• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    高遷移率族蛋白1對Aβ25-35刺激下BV-2細胞NF-κB表達的作用*

    2017-12-22 09:09:23項芳芳方錢娟黃晨苗雍慧媛
    中國病理生理雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:膠質(zhì)孵育炎癥

    韓 園, 南 克, 項芳芳, 方錢娟, 黃晨苗, 雍慧媛, 曹 紅, 李 軍

    (溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325027)

    高遷移率族蛋白1對Aβ25-35刺激下BV-2細胞NF-κB表達的作用*

    韓 園, 南 克, 項芳芳, 方錢娟, 黃晨苗, 雍慧媛, 曹 紅, 李 軍△

    (溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉科, 浙江 溫州 325027)

    目的探討高遷移率族蛋白1(HMGB1)對β-淀粉樣蛋白(Aβ)25-35刺激下的小鼠小膠質(zhì)細胞系BV-2中核因子-κB(NF-κB)表達的影響。方法將對數(shù)期生長的BV-2細胞分為4組:正常細胞組(不做任何處理)、模型組(加入40 μmol/L Aβ25-35)、RNA干擾組(采用RNA干擾HMGB1后加入40 μmol/L的Aβ25-35)和溶劑對照組(加入終濃度為0.1%的DMSO)。各組細胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h)采用Western blot法檢測HMGB1和NF-κB p65的蛋白表達情況。結(jié)果CCK-8結(jié)果顯示40 μmol/L Aβ25-35為最佳造模濃度。選擇30 nmol/L帶GFP熒光基團的HMGB1-siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞,轉(zhuǎn)染效率約為80%~90%。Western blot實驗結(jié)果顯示,HMGB1-siRNA片段干擾后BV-2細胞中HMGB1的表達明顯降低(P<0.05);Aβ25-35刺激BV-2細胞后,胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達均明顯升高(P<0.05),HMGB1-siRNA作用后,HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65表達均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論RNA干擾HMGB1表達可減少Aβ25-35刺激的BV-2細胞核內(nèi)NF-κB的表達。

    高遷移率族蛋白1; β-淀粉樣蛋白; BV-2細胞; 核因子-κB; RNA干擾

    阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)和tau蛋白功能異常引起的最常見的癡呆類型之一[1]。據(jù)美國2016年阿爾茨海默病現(xiàn)狀報道,現(xiàn)約有540萬美國人罹患此病,預(yù)計本世紀(jì)中葉,將增長到1 380萬人,即每66 s將有1例新診斷患者[2]。研究表明AD患者腦內(nèi)高遷移率族蛋白1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)表達明顯增高,并可釋放至胞外而增加Aβ的神經(jīng)毒性[3]。HMGB1是存在于真核細胞核內(nèi)的非組蛋白染色體結(jié)合蛋白,在炎癥和創(chuàng)傷等刺激下可以釋放出細胞,產(chǎn)生促炎細胞因子樣作用并調(diào)節(jié)固有免疫和適應(yīng)性免疫[4]。小膠質(zhì)細胞(microglia,MG)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞,具有巨噬細胞樣作用。AD動物模型研究表明膠質(zhì)細胞的激活可促進神經(jīng)炎癥的發(fā)生[5],當(dāng)其功能異常時Aβ清除減少,導(dǎo)致Aβ級聯(lián)瀑布反應(yīng)。本研究采用Aβ活性片段(Aβ25-35)刺激小鼠小膠質(zhì)細胞BV-2,體外模擬AD患者腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的病理生理過程,同時通過RNA干擾(RNA interference, RNAi)抑制細胞中HMGB1的表達,觀察HMGB1對Aβ25-35處理的BV-2細胞核因子(nuclear factor-κB,NF-κB)表達的影響,初步闡述HMGB1在AD發(fā)生發(fā)展中的可能作用。

    材 料 和 方 法

    1 藥物和試劑

    Aβ25-35購于Sigma,配成終濃度500 μmol/L,-20 ℃保存, 使用時采用37 ℃水浴箱孵育7 d即為Aβ25-35的老化狀態(tài); LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑購于SignaGen;抗HMGB1抗體和抗NF-κB p65抗體購于Abcam;抗β-actin抗體購于Bioword;DMEM高糖培養(yǎng)基和南美胎牛血清購于Gibco;CCK-8試劑盒購于Dojindo;核蛋白和胞漿提取試劑盒購于南京凱基。

    2 方法

    2.1細胞培養(yǎng) 小鼠小膠質(zhì)細胞株BV-2購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細胞中心。培養(yǎng)液為含5%胎牛血清、100 mg/L青霉素以及100 mg/L 鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基,按1×107/L密度接種到培養(yǎng)瓶,置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細胞呈半貼壁狀態(tài)生長,細胞匯集至80%~90%時,約2~3 d按1∶3傳代,至細胞生長良好時開始實驗。

