韓 園, 南 克, 項芳芳, 方錢娟, 黃晨苗, 雍慧媛, 曹 紅, 李 軍
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325027)
高遷移率族蛋白1對Aβ25-35刺激下BV-2細胞NF-κB表達的作用*
韓 園, 南 克, 項芳芳, 方錢娟, 黃晨苗, 雍慧媛, 曹 紅, 李 軍△
(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325027)
目的探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)對β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35刺激下的小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2中核因子-κB(NF-κB)表達的影響。方法將對數(shù)期生長的BV-2細胞分為4組:正常細胞組(不做任何處理)、模型組(加入40 μmol/L Aβ25-35)、RNA干擾組(采用RNA干擾HMGB1后加入40 μmol/L的Aβ25-35)和溶劑對照組(加入終濃度為0.1%的DMSO)。各組細胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h)采用Western blot法檢測HMGB1和NF-κB p65的蛋白表達情況。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示40 μmol/L Aβ25-35為最佳造模濃度。選擇30 nmol/L帶GFP熒光基團的HMGB1-siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞,轉(zhuǎn)染效率約為80%~90%。Western blot實驗結(jié)果顯示,HMGB1-siRNA片段干擾后BV-2細胞中HMGB1的表達明顯降低(P<0.05);Aβ25-35刺激BV-2細胞后,胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達均明顯升高(P<0.05),HMGB1-siRNA作用后,HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論RNA干擾HMGB1表達可減少Aβ25-35刺激的BV-2細胞核內(nèi)NF-κB的表達。
高遷移率族蛋白1; β-淀粉樣蛋白; BV-2細胞; 核因子-κB; RNA干擾
阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)和tau蛋白功能異常引起的最常見的癡呆類型之一[1]。據(jù)美國2016年阿爾茨海默病現(xiàn)狀報道,現(xiàn)約有540萬美國人罹患此病,預(yù)計本世紀(jì)中葉,將增長到1 380萬人,即每66 s將有1例新診斷患者[2]。研究表明AD患者腦內(nèi)高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)表達明顯增高,并可釋放至胞外而增加Aβ的神經(jīng)毒性[3]。HMGB1是存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,在炎癥和創(chuàng)傷等刺激下可以釋放出細胞,產(chǎn)生促炎細胞因子樣作用并調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[4]。小膠質(zhì)細胞(microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞,具有巨噬細胞樣作用。AD動物模型研究表明膠質(zhì)細胞的激活可促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生[5],當(dāng)其功能異常時Aβ清除減少,導(dǎo)致Aβ級聯(lián)瀑布反應(yīng)。本研究采用Aβ活性片段(Aβ25-35)刺激小鼠小膠質(zhì)細胞BV-2,體外模擬AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的病理生理過程,同時通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)抑制細胞中HMGB1的表達,觀察HMGB1對Aβ25-35處理的BV-2細胞核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)表達的影響,初步闡述HMGB1在AD發(fā)生發(fā)展中的可能作用。
Aβ25-35購于Sigma,配成終濃度500 μmol/L,-20 ℃保存, 使用時采用37 ℃水浴箱孵育7 d即為Aβ25-35的老化狀態(tài); LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑購于SignaGen;抗HMGB1抗體和抗NF-κB p65抗體購于Abcam;抗β-actin抗體購于Bioword;DMEM高糖培養(yǎng)基和南美胎牛血清購于Gibco;CCK-8試劑盒購于Dojindo;核蛋白和胞漿提取試劑盒購于南京凱基。
2.1細胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。培養(yǎng)液為含5%胎牛血清、100 mg/L青霉素以及100 mg/L 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,按1×107/L密度接種到培養(yǎng)瓶,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞呈半貼壁狀態(tài)生長,細胞匯集至80%~90%時,約2~3 d按1∶3傳代,至細胞生長良好時開始實驗。
2.2RNA干擾HMGB1 在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)核苷酸序列中查找到HMGB1的核苷酸序列,Gene ID:15289, 種屬:Mus musculus C57BL/6J,其siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成,總共3對:siRNA1(Hmgb1-mus-356)為5’-CUCGUU-AUGAAAGAGAAAUTT-3’(Forward)和5’-AUUUCUCUUUCAUAACGAGTT-3’(Reverse); siRNA2 (Hmgb1-mus-573)為5’-GCAGCCCUAUGAGAAGAAATT-3’(Forward)和5’-UUUCUUCUCAUAGGGCUGCTT-3’(Reverse); siRNA3(Hmgb1-mus-1792)為5’-CCA-GCGAAGGCUAUCACAATT-3’(Forward)和5’-UUG-UGAUAGCCUUCGCUGGTT-3’(Reverse)。經(jīng)BLAST同源性比對無明顯同源性。
