白水平能在處理3 d后顯著下降,并且持續(xù)到至少轉(zhuǎn)染后的第6天,見圖7。

    Figure 5. The cellular internalization of FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA polyplex. A: Prussian blue staining of the SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR at Fe concentrations of 10, 20 and 40 mg/L (×200); B: confocal images of SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM and PEG-SS-PEI-SPION/siSCR-FAM. PP: PEG-SS-PEI-SPION; FP: FA-PEG-SS-PEI-SPION; siSCR-FAM: scrambled siRNA conjugated with FAM.

    圖5FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA多聚復(fù)合物的細(xì)胞攝入

    8 對T細(xì)胞功能的影響

    為了確定聚合物荷載siRNA是否通過抑制PD-L1表達(dá)來影響T細(xì)胞功能,我們建立了SGC-7901/活化T細(xì)胞共培養(yǎng)模型。如圖8,ELISA實(shí)驗(yàn)顯示T細(xì)胞與FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA預(yù)處理的SGC-7901細(xì)胞共培養(yǎng)后IFN-γ 和TNF-α水平顯著增加,而IL-10水平顯著下降。

    討 論

    PD-L1作為進(jìn)展期胃癌的潛在治療靶點(diǎn),已經(jīng)被證明是有效的預(yù)后生物標(biāo)志物,而且它的多克隆抗體應(yīng)用已進(jìn)行到Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段(NCT02625623和NCT02625610)。阻斷PD-1/PD-L1相互作用的多克隆抗體已經(jīng)被批準(zhǔn)應(yīng)用于進(jìn)展期黑色素瘤和轉(zhuǎn)移性非小細(xì)胞肺癌。對于進(jìn)展期胃癌,早前的多個(gè)臨床試驗(yàn)已經(jīng)證明了多克隆抗體的安全性和有效性[21-22]。然而,PD-L1并不只在腫瘤細(xì)胞上表達(dá),而是廣泛表達(dá)于造血細(xì)胞和非造血細(xì)胞上[23-24],并且PD-1/PD-L1和B7-1/PD-L1 等作用在調(diào)節(jié)效應(yīng)T細(xì)胞功能和限制自身免疫反應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用。非靶向的阻斷以上相互作用可能導(dǎo)致除治療效應(yīng)外的相關(guān)的不良反應(yīng),并且相關(guān)機(jī)制仍未完全揭示[25-26]。為了探索更高效特異的PD-1/PD-L1阻斷方法,本實(shí)驗(yàn)通過化學(xué)修飾陽離子聚合物納米載體來實(shí)現(xiàn)對PD-L1的干擾。

    RNA干擾可引起相應(yīng)的mRNA被酶降解,是一種特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制。通過這種機(jī)制,含21~25個(gè)堿基對的siRNA,可以特異性地沉默基因的表達(dá)。使用siRNA治療手段阻斷PD-1/PD-L1相互作用的方法安全且易于獲得。目前使用siRNA基因治療的障礙在于裸siRNA容易被環(huán)境中的核酸酶降解、被細(xì)胞內(nèi)溶酶體降解,siRNA所帶的負(fù)電荷和細(xì)胞膜的排斥作用使得siRNA難以穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞,并且在人體應(yīng)用還存在腎臟排出和藥物是否集聚于靶標(biāo)腫瘤部位等問題。

    由于陽離子聚合物作為基因載體的高轉(zhuǎn)染效率,PEI及其衍生物被廣泛運(yùn)用于基因運(yùn)載[27-28]。然而,作為治療用的基因運(yùn)載工具,未經(jīng)修飾的PEI具有顯著的細(xì)胞毒性,這嚴(yán)重限制了它在治療上的進(jìn)一步運(yùn)用。為了減少細(xì)胞毒性,我們使用PEG修飾,

    Figure 6.InvitroMR imaging of SGC-7901 cells. A: T2-map of SGC-7901 cells treated with PP/siSCR or FP/siSCR at Fe concentrations of 0, 5, 10, 20 and 40 mg/L; B: comparison of the corresponding T2values. PP: PEG-SS-PEI-SPION; FP: FA-PEG-SS-PEI-SPION; siSCR: scrambled siRNA. Mean±SEM.n=3.

