胰腺癌細(xì)胞外泌體通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑促進(jìn)β細(xì)胞凋亡*

崔連鷙， 王 博， 張曉偉， 孫洪帥， 吳雪峰△

(1吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科， 吉林 長(zhǎng)春 130061； 2吉林省疾病預(yù)防控制中心理化所， 吉林 長(zhǎng)春 130062)

胰腺癌細(xì)胞外泌體通過(guò)激活線(xiàn)粒體凋亡途徑促進(jìn)β細(xì)胞凋亡*

崔連鷙1， 王 博2， 張曉偉1， 孫洪帥1， 吳雪峰1△

(1吉林省腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科， 吉林 長(zhǎng)春 130061；2吉林省疾病預(yù)防控制中心理化所， 吉林 長(zhǎng)春 130062)

目的探討胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體(exosome)對(duì)胰島β細(xì)胞存活率和功能的影響及作用機(jī)制。方法采用外泌體提取試劑盒提取小鼠胰腺癌細(xì)胞Pan02和MPC-83上清液外泌體，經(jīng)磷鎢酸染色后于透射電鏡下鑒定形態(tài)；外泌體經(jīng)熒光標(biāo)記后與小鼠胰島瘤MIN6細(xì)胞共孵育48 h，檢測(cè)外泌體分泌水平和MIN6細(xì)胞的攝取水平；MTT和葡萄糖刺激的胰島素分泌(GSIS)實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)各組細(xì)胞的存活率和胰島素分泌功能；qPCR檢測(cè)微小RNA-204(miR-204)和Bcl-2 mRNA的表達(dá)；Western blot檢測(cè)線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3和細(xì)胞色素C(Cyt-C)的表達(dá)。結(jié)果透射電鏡結(jié)果顯示2種胰腺癌細(xì)胞均能分泌外泌體，且Pan02 細(xì)胞分泌更多。熒光標(biāo)記的外泌體與胰島β細(xì)胞共孵育結(jié)果顯示，β細(xì)胞能夠大量攝取胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體。MTT和GSIS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，外泌體處理組的MIN6細(xì)胞存活率和高糖刺激的胰島素分泌量顯著低于未處理組(P<0.01)。qPCR結(jié)果顯示胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體富含miR-204， 且外泌體處理后的MIN6細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)。Western blot結(jié)果顯示，外泌體處理的MIN6細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)，Bax、cleaved caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.01)。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞能夠分泌外泌體，且該外泌體能夠被胰島β細(xì)胞攝取。胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體可以降低β細(xì)胞存活率和β細(xì)胞胰島素的分泌功能，其機(jī)制可能通過(guò)外源性上調(diào)β細(xì)胞內(nèi)miR-204的表達(dá)，進(jìn)而抑制Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，最終激活β細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體凋亡信號(hào)通路。

外泌體； 胰腺癌； 微小RNA-204； Bcl-2； 細(xì)胞凋亡

胰腺癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病部位隱蔽，且轉(zhuǎn)移迅速，多于晚期才確診患病。有研究表明85%的胰腺癌患者伴有高血糖或糖尿病，而這些胰腺癌伴行糖尿病病例中56.1%的患者糖尿病病程小于2年，因此推斷胰腺癌細(xì)胞對(duì)于胰腺癌患者新生糖尿病的發(fā)生發(fā)展具有重要作用[1-2]。胰島素分泌不足是2型糖尿病的重要病理基礎(chǔ)，隨著糖尿病病程加重，胰島β細(xì)胞大量凋亡且分泌功能進(jìn)一步下降，因此，探討胰腺癌細(xì)胞引起胰島β細(xì)胞凋亡及功能障礙的作用機(jī)制對(duì)于胰腺癌誘發(fā)的新生糖尿病診療具有重要意義。微小RNA(microRNA， miRNA， miR)是一類(lèi)長(zhǎng)約19～23個(gè)核苷酸的小分子單鏈RNA，它可以通過(guò)與下游靶mRNA 3’ UTR相結(jié)合，對(duì)mRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。近年來(lái)有研究表明，miRNA能夠以外泌體(exosome)的形式穩(wěn)定存在于各種體液中，并且可以通過(guò)自分泌或旁分泌被靶細(xì)胞所攝取，而腫瘤細(xì)胞相較于正常細(xì)胞能夠分泌更多的外泌體，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[3]。miR-204是胰腺組織細(xì)胞內(nèi)高度富集的miRNA，與胰島β細(xì)胞功能密切相關(guān)[4]。有研究表明，在β細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-204會(huì)促進(jìn)β細(xì)胞凋亡，而胰腺癌組織局部常伴有β細(xì)胞功能和數(shù)目的下降[5-6]。本研究擬探討胰腺癌細(xì)胞是否能夠分泌大量含miR-204的外泌體，進(jìn)一步證實(shí)該外泌體是否能夠被胰島β細(xì)胞所攝取并引起β細(xì)胞凋亡，并探究其可能分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