將干粉狀siRNA溶于DEPC水,配制成20 μmol/L的溶液,分裝后-20 ℃保存。BV-2細胞按每孔4.5×104的密度接種于6孔板上。待細胞貼壁匯集達30%時更換成無血清、無雙抗的完全培養(yǎng)液(即轉(zhuǎn)染前30~60 min)。配制LipoJetTM轉(zhuǎn)染緩沖液(5×)成工作液時,用雙蒸水(ddH2O)按1∶4進行稀釋。吸取100 μL工作液,加入至各組不同濃度梯度siRNA靜置5 min,加入3 μL LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑,靜置10 min,將上述復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)細胞組中,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細胞。
2.3CCK-8法檢測細胞活力 BV-2細胞經(jīng)胰酶消化后,輕吹成懸液,按5×107/L的密度接種于96孔板上。當(dāng)細胞匯聚達70%時,實驗組細胞加入不同濃度梯度的Aβ25-35,對照組細胞加入培養(yǎng)基空白組為無細胞孔加入培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。
2.4實驗分組 取對數(shù)期BV-2細胞分為4組:正常細胞組(normal組),不做任何處理;模型組(Aβ25-35組),加入終濃度為40 μmol/L的Aβ25-35(收集細胞前);RNAi組,采用HMGB1-siRNA處理細胞后加入40 μmol/L的Aβ25-35;溶劑對照組(solvent組),加入轉(zhuǎn)染試劑和溶解Aβ25-35所需溶劑(0.1%的DMSO)。各組細胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h),用Western blot法檢測HMGB1和NF-κB p65蛋白的表達情況。
2.5Western blot檢測蛋白表達量 裂解各組細胞提取蛋白,一部分細胞用于提取全蛋白,一部分細胞根據(jù)核蛋白提取試劑盒提取核蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,蛋白上樣量40 μg,行SDS-PAGE分離蛋白,再轉(zhuǎn)到PVDF膜上,室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h,然后使用兔抗HMGB1抗體(1∶1 000)、兔抗NF-κB p65抗體(1∶1 000)和兔抗內(nèi)參照β-actin抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜,PBS洗膜后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1.5 h。加ECL溶液1 min,GE成像系統(tǒng)曝光并采集圖像。
用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理,計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
分別以5、10、20、30、40和50 μmol/L的Aβ25-35作用24 h后,30~50 μmol/L組BV-2細胞活力明顯下降(P<0.05),通過計算得到Aβ25-35的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 59.82 μmol/L,故最終選擇Aβ25-35的造模濃度為40 μmol/L,見圖1。
Figure 1. The cell viability of BV-2 cells stimulated by different concentrations of Aβ25-35detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs5 μmol/L Aβ25-35group.
圖1CCK-8法測定不同濃度Aβ25-35對BV-2細胞活力的影響
轉(zhuǎn)染細胞時,各孔細胞同時加入不同濃度(3個片段混合的HMGB1-siRNA,終濃度為0、10、20、30、40和50 nmol/L)的HMGB1-siRNA。與0 nmol/L組相比,各濃度干擾組HMGB1表達均下降(P<0.05),說明HMGB1-siRNA干擾技術(shù)可成功抑制HMGB1蛋白的表達,見圖2。
Figure 2. The effects of HMGB1-siRNA transfection at different concentrations on the protein expression of HMGB1 in the BV-2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L siRNA group.
圖2Westernblot法測定不同濃度HMGB1-siRNA干擾抑制HMGB1表達的情況
用帶GFP熒光基團的siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,siRNA轉(zhuǎn)染成功的細胞內(nèi)可見綠色熒光,30 nmol/L的siRNA的轉(zhuǎn)染效率為80%~90%[轉(zhuǎn)染效率(%)=顯示綠色熒光細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%],為最佳濃度,用于后續(xù)實驗,見圖3。
Figure 3. The protein expression of GFP followed by RNA interference in BV-2 cells observed under fluorescence microscopy (×100). A: bright field; B: fluorescence; C: merged.
圖3HMGB1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率觀察
選定siRNA濃度為30 nmol/L,空白對照(blank control,CON)組不做任何處理,陰性對照(negative control,NEG)組加入scramble siRNA,Hmgb1-mus-356、Hmgb1-mus-573和Hmgb1-mus-1792 3個干擾組分別命名為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。CON組中HMGB1的表達水平與NEG組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;與NEG組相比,siRNA1、siRNA2和siRNA3各組HMGB1的表達均下降(P<0.05),見圖4。據(jù)此,本實驗中將3個片段混合進行RNA干擾。
Figure 4. The protein expression of HMGB1 in different sequence of siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsNEG group.