    圖6體外細(xì)胞MR成像

    Figure 7. The effect of PD-L1 knockdown on the expression of PD-L1 at mRNA and protein levels in the SGC-7901 cells. A: the mRNA levels of PD-L1 in the SGC-7901 cells treated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA; B: the protein expression of PD-L1 in the SGC-7901 cells 72 h after transfection determined by Western blot; C: the protein expression of PD-L1 in the SGC-7901 cells at day 1 (D1) to day 6 (D6) after transfection determined by Western blot. Mean±SEM.n=3.

    圖7SGC-7901細(xì)胞中PD-L1的下調(diào)效應(yīng)

    Figure 8. The IFN-γ (A), TNF-α (B) and IL-10 (C) levels in the culture medium of the cocultured T cells. T-cell alone: activated T cells without coculturing; SGC-7901: SGC-7901 cells pretreated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siSCR; treated SGC-7901: SGC-7901 cells pretreated with FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA-2. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsT-cell/SGC-7901.

    圖8共培養(yǎng)T細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌

    形成聚合物的親水外層,作為對表面陽離子的保護(hù)屏障,通過抑制與血液成分和細(xì)胞外基質(zhì)的非特異結(jié)合來穩(wěn)定聚合物[13]。經(jīng)過PEG修飾,聚合物細(xì)胞毒性較低,而同時(shí)具有高轉(zhuǎn)染效率。為了增強(qiáng)聚合物的靶向性,我們在基因傳遞載體中引進(jìn)了FA基團(tuán),以此來增強(qiáng)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用。葉酸受體廣泛表達(dá)于一系列腫瘤上,因此葉酸FA可以被用作靶向基團(tuán),并且可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對聚合物的攝取。

    由于其磁特性和生物可降解性,SPION被廣泛運(yùn)用于磁性靶向和腫瘤診療中的磁共振增強(qiáng)影像[29-30]。SPIO可以通過配體交換等方法和PEI形成聚合物膠束。而通過和帶陽離子的聚合物PEI的靜電結(jié)合,帶負(fù)電荷的核酸可以同時(shí)共軛于磁性納米顆粒。這個(gè)PEI及其修飾衍生物的特性,使siRNA和SPION的不同特性可以結(jié)合于一體,并同時(shí)具有靶點(diǎn)基因沉默和磁共振顯像增強(qiáng)的功能。總之,聯(lián)合傳遞siRNA和SPIO納米顆粒到腫瘤位點(diǎn)可以增強(qiáng)治療效應(yīng),減少非靶向不良反應(yīng)并且增強(qiáng)T2成像的對比度。這使我們可以觀察納米藥物的生物學(xué)分布并且以此預(yù)測治療的效果,無創(chuàng)性地監(jiān)控腫瘤的進(jìn)展。本課題組結(jié)合以上特點(diǎn)構(gòu)建FA-PEG-SS-PEI-SPION納米聚合物載體并用實(shí)驗(yàn)表明細(xì)胞上PD-L1表達(dá)水平在FA-PEG-SS-PEI-SPION/siRNA-2處理后顯著下調(diào),阻斷了癌細(xì)胞和T細(xì)胞的PD-1/PD-L1作用。

    PD-1主要表達(dá)在活化的淋巴細(xì)胞表面,而PD-L1則主要表達(dá)在許多腫瘤細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等表面。作為活化T細(xì)胞上表達(dá)的共抑制受體,PD-1與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1相互結(jié)合,抑制T細(xì)胞的增殖和遷移,減少細(xì)胞毒作用介質(zhì)的釋放,最終抑制淋巴細(xì)胞對腫瘤的殺傷功能[31]。作為活化T細(xì)胞上表達(dá)的共抑制受體,PD-1與腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的PD-L1相互作用。為了探究在聚合物/ PD-L1 siRNA處理下的T細(xì)胞功能改變,我們建立了SGC-7901/活化T細(xì)胞的共培養(yǎng)模型。細(xì)胞因子的水平可以反映T細(xì)胞功能狀態(tài)和免疫微環(huán)境的狀態(tài)。IFN-γ具有調(diào)節(jié)免疫的功能,TNF-α具有誘導(dǎo)殺傷腫瘤細(xì)胞的功能,均可由浸潤C(jī)D8+T細(xì)胞分泌,并刺激腫瘤細(xì)胞表面的PD-L1表達(dá)[32],參與腫瘤免疫應(yīng)答。由T細(xì)胞分泌的IL-10是一種起免疫抑制作用的細(xì)胞因子,它可以由PD-L1刺激生成[33-34]。共培養(yǎng)模型中以上細(xì)胞因子水平的改變提示有效地阻斷了PD-1/PD-L1相互作用并增強(qiáng)細(xì)胞毒性T細(xì)胞的功能。

