大、小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)的研究進展

龍 隆，趙顯莉，譚 紅*，張愛華，楊鴻波，何錦林

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴陽 550025； 2.貴州省分析測試研究院，貴陽 550002)

大、小鼠支氣管肺泡灌洗術(shù)的研究進展

龍 隆1，2，趙顯莉2，譚 紅2*，張愛華1，楊鴻波2，何錦林2

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，貴陽 550025； 2.貴州省分析測試研究院，貴陽 550002)

研究報告

支氣管肺泡灌洗術(shù)是研究呼吸系統(tǒng)及其病變的一種重要的動物實驗技術(shù)，它可以獲得呼吸道及肺部深處多種生化因子、炎癥介質(zhì)和免疫細胞等，為動物實驗研究提供重要的評價指標(biāo)和參考依據(jù)，是探討呼吸系統(tǒng)性疾病的一種有效可靠的方法。目前應(yīng)用于人的支氣管肺泡灌洗術(shù)已經(jīng)逐步標(biāo)準(zhǔn)化并在臨床廣泛開展，但沒有一套針對實驗動物大小鼠的支氣管肺泡灌洗操作的標(biāo)準(zhǔn)。支氣管肺泡灌洗液的檢測結(jié)果受諸多因素共同影響, 如灌洗液、灌注壓力、灌洗量和回收量以及灌洗液在肺部停留時間等, 成功而高效獲取灌洗標(biāo)本是研究和評價呼吸系統(tǒng)性疾病的關(guān)鍵所在。本文總結(jié)了目前國內(nèi)外研究人員常用的灌洗操作方法，為今后進一步開展相關(guān)的實驗研究提供參考。

支氣管肺泡灌洗術(shù)；動物實驗；呼吸系統(tǒng)

支氣管肺泡灌洗術(shù) (bronchoalveolar lavage, BAL)是研究人和動物呼吸系統(tǒng)性疾病的一種十分重要的實驗技術(shù)，該技術(shù)方法在臨床試驗和動物實驗研究中都得到了廣泛應(yīng)用與研究[1-3],但在實驗動物相關(guān)研究中并未得到應(yīng)有的重視。如今有關(guān)大小鼠的實驗與日俱增，在實驗研究中的地位越發(fā)重要，而環(huán)境空氣污染愈發(fā)嚴(yán)重，對人健康危害極大[4]，了解動物呼吸系統(tǒng)的病變，并將其研究成果應(yīng)用于我們?nèi)祟愶@得格外重要，尤其是在吸入毒性試驗中，同時支氣管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 也廣泛用于研究吸入納米顆粒物、大氣顆粒物以及工人們在某些特定的職業(yè)場所吸入空氣中的懸浮顆粒物后所引起的肺損傷，例如實驗動物染毒后BALF中的肺泡巨噬細胞、中性粒細胞的數(shù)量、磷脂和總蛋白的濃度的顯著性改變，是肺部炎癥損傷程度的重要生物標(biāo)志物[5]，BALF的檢測結(jié)果顯得十分關(guān)鍵[6-8]。但目前國內(nèi)外學(xué)者對于實驗動物大小鼠支氣管肺泡的灌洗并沒有形成一種準(zhǔn)確、可靠而規(guī)范的一套操作方法，研究人員的肺泡灌洗方法千差萬別，導(dǎo)致相關(guān)實驗研究之間缺乏可比性，BALF的檢測結(jié)果受到諸多因素影響，不同的灌洗操作方法對BALF意義重大，對灌洗液的回收率和灌洗液中細胞及細胞因子活性的影響都不容忽視，這一點細小的差異可能會對整個實驗研究結(jié)果產(chǎn)生深遠的影響，如灌洗液被污染混入血液、抽吸壓力大小、灌洗量和灌洗液的種類等。因此，建立一種可靠、準(zhǔn)確、成功率高的標(biāo)準(zhǔn)灌洗方法尤為重要，本文總結(jié)了國內(nèi)外學(xué)者的支氣管肺泡灌洗方法，為今后進一步開展相關(guān)實驗研究提供參考和依據(jù)。