    2.2RNA干擾HMGB1 在美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)核苷酸序列中查找到HMGB1的核苷酸序列,Gene ID:15289, 種屬:Mus musculus C57BL/6J,其siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成,總共3對:siRNA1(Hmgb1-mus-356)為5’-CUCGUU-AUGAAAGAGAAAUTT-3’(Forward)和5’-AUUUCUCUUUCAUAACGAGTT-3’(Reverse); siRNA2 (Hmgb1-mus-573)為5’-GCAGCCCUAUGAGAAGAAATT-3’(Forward)和5’-UUUCUUCUCAUAGGGCUGCTT-3’(Reverse); siRNA3(Hmgb1-mus-1792)為5’-CCA-GCGAAGGCUAUCACAATT-3’(Forward)和5’-UUG-UGAUAGCCUUCGCUGGTT-3’(Reverse)。經(jīng)BLAST同源性比對無明顯同源性。

    將干粉狀siRNA溶于DEPC水,配制成20 μmol/L的溶液,分裝后-20 ℃保存。BV-2細胞按每孔4.5×104的密度接種于6孔板上。待細胞貼壁匯集達30%時更換成無血清、無雙抗的完全培養(yǎng)液(即轉(zhuǎn)染前30~60 min)。配制LipoJetTM轉(zhuǎn)染緩沖液(5×)成工作液時,用雙蒸水(ddH2O)按1∶4進行稀釋。吸取100 μL工作液,加入至各組不同濃度梯度siRNA靜置5 min,加入3 μL LipoJetTM轉(zhuǎn)染試劑,靜置10 min,將上述復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)細胞組中,繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細胞。

    2.3CCK-8法檢測細胞活力 BV-2細胞經(jīng)胰酶消化后,輕吹成懸液,按5×107/L的密度接種于96孔板上。當(dāng)細胞匯聚達70%時,實驗組細胞加入不同濃度梯度的Aβ25-35,對照組細胞加入培養(yǎng)基空白組為無細胞孔加入培養(yǎng)基。繼續(xù)孵育24 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液,避光繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的吸光度(A)值并計算細胞存活率。細胞存活率(%)=(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。

    2.4實驗分組 取對數(shù)期BV-2細胞分為4組:正常細胞組(normal組),不做任何處理;模型組(Aβ25-35組),加入終濃度為40 μmol/L的Aβ25-35(收集細胞前);RNAi組,采用HMGB1-siRNA處理細胞后加入40 μmol/L的Aβ25-35;溶劑對照組(solvent組),加入轉(zhuǎn)染試劑和溶解Aβ25-35所需溶劑(0.1%的DMSO)。各組細胞孵育72 h后(Aβ25-35處理24 h),用Western blot法檢測HMGB1和NF-κB p65蛋白的表達情況。

    2.5Western blot檢測蛋白表達量 裂解各組細胞提取蛋白,一部分細胞用于提取全蛋白,一部分細胞根據(jù)核蛋白提取試劑盒提取核蛋白,BCA法測定蛋白質(zhì)濃度,蛋白上樣量40 μg,行SDS-PAGE分離蛋白,再轉(zhuǎn)到PVDF膜上,室溫下5%脫脂牛奶封閉2 h,然后使用兔抗HMGB1抗體(1∶1 000)、兔抗NF-κB p65抗體(1∶1 000)和兔抗內(nèi)參照β-actin抗體(1∶5 000)4 ℃孵育過夜,PBS洗膜后采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體室溫孵育1.5 h。加ECL溶液1 min,GE成像系統(tǒng)曝光并采集圖像。

    3 統(tǒng)計學(xué)處理

    用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理,計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 Aβ25-35對BV-2細胞存活率的影響

    分別以5、10、20、30、40和50 μmol/L的Aβ25-35作用24 h后,30~50 μmol/L組BV-2細胞活力明顯下降(P<0.05),通過計算得到Aβ25-35的半數(shù)抑制濃度(IC50)為 59.82 μmol/L,故最終選擇Aβ25-35的造模濃度為40 μmol/L,見圖1。

    Figure 1. The cell viability of BV-2 cells stimulated by different concentrations of Aβ25-35detected by CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs5 μmol/L Aβ25-35group.

    圖1CCK-8法測定不同濃度Aβ25-35對BV-2細胞活力的影響

    2 不同濃度的siRNA干擾抑制HMGB1表達的情況

    轉(zhuǎn)染細胞時,各孔細胞同時加入不同濃度(3個片段混合的HMGB1-siRNA,終濃度為0、10、20、30、40和50 nmol/L)的HMGB1-siRNA。與0 nmol/L組相比,各濃度干擾組HMGB1表達均下降(P<0.05),說明HMGB1-siRNA干擾技術(shù)可成功抑制HMGB1蛋白的表達,見圖2。

    Figure 2. The effects of HMGB1-siRNA transfection at different concentrations on the protein expression of HMGB1 in the BV-2 cells detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 nmol/L siRNA group.