    本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建并且描述了FA-PEG-SS-PEI-SPION聚合物的特征,并且成功地把PD-L1 siRNA輸送入SGC-7901細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)證明了FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA復(fù)合物的MR增強(qiáng)造影成像能力和下調(diào)PD-L1表達(dá)的能力,納米聚合物輸送PD-L1 siRNA可以阻斷PD-1/PD-L1作用進(jìn)而調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能。因此FA-PEG-SS-PEI-SPION/PD-L1 siRNA納米多聚復(fù)合物對胃癌的免疫治療具有非常大的潛能,本項(xiàng)目可以在下一步開展更多體外及體內(nèi)功能實(shí)驗(yàn)以闡明此多聚復(fù)合物的應(yīng)用前景。

    (致謝:誠摯感謝中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院放射科沈君教授和中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院張路博士為本實(shí)驗(yàn)提供的技術(shù)幫助和指導(dǎo)。)

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    Using folic acid-modified polyethylenimine-SPIO nanoparticles for PD-L1 siRNA delivery to target gastric cancer

    LUO Xin1, PENG Xia1, CHEN Guang-cheng1, HOU Jing-ying2, WU Shu-yun3, WANG Ling-yun1

    (1DepartmentofGastroenterology,2DepartmentofEmergencyMedicine,SunYat-senMemorialHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China;3DepartmentofThoracicSurgery,SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou510060,China.E-mail:xzr020@aliyun.com)

    AIM: To synthesis and characterize a multi-functional siRNA delivery agent with effective therapeutic effects and MR-tracing ability for programmed death ligand-1 (PD-L1) positive gastric cancer SGC-7901 cell line.METHODSThe characterization, binding ability, cytotoxicity, transfection efficiency and cellular internalization of the polyplex were determined. The PD-L1 knockdown effect was analyzed, and cytokines secreted by cocultured T cells were measured.RESULTSWe developed folic acid (FA)-PEG-SS-PEI-SPION as siRNA delivery agent for PD-L1 knockdown. AtN/Pratio of 10, the FA-PEG-SS-PEI-SPION bound PD-L1 siRNA to form polyplex in a diameter of (116.7±2.5) nm with zeta potential of (9.14±0.80) mV. Transfection efficiency of the targeted polyplex was (95.06±0.44)%, compared with (93.87±1.05)% of the untargeted polyplex. Mean fluorescence intensity of the targeted polyplex was 1 892.67±81.51, significantly higher than 1 324.33±186.58 of the untargeted. The cellular magnetic resonance (MR) imaging showed the polyplex also acted as T2weighted contrast agent for cancer MR imaging. The relative mRNA level of PD-L1 in polymer/siRNA-2 treatment group was (9.07±0.79)%. Decreased protein expression of PD-L1 was showed by Western blot. The secretion levels of IFN-γ and TNF-α in cocultured T cells increased, while that of IL-10 decreased.CONCLUSIONOur findings highlighted the potential of the multifunctional theranostic nanoparticles for effective targeting PD-L1 knockdown therapy and MR imaging diagnosis in gastric cancers.

    Programmed death ligand-1; Gastric cancer; Folic acid; Magnetic resonance imaging; siRNA

    1000- 4718(2017)12- 2179- 09

    2017- 03- 03

    2017- 04- 17

    廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 201704020121)

    △通訊作者 Tel: 020-81332489; E-mail: xzr020@aliyun.com

    R730.23; R735.2

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.011

    (責(zé)任編輯: 陳妙玲, 羅 森)

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