外泌體提取試劑盒(ExoQuick-TC kit)和外泌體熒光標(biāo)記Exo-Red購(gòu)自SBI；Lipofectamine 2000、microRNA和Trizol 購(gòu)自Invitrogen；RPMI-1640培養(yǎng)基、 DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco；β-巰基乙醇和MTT購(gòu)自Sigma；抗Bcl-2抗體購(gòu)于Santa Cruz；抗Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、caspase-3、CD63和細(xì)胞色素C(cytochrome C，Cyt-C)抗體購(gòu)于Abcam；BCA蛋白定量分析試劑盒和ECL顯影試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific;其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。所用引物由上海生工技術(shù)有限公司根據(jù)設(shè)計(jì)合成，序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

2 方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠胰腺癌細(xì)胞Pan02和MPC-83及小鼠胰島瘤細(xì)胞MIN6購(gòu)于ATCC。Pan02和MPC-83細(xì)胞采用RPMI-1640培養(yǎng)基加10%胎牛血清培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱。MIN6細(xì)胞采用含0.01% β-巰基乙醇的高糖DMEM培養(yǎng)基加10%胎牛血清中培養(yǎng)。至細(xì)胞長(zhǎng)至80%開(kāi)始鋪板實(shí)驗(yàn)。

2.2外泌體提取及熒光標(biāo)記 Pan02和MPC-83細(xì)胞以每孔1×105的密度接種于6孔板，貼壁過(guò)夜后，更換去外泌體血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每3個(gè)復(fù)孔上清液合并收集5 mL，并采用ExoQuick-TC試劑盒提取上清液外泌體。提取的上清液外泌體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將PBS溶解的外泌體與Exo-Red按體積比10∶1比例混合，并于37 ℃孵育10 min，加入100 μL終止液終止反應(yīng)，4 ℃繼續(xù)孵育30 min，后14 000 r/min離心3 min，用200 μL PBS重懸熒光標(biāo)記的外泌體。將熒光標(biāo)記的外泌體與24孔板內(nèi)接種的MIN6細(xì)胞共孵育48 h(Exo-Trans組)，孵育結(jié)束后熒光顯微鏡下檢測(cè)各組細(xì)胞熒光強(qiáng)度。

2.3外泌體的電鏡鑒定 銅網(wǎng)上滴加30 μL外泌體，靜止1 min后，濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加30 μL磷鎢酸溶液(pH 6.8)，室溫復(fù)染5 min，白熾燈烤干，透射電鏡下拍照。

2.4外泌體總RNA和總蛋白提取 取200 μL濃縮的外泌體，采用microRNA提取試劑盒，根據(jù)說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行總RNA的提取，提取的RNA進(jìn)一步用于miR-204含量檢測(cè)；取200 μL濃縮的外泌體14 000 r/min離心3 min后采用RIPA裂解液進(jìn)行總蛋白提取，4 ℃裂解15 min后14 000 r/min離心15 min，提取上清液進(jìn)行CD63蛋白含量檢測(cè)。

2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 MIN6細(xì)胞以每孔5×103的密度接種至96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜至完全貼壁后，對(duì)照(control)組每孔給予20 μL PBS處理，外泌體孵育(Exo-Trans)組每孔給予20 μL外泌體PBS混懸液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT(5.0 g/L)20 μL，置入細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h，每孔中板底甲瓚由200 μL DMSO復(fù)溶，于562 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各組吸光度(A)值。