圖4Westernblot法測定不同序列干擾抑制HMGB1表達的情況
與normal組相比,Aβ25-35組細胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達均升高(P<0.05),而轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA后,胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達均較Aβ25-35組明顯下降(P<0.05),而正常對照組與溶劑對照組間HMGB1和NF-κB p65表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;各組間總NF-κB p65表達的差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖5。
Figure 5. The protein expression of HMGB1 and NF-κB detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsAβ25-35group.
圖5Westernblot法測定HMGB1-siRNA對HMGB1和NF-κB表達的影響
本研究結(jié)果顯示,BV-2細胞株在Aβ25-35刺激下,細胞活力降低,NF-κB表達量較正常組上調(diào),提示BV-2細胞在Aβ25-35刺激下存在功能障礙及神經(jīng)炎癥發(fā)生的可能;而RNA干擾可有效減少HMGB1在BV-2中的表達,并下調(diào)NF-κB的表達量,提示干擾HMGB1能減輕神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。
“Aβ級聯(lián)瀑布假說”認為在AD患者腦內(nèi)的Aβ毒性是造成突觸功能紊亂和進而繼發(fā)神經(jīng)退行性病變的主要原因[6]。AD神經(jīng)病理的發(fā)生發(fā)展也與基因的表達調(diào)控、補體級聯(lián)放大反應(yīng)的激活、細胞因子和趨化因子受體的上調(diào)、反應(yīng)性膠質(zhì)細胞的增生、小膠質(zhì)細胞的活化以及線粒體的氧化應(yīng)激相關(guān)[7]。小膠質(zhì)細胞是腦組織中的單核-巨噬細胞,在AD患者腦中可以觀察到炎癥改變,特別是Aβ沉積部位,而激活且功能異常的小膠質(zhì)細胞處往往Aβ數(shù)目最多[8]。本研究采用的BV-2細胞株是從攜帶癌基因v-raf/v-myc的反轉(zhuǎn)錄病毒J2感染的小鼠原代小膠質(zhì)細胞獲得,可穩(wěn)定培養(yǎng),且高度純化,可用于體外研究,為探討AD的發(fā)病機制提供線索。有研究發(fā)現(xiàn)Aβ作用于BV-2細胞后,炎癥因子表達增加,通過激活NF-κB磷酸化促進IL-1β和TNF-α的表達[9]。也有研究表明Aβ對BV-2細胞并無明顯毒性作用,但對細胞形態(tài)有一定影響[10]。本實驗中,在Aβ25-35刺激下,BV-2細胞株NF-κB表達量升高,活力降低,但毒性并不強,這可能與小膠質(zhì)細胞復(fù)雜的活化分化功能有關(guān)。
本課題組前期實驗表明,經(jīng)Aβ25-35活化誘導(dǎo)后,原代大鼠小膠質(zhì)細胞中HMGB1表達明顯升高[11];在AD大鼠中HMGB1 的胞漿和胞外釋放量增加[12]。在腦梗死動物模型中,HMGB1大量合成與釋放,同時病灶區(qū)的神經(jīng)元大量凋亡,而給予HMGB1抑制劑后,神經(jīng)元的損失明顯減少[13]。而李滿等[14]近期研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注損傷腦內(nèi),HMGB1的表達升高可促進損傷部位神經(jīng)干細胞增殖,具有促進組織修復(fù)的作用。
研究表明,AD小鼠小膠質(zhì)細胞中HMGB1與DNA或RNA偶聯(lián)復(fù)合體激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products, RAGE)表達而增加斑塊負荷[15]。另有研究也表明,HMGB1表達升高伴隨著HMGB1的結(jié)合受體RAGE、Toll樣受體-2和Toll樣受體4的表達升高,HMGB1與受體結(jié)合促進炎癥級聯(lián)反應(yīng),促進脫髓鞘的神經(jīng)炎癥進展[16]。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子,在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用,在固有免疫和適應(yīng)性免疫中,調(diào)控組織和細胞的發(fā)生和發(fā)育等過程。本實驗中,RNA干擾HMGB1明顯降低了Aβ25-35刺激下的BV-2細胞核內(nèi)NF-κB的表達,說明HMGB1可能在 Aβ25-35刺激的BV-2細胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其確切的分子機制還需要進一步研究。
[1] Scheltens P, Blennow K, Breteler MM, et al. Alzhei-mer’s disease[J]. Lancet, 2016, 388(10043):505-517.