    圖2Westernblot法測定不同濃度HMGB1-siRNA干擾抑制HMGB1表達的情況

    3 HMGB1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率

    用帶GFP熒光基團的siRNA轉(zhuǎn)染BV-2細胞,在熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果,siRNA轉(zhuǎn)染成功的細胞內(nèi)可見綠色熒光,30 nmol/L的siRNA的轉(zhuǎn)染效率為80%~90%[轉(zhuǎn)染效率(%)=顯示綠色熒光細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%],為最佳濃度,用于后續(xù)實驗,見圖3。

    Figure 3. The protein expression of GFP followed by RNA interference in BV-2 cells observed under fluorescence microscopy (×100). A: bright field; B: fluorescence; C: merged.

    圖3HMGB1-siRNA的轉(zhuǎn)染效率觀察

    4 各干擾序列抑制HMGB1表達效果

    選定siRNA濃度為30 nmol/L,空白對照(blank control,CON)組不做任何處理,陰性對照(negative control,NEG)組加入scramble siRNA,Hmgb1-mus-356、Hmgb1-mus-573和Hmgb1-mus-1792 3個干擾組分別命名為siRNA1組、siRNA2組、siRNA3組。CON組中HMGB1的表達水平與NEG組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;與NEG組相比,siRNA1、siRNA2和siRNA3各組HMGB1的表達均下降(P<0.05),見圖4。據(jù)此,本實驗中將3個片段混合進行RNA干擾。

    Figure 4. The protein expression of HMGB1 in different sequence of siRNA detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsNEG group.

    圖4Westernblot法測定不同序列干擾抑制HMGB1表達的情況

    5 干擾抑制HMGB1對Aβ25-35刺激下BV-2細胞NF-κB表達的影響

    與normal組相比,Aβ25-35組細胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達均升高(P<0.05),而轉(zhuǎn)染HMGB1-siRNA后,胞內(nèi)HMGB1和核內(nèi)NF-κB p65的表達均較Aβ25-35組明顯下降(P<0.05),而正常對照組與溶劑對照組間HMGB1和NF-κB p65表達水平的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性;各組間總NF-κB p65表達的差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性,見圖5。

    Figure 5. The protein expression of HMGB1 and NF-κB detected by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsAβ25-35group.

    圖5Westernblot法測定HMGB1-siRNA對HMGB1和NF-κB表達的影響

    討 論

    本研究結(jié)果顯示,BV-2細胞株在Aβ25-35刺激下,細胞活力降低,NF-κB表達量較正常組上調(diào),提示BV-2細胞在Aβ25-35刺激下存在功能障礙及神經(jīng)炎癥發(fā)生的可能;而RNA干擾可有效減少HMGB1在BV-2中的表達,并下調(diào)NF-κB的表達量,提示干擾HMGB1能減輕神經(jīng)炎癥的發(fā)生發(fā)展。

    “Aβ級聯(lián)瀑布假說”認為在AD患者腦內(nèi)的Aβ毒性是造成突觸功能紊亂和進而繼發(fā)神經(jīng)退行性病變的主要原因[6]。AD神經(jīng)病理的發(fā)生發(fā)展也與基因的表達調(diào)控、補體級聯(lián)放大反應(yīng)的激活、細胞因子和趨化因子受體的上調(diào)、反應(yīng)性膠質(zhì)細胞的增生、小膠質(zhì)細胞的活化以及線粒體的氧化應(yīng)激相關(guān)[7]。小膠質(zhì)細胞是腦組織中的單核-巨噬細胞,在AD患者腦中可以觀察到炎癥改變,特別是Aβ沉積部位,而激活且功能異常的小膠質(zhì)細胞處往往Aβ數(shù)目最多[8]。本研究采用的BV-2細胞株是從攜帶癌基因v-raf/v-myc的反轉(zhuǎn)錄病毒J2感染的小鼠原代小膠質(zhì)細胞獲得,可穩(wěn)定培養(yǎng),且高度純化,可用于體外研究,為探討AD的發(fā)病機制提供線索。有研究發(fā)現(xiàn)Aβ作用于BV-2細胞后,炎癥因子表達增加,通過激活NF-κB磷酸化促進IL-1β和TNF-α的表達[9]。也有研究表明Aβ對BV-2細胞并無明顯毒性作用,但對細胞形態(tài)有一定影響[10]。本實驗中,在Aβ25-35刺激下,BV-2細胞株NF-κB表達量升高,活力降低,但毒性并不強,這可能與小膠質(zhì)細胞復(fù)雜的活化分化功能有關(guān)。