2.6葡萄糖刺激的胰島素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)實(shí)驗(yàn) MIN6細(xì)胞以每孔5×103的密度接種至96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜至完全貼壁后，按照方法2.5中control組和Exo-Trans組處理?xiàng)l件繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，吸棄上清液，4 ℃的PBS清洗1次，更換無(wú)糖條件繼續(xù)孵育30 min，吸棄上清液。MIN6細(xì)胞繼續(xù)在分別含3和30 mmol/L葡萄糖的Krebs-Ringer緩沖液里孵育30 min。分別收集上清液和細(xì)胞蛋白，并按胰島素ELISA說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清胰島素含量。

2.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染 MIN6細(xì)胞以每孔2×104的密度接種至24孔板，培養(yǎng)過(guò)夜至完全貼壁后，根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組，按照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)推薦劑量，將miR-204(+)組轉(zhuǎn)染5 pmol/L miR-204 mimic，NC組轉(zhuǎn)染等量Lipofectamine 2000，并于無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基轉(zhuǎn)染5 h后更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)處理。

2.8qPCR實(shí)驗(yàn) 24孔板內(nèi)MIN6細(xì)胞按各組處理48 h后，采用Trizol法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)總RNA提取。根據(jù)Firststrand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。PCR采用羅氏公司的Fast Start Universal SYBR Green于ABI7300進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增，擴(kuò)增條件采用2步法，第1步為95 ℃ 10 min, 第2步循環(huán)40次：95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min。細(xì)胞內(nèi)miR-204采用U6作為內(nèi)參照，外泌體內(nèi)miR-204外參照采用miR-156a，mRNA采用GAPDH作為內(nèi)參照，引物序列見(jiàn)表1。

2.9Western blot實(shí)驗(yàn) 6孔板內(nèi)MIN6細(xì)胞按control組和Exo-Trans組分組處理48 h后，采用RIPA裂解液提取總蛋白。BCA蛋白定量后，采用30 μg蛋白上樣量于12%或15%分離膠下進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后采用濕法轉(zhuǎn)膜2 h，PVDF膜于室溫條件下5%脫脂牛奶封閉2 h，室溫條件下 I 抗封閉2 h，Ⅱ抗封閉1.5 h，孵育結(jié)束后于ECL化學(xué)發(fā)光顯影儀下顯影，采用Quantity One軟件進(jìn)行灰度值統(tǒng)計(jì)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，兩組間數(shù)據(jù)的比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 胰腺癌細(xì)胞Pan02和MPC83能夠分泌含miR-204的外泌體

透射電鏡下觀察到Pan02和MPC-83細(xì)胞的培養(yǎng)上清液中均含有外泌體，外泌體形狀為實(shí)心致密體，常見(jiàn)杯托狀，大小為50～200 nm不等，且Pan02細(xì)胞分泌的外泌體較MPC-83細(xì)胞更多，見(jiàn)圖1A。進(jìn)一步對(duì)外泌體表面標(biāo)志物CD63和外泌體內(nèi)miR-204進(jìn)行含量檢測(cè)，結(jié)果顯示Pan02細(xì)胞中CD63灰度值更高，且其外泌體內(nèi)含有更高含量的miR-204，約為MPC-83組的2倍(P<0.01)，因此我們采用Pan02胰腺癌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1B、C。

2 胰腺癌細(xì)胞分泌含miR-204的外泌體能夠被β細(xì)胞攝取

為了驗(yàn)證胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體能否被β細(xì)胞攝取，我們采用熒光標(biāo)記的Pan02細(xì)胞分泌的外泌體與MIN6細(xì)胞共孵育48 h，熒光顯微鏡下拍照，結(jié)果顯示Exo-Trans組出現(xiàn)明顯的紅色熒光，而對(duì)照組無(wú)熒光，見(jiàn)圖2。

3 富含miR-204的外泌體導(dǎo)致β細(xì)胞存活率和功能下降

為了探討胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)于β細(xì)胞存活率和功能的影響，我們檢測(cè)了control組和Exo-Trans組中MIN6細(xì)胞的細(xì)胞存活率和葡萄糖刺激的胰島素分泌。結(jié)果顯示，Exo-Trans組MIN6細(xì)胞存活率為control組的79%(P<0.01)，見(jiàn)圖3A；胰島素分泌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在30 mmol/L葡萄糖刺激下，control組和Exo-Trans組MIN6細(xì)胞胰島素分泌含量較3 mmol/L組均出現(xiàn)明顯升高(P<0.01)，而高糖刺激下的Exo-Trans組胰島素分泌量顯著低于control組，僅為Control組的49%(P<0.01)，見(jiàn)圖3B。

Figure 1. The extraction and identification of exosomes secreted by pancreatic cancer cells. A: the images of exosomes secreted by Pan02 cells and MPC-83 cells observed by transmission electron microscopy; B: the protein expression of CD63 in the exosomes secreted by Pan02 cells and MPC-83 cells; C: the expression of miR-204 in the exosomes secreted by Pan02 cells and MPC-83 cells. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsPan02.