[2] Alzheimer’s Association. 2016 Alzheimer’s disease facts and figures[J]. Alzheimers Dement, 2016, 12(4):459-509.
[3] Takata K, Kitamura Y, Kakimura J, et al. Role of high mobility group protein-1 (HMG1) in amyloid-β homeostasis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(3):699-703.
[4] Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection[J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29:139-162.
[5] Baik SH, Kang S, Son SM, et al. Microglia contributes to plaque growth by cell death due to uptake of amyloid β in the brain of Alzheimer’s disease mouse model[J]. Glia, 2016, 64(12):2274-2290.
[6] Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002, 297(5580):353-356.
[7] Praticò D, Trojanowski JQ. Inflammatory hypotheses: novel mechanisms of Alzheimer’s neurodegeneration and new therapeutic targets?[J]. Neurobiol Aging, 2000, 21(3):441-445.
[8] Serpente M, Bonsi R, Scarpini E, et al. Innate immune system and inflammation in Alzheimer’s disease: from pathogenesis to treatment[J]. Neuroimmunomodulation, 2014, 21(2-3):79-87.
[9] 吳 軍, 王愛桃, 閔 喆, 等. β-淀粉樣蛋白對BV2小膠質(zhì)細胞促炎作用的研究[J]. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志, 2011, 20(5):431-435.
[10] 聶永慧, 王魯寧, 賈建軍, 等. 淀粉樣β蛋白對小膠質(zhì)細胞活化作用的體外觀察[J]. 中國臨床康復(fù), 2005, 9(29):70-72.
[11] 劉緒華, 王孝慶, 王中蘇, 等. 姜黃素減弱Aβ25-35致大鼠原代小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(9):1635-1641.
[12] 葉莉莎, 韓 園, 劉啟星, 等. 姜黃素對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及HMGB1和JNK表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6):1114-1118.
[13] Kikuchi K, Kawahara K, Tancharoen S, et al. The free radical scavenger edaravone rescues rats from cerebral infarction by attenuating the release of high-mobility group box-1 in neuronal cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2009, 329(3):865-874.
[14] 李 滿, 羅 勇, 李 圓, 等. 高遷移率族蛋白B1對大鼠局灶腦缺血/再灌注后大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(9):1616-1621.
[15] Fang F, Lue LF, Yan S, et al. RAGE-dependent signaling in microglia contributes to neuroinflammation, Aβ accumulation, and impaired learning/memory in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. FASEB J, 2010, 24(4):1043-1055.
[16] Andersson A, Covacu R, Sunnemark D, et al. Pivotal advance: HMGB1 expression in active lesions of human and experimental multiple sclerosis[J]. J Leukoc Biol, 2008, 84(5):1248-1255.
Eeffect of HMGB1 on expression of NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35
HAN Yuan, NAN Ke, XIANG Fang-fang, FANG Qian-juan, HUANG Chen-miao, YONG Hui-yuan, CAO Hong, LI Jun
(DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:lijun0068@163.com)
AIM: To investigate the effect of high mobility group box-1 protein (HMGB1) on the expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in BV-2 cells stimulated with amyloid β-protein (Aβ)25-35.METHODSCultured BV-2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups: normal cell group (without any treatment), model group (treated with Aβ25-35at 40 μmol/L), RNA interference (RNAi) group (conducted with HMGB1-siRNA followed by Aβ25-35stimulation) and solvent control group (treated with 0.1% DMSO). After treatment with Aβ25-35for 24 h, the protein levels of HMGB1 and NF-κB in BV-2 cells were determined by Western blot.RESULTSAβ25-35at 40 μmol/L was used to stimulate BV-2 cells. The GFP fluorescence-tagged HMGB1-siRNA (30 nmol/L) was used to transfect BV-2 cells and its transfection efficiency was about 80%~90%. The results of Western blot showed that the protein level of HMGB1 was significantly decreased after the interference of siRNA fragment (P<0.05). The protein levels of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were dramatically increased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05). After RNA interference with HMGB1, the expression of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were significantly decreased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05).CONCLUSIONRNA interference with HMGB1 reduces the expression of nucleic NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35.
High mobility group box-1 protein; Amyloid β-protein; BV-2 cells; Nuclear factor-κB; RNA interference
1000- 4718(2017)12- 2134- 05
2017- 04- 27
2017- 07- 14
國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81271204);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No. LY17H090015);浙江省科技廳公益項目(No. 2016C37098)
△通訊作者 Tel: 0577-88002925; E-mail: lijun0068@163.com
R363.2; R749.1+6
A
10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.004
(責(zé)任編輯: 盧 萍, 余小慧)