    本課題組前期實驗表明,經(jīng)Aβ25-35活化誘導(dǎo)后,原代大鼠小膠質(zhì)細胞中HMGB1表達明顯升高[11];在AD大鼠中HMGB1 的胞漿和胞外釋放量增加[12]。在腦梗死動物模型中,HMGB1大量合成與釋放,同時病灶區(qū)的神經(jīng)元大量凋亡,而給予HMGB1抑制劑后,神經(jīng)元的損失明顯減少[13]。而李滿等[14]近期研究發(fā)現(xiàn)在缺血/再灌注損傷腦內(nèi),HMGB1的表達升高可促進損傷部位神經(jīng)干細胞增殖,具有促進組織修復(fù)的作用。

    研究表明,AD小鼠小膠質(zhì)細胞中HMGB1與DNA或RNA偶聯(lián)復(fù)合體激活晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation end products, RAGE)表達而增加斑塊負荷[15]。另有研究也表明,HMGB1表達升高伴隨著HMGB1的結(jié)合受體RAGE、Toll樣受體-2和Toll樣受體4的表達升高,HMGB1與受體結(jié)合促進炎癥級聯(lián)反應(yīng),促進脫髓鞘的神經(jīng)炎癥進展[16]。NF-κB作為核轉(zhuǎn)錄因子,在免疫系統(tǒng)的發(fā)育和功能中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用,在固有免疫和適應(yīng)性免疫中,調(diào)控組織和細胞的發(fā)生和發(fā)育等過程。本實驗中,RNA干擾HMGB1明顯降低了Aβ25-35刺激下的BV-2細胞核內(nèi)NF-κB的表達,說明HMGB1可能在 Aβ25-35刺激的BV-2細胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,其確切的分子機制還需要進一步研究。

    [1] Scheltens P, Blennow K, Breteler MM, et al. Alzhei-mer’s disease[J]. Lancet, 2016, 388(10043):505-517.

    [2] Alzheimer’s Association. 2016 Alzheimer’s disease facts and figures[J]. Alzheimers Dement, 2016, 12(4):459-509.

    [3] Takata K, Kitamura Y, Kakimura J, et al. Role of high mobility group protein-1 (HMG1) in amyloid-β homeostasis[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2003, 301(3):699-703.

    [4] Andersson U, Tracey KJ. HMGB1 is a therapeutic target for sterile inflammation and infection[J]. Annu Rev Immunol, 2011, 29:139-162.

    [5] Baik SH, Kang S, Son SM, et al. Microglia contributes to plaque growth by cell death due to uptake of amyloid β in the brain of Alzheimer’s disease mouse model[J]. Glia, 2016, 64(12):2274-2290.

    [6] Hardy J, Selkoe DJ. The amyloid hypothesis of Alzheimer’s disease: progress and problems on the road to therapeutics[J]. Science, 2002, 297(5580):353-356.

    [7] Praticò D, Trojanowski JQ. Inflammatory hypotheses: novel mechanisms of Alzheimer’s neurodegeneration and new therapeutic targets?[J]. Neurobiol Aging, 2000, 21(3):441-445.

    [8] Serpente M, Bonsi R, Scarpini E, et al. Innate immune system and inflammation in Alzheimer’s disease: from pathogenesis to treatment[J]. Neuroimmunomodulation, 2014, 21(2-3):79-87.

    [9] 吳 軍, 王愛桃, 閔 喆, 等. β-淀粉樣蛋白對BV2小膠質(zhì)細胞促炎作用的研究[J]. 中國組織化學(xué)與細胞化學(xué)雜志, 2011, 20(5):431-435.

    [10] 聶永慧, 王魯寧, 賈建軍, 等. 淀粉樣β蛋白對小膠質(zhì)細胞活化作用的體外觀察[J]. 中國臨床康復(fù), 2005, 9(29):70-72.

    [11] 劉緒華, 王孝慶, 王中蘇, 等. 姜黃素減弱Aβ25-35致大鼠原代小膠質(zhì)細胞的神經(jīng)炎癥反應(yīng)[J]. 中國病理生理雜志, 2016, 32(9):1635-1641.

    [12] 葉莉莎, 韓 園, 劉啟星, 等. 姜黃素對阿爾茨海默病大鼠學(xué)習(xí)記憶及HMGB1和JNK表達的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(6):1114-1118.

    [13] Kikuchi K, Kawahara K, Tancharoen S, et al. The free radical scavenger edaravone rescues rats from cerebral infarction by attenuating the release of high-mobility group box-1 in neuronal cells[J]. J Pharmacol Exp Ther, 2009, 329(3):865-874.

    [14] 李 滿, 羅 勇, 李 圓, 等. 高遷移率族蛋白B1對大鼠局灶腦缺血/再灌注后大腦皮質(zhì)梗死周圍區(qū)神經(jīng)干細胞增殖的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2014, 30(9):1616-1621.

    [15] Fang F, Lue LF, Yan S, et al. RAGE-dependent signaling in microglia contributes to neuroinflammation, Aβ accumulation, and impaired learning/memory in a mouse model of Alzheimer’s disease[J]. FASEB J, 2010, 24(4):1043-1055.