圖1胰腺癌細(xì)胞外泌體的提取與鑒定

Figure 2. The fluorescence intensity of exosomes secreted by Pan02 cells in the MIN6 cells.

圖2MIN6細(xì)胞內(nèi)外泌體的熒光強(qiáng)度

Figure 3. The effects of exosomes secreted by Pan02 cells on the viability and function of MIN6 cells. A: the viability of the MIN6 cells with different treatments; B: insulin secretion determined by GSIS assay among each group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs3 mmol/L group;##P<0.01vscontrol group.

圖3胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體對(duì)β細(xì)胞存活率和功能的影響

4 miR-204互補(bǔ)抑制Bcl-2的mRNA表達(dá)

通過(guò)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)，我們?cè)赥argetScan等網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-204與Bcl-2互補(bǔ)程度高，見(jiàn)圖4A。對(duì)control組和Exo-Trans組MIN6細(xì)胞miR-204和Bcl-2 mRNA進(jìn)行檢測(cè)的結(jié)果顯示,與control組相比，Exo-Trans組的miR-204含量顯著增高(P<0.01)，而B(niǎo)cl-2的mRNA含量顯著降低(P<0.01)，見(jiàn)圖4B、C。為了進(jìn)一步明確miR-204能夠下調(diào)MIN6細(xì)胞內(nèi)Bcl-2的mRNA表達(dá)，我們?cè)贛IN6細(xì)胞上過(guò)表達(dá)miR-204，結(jié)果顯示miR-204(+)組的miR-204含量顯著高于NC組(P<0.01)，而B(niǎo)cl-2 mRNA表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.01)，見(jiàn)圖4D、E。

5 miR-204通過(guò)靶向抑制Bcl-2激活β細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡通路

我們進(jìn)一步檢測(cè)了control組和Exo-Trans組中Bcl-2、Bax、caspase-3和Cyt-C的蛋白水平。結(jié)果顯示,相較于control組，Exo-Trans組Bcl-2的蛋白表達(dá)下降，而B(niǎo)ax蛋白表達(dá)量升高(P<0.05)，Bcl-2/Bax比值下降，而cleaved caspase-3和Cyt-C的蛋白水平升高(P<0.05)，見(jiàn)圖5。

討 論

胰腺癌屬于消化系統(tǒng)的惡性腫瘤，約85%的胰腺癌患者同時(shí)伴有胰島素抵抗和糖尿病，而這些患者中56.1%糖尿病病程小于2年，這提示我們胰腺癌患者患有糖尿病并發(fā)癥的幾率大大增高[2]。胰島素分泌不足是導(dǎo)致2型糖尿病的重要病理基礎(chǔ)，而胰腺組織內(nèi)β細(xì)胞是行使分泌胰島素功能的主要細(xì)胞。有研究對(duì)胰腺癌患者進(jìn)行血清胰島素水平的檢測(cè)，結(jié)果顯示胰腺癌患者血清胰島素水平低下[6]。鑒于胰腺癌的發(fā)生位置與β細(xì)胞天然相近，β細(xì)胞的活性與功能更易受胰腺癌細(xì)胞影響。因此，我們推斷胰腺癌細(xì)胞可能通過(guò)某些分泌機(jī)制引起胰島β細(xì)胞存活與功能下降。傳統(tǒng)意義上，糖尿病狀態(tài)下的糖脂代謝異常所導(dǎo)致的高血糖和高血脂是引起β細(xì)胞凋亡的重要原因[7]。而癌癥狀態(tài)下，癌細(xì)胞對(duì)于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗會(huì)導(dǎo)致三大營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)度消耗，因此，癌癥狀態(tài)下誘發(fā)的β細(xì)胞存活與功能下降可能存在其它機(jī)制[8]。近年來(lái)，外泌體的傳遞功能受到廣泛關(guān)注，外泌體的特異性分泌和受體識(shí)別，會(huì)導(dǎo)致其攜帶的內(nèi)容物在靶細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)活性[9]。腫瘤細(xì)胞相較于正常細(xì)胞被證明能夠分泌大量外泌體，因此我們推測(cè)胰腺癌細(xì)胞可能通過(guò)外泌體分泌形式影響胰島β細(xì)胞。通過(guò)對(duì)2種小鼠胰腺癌細(xì)胞Pan02和MPC-83上清液外泌體的提取與鑒定，我們證實(shí)小鼠胰腺癌細(xì)胞能夠分泌外泌體。這一研究結(jié)果與Dai等[10]在人胰腺癌細(xì)胞的檢測(cè)結(jié)果相一致。并且通過(guò)胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體與胰島β細(xì)胞共孵育，我們證實(shí)了胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體能夠被β細(xì)胞吸收。

Figure 4. miR-204 targeted 3’UTR of Bcl-2 mRNA. A: the binding sites of miR-204 and 3’UTR of Bcl-2 mRNA predicted by TargetScan; B and C: the expression of miR-204 and Bcl-2 mRNA in control group and Exo-Trans group; D and E: the expression of miR-204 and Bcl-2 mRNA in NC group and miR-204(+) group. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsNC group.

圖4miR-204互補(bǔ)抑制Bcl-2的mRNA表達(dá)

Figure 5. Western blot was performed to determine the levels mitochondrial apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖5線(xiàn)粒體凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

為了證明胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體在β細(xì)胞內(nèi)可發(fā)揮生物學(xué)活性，本研究進(jìn)一步檢測(cè)與外泌體共孵育后的β細(xì)胞存活率和胰島素分泌量。與臨床血清胰島素結(jié)果相一致，外泌體處理后的β細(xì)胞胰島素分泌量顯著低于外泌體未處理組。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)外泌體處理組β細(xì)胞存活率下降為未處理組的80%，這說(shuō)明胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)容物可能通過(guò)影響β細(xì)胞存活率導(dǎo)致β細(xì)胞功能下降。外泌體是攜帶miRNA的主要轉(zhuǎn)運(yùn)形式，且多種miRNA被證實(shí)在癌癥的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮生物學(xué)活性[11-13]。有研究表明miR-204是胰腺組織特異性高表達(dá)的一種miRNA，且過(guò)表達(dá)會(huì)引起β細(xì)胞凋亡[4-5, 14]。因此，我們推測(cè)miR-204是胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體影響β細(xì)胞存活的重要原因。胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)miR-204檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體內(nèi)富含miR-204，外泌體與β細(xì)胞共孵育48 h顯著上調(diào)了β細(xì)胞內(nèi)的miR-204含量。這說(shuō)明胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體會(huì)顯著上調(diào)β細(xì)胞細(xì)胞內(nèi)的miR-204含量，且與β細(xì)胞存活率和胰島素分泌功能呈負(fù)相關(guān)。

鑒于過(guò)表達(dá)miR-204可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡已被多個(gè)研究證實(shí)，本研究進(jìn)一步對(duì)其引起β細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制進(jìn)行探討[14-16]。miRNA通常通過(guò)與mRNA的3’UTR端互補(bǔ)發(fā)揮作用，我們通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)，得到miR-204與Bcl-2的mRNA互補(bǔ)程度較高，故本研究進(jìn)一步檢測(cè)了Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示外泌體處理組Bcl-2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。為了進(jìn)一步證明miR-204可以下調(diào)Bcl-2，本研究在β細(xì)胞過(guò)表達(dá)miR-204，進(jìn)一步證實(shí)了miR-204能夠下調(diào)Bcl-2 表達(dá)。