    [16] Andersson A, Covacu R, Sunnemark D, et al. Pivotal advance: HMGB1 expression in active lesions of human and experimental multiple sclerosis[J]. J Leukoc Biol, 2008, 84(5):1248-1255.

    Eeffect of HMGB1 on expression of NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35

    HAN Yuan, NAN Ke, XIANG Fang-fang, FANG Qian-juan, HUANG Chen-miao, YONG Hui-yuan, CAO Hong, LI Jun

    (DepartmentofAnesthesiology,TheSecondAffiliatedHospitalandYuyingChildren’sHospital,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325027,China.E-mail:lijun0068@163.com)

    AIM: To investigate the effect of high mobility group box-1 protein (HMGB1) on the expression of nuclear factor-κB (NF-κB) in BV-2 cells stimulated with amyloid β-protein (Aβ)25-35.METHODSCultured BV-2 cells in logarithmic growth phase were divided into 4 groups: normal cell group (without any treatment), model group (treated with Aβ25-35at 40 μmol/L), RNA interference (RNAi) group (conducted with HMGB1-siRNA followed by Aβ25-35stimulation) and solvent control group (treated with 0.1% DMSO). After treatment with Aβ25-35for 24 h, the protein levels of HMGB1 and NF-κB in BV-2 cells were determined by Western blot.RESULTSAβ25-35at 40 μmol/L was used to stimulate BV-2 cells. The GFP fluorescence-tagged HMGB1-siRNA (30 nmol/L) was used to transfect BV-2 cells and its transfection efficiency was about 80%~90%. The results of Western blot showed that the protein level of HMGB1 was significantly decreased after the interference of siRNA fragment (P<0.05). The protein levels of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were dramatically increased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05). After RNA interference with HMGB1, the expression of HMGB1 and nucleic NF-κB p65 were significantly decreased in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35(P<0.05).CONCLUSIONRNA interference with HMGB1 reduces the expression of nucleic NF-κB in BV-2 cells stimulated with Aβ25-35.

    High mobility group box-1 protein; Amyloid β-protein; BV-2 cells; Nuclear factor-κB; RNA interference

    1000- 4718(2017)12- 2134- 05

    2017- 04- 27

    2017- 07- 14

    國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81271204);浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No. LY17H090015);浙江省科技廳公益項目(No. 2016C37098)

    △通訊作者 Tel: 0577-88002925; E-mail: lijun0068@163.com

    R363.2; R749.1+6

    A

    10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.12.004

    (責(zé)任編輯: 盧 萍, 余小慧)

    猜你喜歡
    膠質(zhì)孵育炎癥
    脯氨酰順反異構(gòu)酶Pin 1和免疫炎癥
    歡迎訂閱《感染、炎癥、修復(fù)》雜志
    人類星形膠質(zhì)細胞和NG2膠質(zhì)細胞的特性
    三物黃芩湯組分(群)配伍在大鼠肝微粒體孵育模型中的相互作用
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:27
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    大鼠肝微粒體孵育體系中2種成分的測定及其代謝
    中成藥(2017年5期)2017-06-13 13:01:12
    視網(wǎng)膜小膠質(zhì)細胞的研究進展
    歡迎訂閱《感染、炎癥、修復(fù)》雜志
    側(cè)腦室內(nèi)罕見膠質(zhì)肉瘤一例
    磁共振成像(2015年1期)2015-12-23 08:52:21
    炎癥小體與腎臟炎癥研究進展
    一级a爱视频在线免费观看| 国产99白浆流出| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 欧美日本中文国产一区发布| 69精品国产乱码久久久| 国产99久久九九免费精品| 日韩国内少妇激情av| 欧美一区二区精品小视频在线| 一进一出好大好爽视频| 午夜免费激情av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 精品久久久久久,| 露出奶头的视频| 一区在线观看完整版| 最近最新中文字幕大全电影3 | 视频区图区小说| 午夜精品久久久久久毛片777| 久久久国产欧美日韩av| 成人三级黄色视频| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲中文av在线| 成人三级黄色视频| 一区二区三区国产精品乱码| 国产亚洲av高清不卡| 999精品在线视频| 日韩精品青青久久久久久| 国产又色又爽无遮挡免费看| 99热只有精品国产| 欧美日本亚洲视频在线播放| 超碰97精品在线观看| www.自偷自拍.com| av在线播放免费不卡| 亚洲久久久国产精品| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 精品国产一区二区久久| 9色porny在线观看| 手机成人av网站| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲精品一区av在线观看| 精品人妻在线不人妻| 久久久精品欧美日韩精品| 久久99一区二区三区| 黄片大片在线免费观看| 国产国语露脸激情在线看| e午夜精品久久久久久久| 久久国产精品人妻蜜桃| xxxhd国产人妻xxx| 热re99久久国产66热| a级毛片黄视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 97人妻天天添夜夜摸| 黑人欧美特级aaaaaa片| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品日产1卡2卡| 国产单亲对白刺激| 夫妻午夜视频| 精品久久蜜臀av无| 成人国语在线视频| 日韩欧美在线二视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 99精品在免费线老司机午夜| 精品久久久精品久久久| 一本大道久久a久久精品| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 美女福利国产在线| 精品久久久精品久久久| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲精品国产区一区二| 搡老岳熟女国产| 国产欧美日韩一区二区三| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲全国av大片| 男女下面进入的视频免费午夜 | 亚洲精华国产精华精| 久久九九热精品免费| 老司机午夜十八禁免费视频| 免费av中文字幕在线| 精品国产国语对白av| 正在播放国产对白刺激| 久久香蕉激情| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产免费男女视频| 99久久人妻综合| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 精品卡一卡二卡四卡免费| 亚洲专区国产一区二区| 亚洲成人久久性| 国产野战对白在线观看| 99re在线观看精品视频| 久久久水蜜桃国产精品网| 91av网站免费观看| 满18在线观看网站| 精品福利永久在线观看| 欧美在线一区亚洲| 后天国语完整版免费观看| 亚洲免费av在线视频| 国产片内射在线| 亚洲一区二区三区不卡视频| 色老头精品视频在线观看| 日韩免费av在线播放| 99re在线观看精品视频| 亚洲精品美女久久av网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 麻豆av在线久日| 久久精品亚洲av国产电影网| av网站在线播放免费| 男男h啪啪无遮挡| 又紧又爽又黄一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 国产av精品麻豆| 18美女黄网站色大片免费观看| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 黄色怎么调成土黄色| 精品国产乱子伦一区二区三区| 丝袜美足系列| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黑人欧美特级aaaaaa片| 午夜两性在线视频| 亚洲成人久久性| 成人国产一区最新在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 中国美女看黄片| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲中文字幕日韩| 在线观看一区二区三区| 国产有黄有色有爽视频| e午夜精品久久久久久久| 国产精品永久免费网站| 久久久久久久久免费视频了| 日日夜夜操网爽| 久久精品91蜜桃| a级片在线免费高清观看视频| 一夜夜www| 精品欧美一区二区三区在线| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 亚洲美女黄片视频| 丝袜美腿诱惑在线| e午夜精品久久久久久久| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 精品福利观看| 午夜a级毛片| 久久99一区二区三区| 女人被狂操c到高潮| 男男h啪啪无遮挡| 少妇粗大呻吟视频| 午夜福利欧美成人| 日韩视频一区二区在线观看| 最近最新免费中文字幕在线| 麻豆av在线久日| 女人被狂操c到高潮| 黄色丝袜av网址大全| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲午夜理论影院| 老司机亚洲免费影院| 国产成人系列免费观看| 天堂√8在线中文| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产精品综合久久久久久久免费 | 淫妇啪啪啪对白视频| 一二三四在线观看免费中文在| 在线观看www视频免费| 亚洲成人免费电影在线观看| 婷婷精品国产亚洲av在线| 香蕉久久夜色| 黑人操中国人逼视频| 手机成人av网站| 夜夜看夜夜爽夜夜摸 | 久久久国产欧美日韩av| videosex国产| 国产精品成人在线| 久久伊人香网站| aaaaa片日本免费| 狂野欧美激情性xxxx| 校园春色视频在线观看| 中文字幕色久视频| 久久伊人香网站| 亚洲国产欧美网| 成人av一区二区三区在线看| 成年人免费黄色播放视频| 操出白浆在线播放| 亚洲中文日韩欧美视频| 日韩免费av在线播放| 极品教师在线免费播放| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品久久久久成人av| 久久狼人影院| 人成视频在线观看免费观看| 欧美中文综合在线视频| 看片在线看免费视频| 亚洲伊人色综图| 久久中文字幕人妻熟女| 免费不卡黄色视频| 久久国产亚洲av麻豆专区| 