Bcl-2是公認(rèn)的細(xì)胞凋亡調(diào)控靶點(diǎn)，它可以通過(guò)與Bax拮抗，抑制Bax的游離數(shù)量。下調(diào)Bcl-2的蛋白表達(dá)，會(huì)增加Bax轉(zhuǎn)位到線(xiàn)粒體膜，進(jìn)而增加線(xiàn)粒體通透性，釋放Cyt-C，激活caspase-3的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17-21]。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)胰腺癌細(xì)胞外泌體處理作用下的β細(xì)胞Bcl-2顯著下調(diào)，而與之相對(duì)的Bax顯著上調(diào)。Bcl-2與Bax的比值決定了caspase-3的激活程度，比值越低，激活程度越高。通過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，胰腺癌細(xì)胞外泌體處理作用下的β細(xì)胞Bcl-2/Bax比值顯著低于未處理組， 最終導(dǎo)致了caspase-3的激活和Cyt-C的釋放，這意味著胰腺癌細(xì)胞外泌體處理作用下的β細(xì)胞凋亡通路被激活。結(jié)合我們證實(shí)了miR-204能夠下調(diào)Bcl-2 表達(dá)，且胰腺癌外泌體和胰腺組織富含miR-204，因此我們推斷miR-204在胰腺癌分泌的外泌體引起的β細(xì)胞凋亡中可能發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究證實(shí)了胰腺癌細(xì)胞可以通過(guò)分泌外泌體引起β細(xì)胞凋亡和胰島素分泌功能下降，其潛在的促凋亡機(jī)制可能是通過(guò)上調(diào)miR-204的表達(dá)進(jìn)而抑制Bcl-2，激活β細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體凋亡途徑。這為胰腺癌誘發(fā)的新生糖尿病提供新的診療思路，而miR-204可能是潛在的重要調(diào)控靶點(diǎn)。

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Pancreatic cancer cell-secreted exosomes promote apoptosis of β cells via activation of mitochondrial apoptotic pathways

CUI Lian-zhi1, WANG Bo2, ZHANG Xiao-wei1, SUN Hong-shuai1, WU Xue-feng1

(1ClinicalLaboratory,JilinCancerHospital,Changchun130061,China;2InstituteofPhysicsandChemistry,JilinProvincialCenterofDiseaseControlandPrevention,Changchun130062,China.E-mail: 32708187@qq.com)

AIM: To investigate the effects of exosomes secreted by pancreatic cancer cells on the viability and function of β cells and the possible mechanism.METHODSExoQuick-TC kit was used to extract exosomes in the supernatants of mouse pancreatic cancer Pan02 and MPC-83 cells, and the extracted exosomes were identified by transmission electron microscopy. Fluorescence-labeled exosomes were incubated with mouse insulinoma MIN6 cells for 48 h to detect whether exosomes secreted by pancreatic cancer cells were uptaken by MIN6 cells. MTT and glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) assays were conducted to examine cell viability and insulin secretion of MIN6 cells after incubating with exosomes. The expression of miR-204 and Bcl-2 mRNA in MIN6 cells was detected by qPCR. The protein expression of Bcl-2, Bax, caspase-3 and cytochrome C (Cyt-C) in MIN6 cells was determined by Western blot.RESULTSThe results of transmission electron microscopy showed that both Pan02 cells and MPC-83 cells secreted exosomes, and Pan02 cells secreted more. The co-incubation results of fluorescence-labeled exosomes and MIN6 cells confirmed that MIN6 cells were able to ingest large amounts of exosomes secreted by pancreatic cancer cells. The results of MTT and GSIS assays showed that the viability and the level of high glucose-stimulated insulin secretion of MIN6 cells in exosome treatment group significantly decreased compared with nontreatment group (P<0.01). The results of qPCR showed that the exosomes secreted by pancreatic cancer cells were rich in miR-204, and the mRNA expression of Bcl-2 in MIN6 cells was significantly down-regulated by exosome incubation (P<0.01). The results of Western blot showed that the protein expression of Bcl-2 in the MIN6 cells treated with exosomes was significantly down-regulated (P<0.05), and the protein levels of Bax, cleaved caspase-3 and Cyt-C in exosomes treatment group were significantly up-regulated (P<0.01).CONCLUSIONPancreatic cancer cells secrete exosomes. The exosomes secreted by pancreatic cancer cells are ingested by β cells, and reduce the viability and insulin secretion of β cells. The mechanism may be related to the increase in exosomal miR-204 in the β cells. Increasing miR-204 may inhibit the expression of Bcl-2 and promote the activation of mitochondrial apoptosis in β cells.

Exosomes; Pancreatic cancer; MicroRNA-204; Bcl-2; Apoptosis

1000- 4718(2017)12- 2172- 07

2017- 06- 28

2017- 10- 13

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.20160101203JC)

△通訊作者 Tel: 0431-85871050; E-mail: 32708187@qq.com

R735.9; R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.010

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)