嫩草影视91久久| 中文字幕人妻丝袜制服| 中出人妻视频一区二区| 99国产精品一区二区三区| 男人舔女人的私密视频| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 国产免费男女视频| 999久久久国产精品视频| 天堂√8在线中文| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久久久久久久中文| 99久久人妻综合| 极品教师在线免费播放| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产精品免费视频内射| 国产av一区二区精品久久| 亚洲一区二区三区欧美精品| xxx96com| 国产高清视频在线播放一区| 长腿黑丝高跟| 欧美成狂野欧美在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 一区福利在线观看| а√天堂www在线а√下载| 成年女人毛片免费观看观看9| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产野战对白在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 久久久国产一区二区| 午夜免费鲁丝| 丝袜在线中文字幕| 十八禁网站免费在线| 十八禁人妻一区二区| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美日韩精品网址| 国产精品久久久av美女十八| 久久中文字幕人妻熟女| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 中文亚洲av片在线观看爽| 黄色女人牲交| 男女下面插进去视频免费观看| 天堂影院成人在线观看| 超碰成人久久| 日韩成人在线观看一区二区三区| 免费观看人在逋| www.精华液| 日本黄色视频三级网站网址| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 日本一区二区免费在线视频| 日日夜夜操网爽| 三上悠亚av全集在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 亚洲一区高清亚洲精品| 麻豆一二三区av精品| 亚洲专区中文字幕在线| av有码第一页| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲色图综合在线观看| 国产高清视频在线播放一区| 女性生殖器流出的白浆| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 看黄色毛片网站| 18禁观看日本| 久久久久久大精品| 国产单亲对白刺激| 一级毛片女人18水好多| 亚洲三区欧美一区| 啦啦啦 在线观看视频| 两性夫妻黄色片| 脱女人内裤的视频| 久久香蕉精品热| 日韩三级视频一区二区三区| x7x7x7水蜜桃| 高清欧美精品videossex| 亚洲 国产 在线| 久久香蕉国产精品| 在线观看日韩欧美| 午夜成年电影在线免费观看| 成年版毛片免费区| 一进一出好大好爽视频| 久久午夜亚洲精品久久| 日日夜夜操网爽| 男女午夜视频在线观看| 男女之事视频高清在线观看| 校园春色视频在线观看| 欧美人与性动交α欧美软件| 男女午夜视频在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 最新在线观看一区二区三区| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲熟妇熟女久久| x7x7x7水蜜桃| 老司机深夜福利视频在线观看| 一a级毛片在线观看| 丝袜人妻中文字幕| 我的亚洲天堂| 国产亚洲精品第一综合不卡| а√天堂www在线а√下载| 日韩欧美在线二视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲av电影在线进入| 在线av久久热| 少妇 在线观看| av欧美777| 嫁个100分男人电影在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 老司机福利观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费高清视频大片| 中文字幕人妻熟女乱码| 99国产精品一区二区三区| 午夜福利,免费看| av福利片在线| 欧美日韩精品网址| 天堂√8在线中文| 操美女的视频在线观看| 午夜激情av网站| 色综合站精品国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久精品91蜜桃| av有码第一页| 99久久综合精品五月天人人| 黄色成人免费大全| 天天添夜夜摸| 亚洲国产中文字幕在线视频| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲三区欧美一区| 国产三级黄色录像| 成年女人毛片免费观看观看9| 亚洲成人免费电影在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 极品人妻少妇av视频| 韩国av一区二区三区四区| av视频免费观看在线观看| 香蕉国产在线看| 午夜91福利影院| 村上凉子中文字幕在线| 亚洲七黄色美女视频| 国产片内射在线| 国产一区二区三区视频了| 女性生殖器流出的白浆| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 国产亚洲精品一区二区www| av欧美777| 波多野结衣一区麻豆| netflix在线观看网站| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 香蕉国产在线看| 国产高清国产精品国产三级| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 国产精品二区激情视频| 日本一区二区免费在线视频| 国产成人av激情在线播放| 欧美日韩精品网址| 在线观看一区二区三区激情| 狠狠狠狠99中文字幕| 99久久综合精品五月天人人| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 成人免费观看视频高清| 成人国语在线视频| 国产一区二区三区视频了| 亚洲av熟女| 在线播放国产精品三级| 午夜视频精品福利| 亚洲av熟女| 高清在线国产一区| 丝袜在线中文字幕| 国产精品爽爽va在线观看网站 | 欧美最黄视频在线播放免费 | 亚洲,欧美精品.| 无人区码免费观看不卡| 亚洲av五月六月丁香网| 国产欧美日韩精品亚洲av| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 多毛熟女@视频| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 嫩草影院精品99| www.熟女人妻精品国产| 欧美成人午夜精品| 男女床上黄色一级片免费看| 麻豆国产av国片精品| 午夜日韩欧美国产| 亚洲视频免费观看视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 欧美性长视频在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 99久久精品国产亚洲精品| 国产精品国产高清国产av| 成年人免费黄色播放视频| 女人被狂操c到高潮| 一级黄色大片毛片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 中文字幕色久视频| 欧美日韩黄片免| 亚洲性夜色夜夜综合| 久久久久国产一级毛片高清牌| 亚洲五月色婷婷综合| 国产欧美日韩精品亚洲av| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 日韩免费高清中文字幕av| 精品乱码久久久久久99久播| 免费在线观看亚洲国产| 97人妻天天添夜夜摸| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 91麻豆av在线| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 日本免费a在线| 精品久久久久久久久久免费视频 | 精品乱码久久久久久99久播| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品1区2区在线观看.| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 色综合欧美亚洲国产小说| 久久人人97超碰香蕉20202| 91国产中文字幕| 757午夜福利合集在线观看| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 久久狼人影院| 免费在线观看黄色视频的| 99国产精品一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| www.精华液| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 后天国语完整版免费观看| 欧美不卡视频在线免费观看 | 大陆偷拍与自拍| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 神马国产精品三级电影在线观看 | 制服诱惑二区| 亚洲一区二区三区不卡视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 视频区图区小说| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产在线精品亚洲第一网站| 久久人人97超碰香蕉20202| 亚洲av第一区精品v没综合| 午夜久久久在线观看| 久久久久久人人人人人| 最近最新免费中文字幕在线| 色播在线永久视频| 99热只有精品国产| 久久久国产成人精品二区 | 精品免费久久久久久久清纯| 看片在线看免费视频| 亚洲熟女毛片儿| 免费少妇av软件| 99香蕉大伊视频| 国产99白浆流出| 久久99一区二区三区| 久久久久久久久中文| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲精品国产一区二区精华液| 免费看a级黄色片| 成人黄色视频免费在线看| 欧美成人午夜精品| 狠狠狠狠99中文字幕| 亚洲精品久久午夜乱码| 在线观看免费视频网站a站| aaaaa片日本免费| 亚洲熟女毛片儿| 一级,二级,三级黄色视频| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 亚洲久久久国产精品| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 无遮挡黄片免费观看| 黄片大片在线免费观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 淫秽高清视频在线观看| 久久午夜综合久久蜜桃| 一区福利在线观看| 女人被狂操c到高潮| av中文乱码字幕在线| 亚洲黑人精品在线| 久久 成人 亚洲| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 成熟少妇高潮喷水视频| 午夜影院日韩av| aaaaa片日本免费| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 性色av乱码一区二区三区2| 一级毛片高清免费大全| 亚洲熟妇中文字幕五十中出 | 婷婷六月久久综合丁香| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 亚洲全国av大片| 欧美成狂野欧美在线观看| a级毛片黄视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 黄色丝袜av网址大全| 啦啦啦免费观看视频1| 免费不卡黄色视频| 国产精品影院久久| 国产麻豆69| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 久久香蕉精品热| 国产精品 国内视频| 老司机亚洲免费影院| 午夜福利在线免费观看网站| 日日爽夜夜爽网站| 午夜免费观看网址| 国产高清videossex| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 国产成人欧美在线观看| 最好的美女福利视频网| 女警被强在线播放| 亚洲专区国产一区二区| 交换朋友夫妻互换小说| 在线观看66精品国产| a级毛片在线看网站| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲av第一区精品v没综合| 黑人操中国人逼视频| 露出奶头的视频| 一级毛片高清免费大全| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久伊人香网站| 美女午夜性视频免费| 亚洲成a人片在线一区二区| 神马国产精品三级电影在线观看 | 校园春色视频在线观看| 乱人伦中国视频| 99精品久久久久人妻精品| 12—13女人毛片做爰片一| 国产av又大| 日韩免费av在线播放| 中文字幕人妻熟女乱码| 999久久久国产精品视频| 日韩有码中文字幕| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 后天国语完整版免费观看| 亚洲精品在线美女| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲精品在线美女| 久久性视频一级片| 亚洲成人免费电影在线观看| 国产精品 国内视频| 亚洲三区欧美一区| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 高清毛片免费观看视频网站 | 精品一区二区三卡| 欧美一级毛片孕妇| 午夜a级毛片| 在线播放国产精品三级| 国产精品国产av在线观看| 亚洲男人的天堂狠狠| 国产高清激情床上av| √禁漫天堂资源中文www| 久热这里只有精品99| 成人影院久久| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 91大片在线观看| 亚洲精品一二三| 在线播放国产精品三级| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 欧美在线黄色| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 欧美在线黄色| 国产精品久久电影中文字幕| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 国产亚洲欧美精品永久| 国产av在哪里看| 免费在线观看亚洲国产| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 又黄又粗又硬又大视频| 极品教师在线免费播放| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 最近最新中文字幕大全免费视频| 久久精品国产综合久久久| 叶爱在线成人免费视频播放| 91在线观看av| 男女之事视频高清在线观看| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 人成视频在线观看免费观看| 一级黄色大片毛片| 午夜精品在线福利| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 无人区码免费观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 国产精品久久电影中文字幕| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产av一区二区精品久久| 欧美大码av| 欧美日本中文国产一区发布| 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩乱码在线| 久热爱精品视频在线9| 午夜精品在线福利| 自线自在国产av| 亚洲一区高清亚洲精品| 精品一区二区三卡| 天堂影院成人在线观看| 亚洲久久久国产精品| 窝窝影院91人妻| 成人免费观看视频高清| 一本综合久久免费| 日本a在线网址| 国产视频一区二区在线看| 男人操女人黄网站| 12—13女人毛片做爰片一| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲精品在线观看二区|