1 麻醉

動物手術(shù)前的麻醉不僅是為了減輕動物的痛苦，滿足動物福利的要求，也是為了保證動物手術(shù)順利進行的前提，目前國外大多數(shù)實驗研究采用的麻醉方式都是通過腹腔注射(intraperitoneal injection, IP) 戊巴比妥鈉，戊巴比妥鈉已經(jīng)成為了國外學(xué)者首選的麻醉藥，在比較發(fā)達的國家和地區(qū)，則傾向采用更為安全、效率更高的吸入異氟烷麻醉，異氟烷被動物吸入體內(nèi)后幾乎不參與體內(nèi)代謝，對實驗結(jié)果干擾較小。國內(nèi)使用的吸入麻醉藥還包括乙醚，但乙醚會對動物的呼吸道造成強烈的刺激。吸入麻醉相比傳統(tǒng)的麻醉方式具有以下明顯的優(yōu)點：麻醉作用快、動物蘇醒迅速、麻醉深度易于控制以及實驗動物的病死率低，然而吸入麻醉成本較高，術(shù)前準(zhǔn)備及麻醉操作相對復(fù)雜，國內(nèi)應(yīng)用并不多見。而國內(nèi)實驗人員選擇的麻醉藥除了戊巴比妥鈉外也有用水合氯醛，盡管戊巴比妥鈉和水合氯醛等麻醉劑使用較為方便，麻醉過程平衡且穩(wěn)定，維持時間長，但也存在明顯的缺點：動物蘇醒時間較長，更重要的是麻醉藥對呼吸系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)存在明顯的抑制作用[9-10]，給開展部分實驗帶來較大的干擾。因此麻醉藥和麻醉劑量要依據(jù)自己實驗的要求和目的來選擇，不同品系的大小鼠對不同種類麻醉藥的敏感性也不同，這就需要我們根據(jù)自己實踐的結(jié)果并結(jié)合參考文獻來選擇適合的麻醉方式?，F(xiàn)階段常用的大小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉劑量為30～50 mg/kg，濃度1%～3%，水合氯醛麻醉劑量為300～400 mg/kg，濃度10%，烏拉坦由于具有較強的致癌作用應(yīng)用較少。當(dāng)下同時研究授試物與麻醉藥對機體聯(lián)合及交互作用的研究并不多見，部分藥物的動力學(xué)及藥效學(xué)尚不完全清楚，這也許會給實驗結(jié)果帶來困擾，是授試物造成的結(jié)局亦或是麻醉藥影響了特定生化指標(biāo)的改變還需要更進一步的探討。

2 灌洗液

選擇合適的灌洗液是目前BAL中爭議最大的環(huán)節(jié)，也是整個灌洗過程中最混亂的一部分，國內(nèi)外實驗人員在選擇灌洗液種類、溫度以及灌洗量上都存在較大差異。常用的灌洗液包括生理鹽水(pH 6.2～7.4)、磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)以及D-Hanks液(pH 7.9)。史菲等[11]通過導(dǎo)管吸取37℃預(yù)熱的生理鹽水緩慢注入大鼠左側(cè)肺內(nèi)，并來回抽吸10次，每只大鼠的單次肺泡灌洗量為2.5 mL。曹君等[12]選用無菌PBS對小鼠進行單側(cè)肺泡灌洗,單次灌洗量為0.5 mL。國內(nèi)學(xué)者大多選用生理鹽水和磷酸鹽緩沖液[3,12]進行灌洗，但很少有學(xué)者約定灌洗液的溫度和pH值，值得一提的是，國外實驗人員偏愛pH 7.4含有鈣鎂離子并且預(yù)熱的PBS，他們認為其更有利于灌洗液中細胞因子的活性[13-15]。灌洗液的種類、pH值以及溫度高低的差異可能對呼吸道的刺激作用不同，對收集的灌洗液中細胞因子活性的影響也不一樣，給灌洗液后續(xù)檢測分析結(jié)果帶來一定干擾，國內(nèi)的相關(guān)研究幾乎處于一片空白。能否進行成功的灌洗，收集到準(zhǔn)確而可靠的結(jié)果，標(biāo)準(zhǔn)化BAL的操作，選擇合適的灌洗液顯得尤為重要，很多試驗中并沒有對該問題引起重視，在實驗方法中簡略描述，今后相關(guān)實驗研究需要注重BALF的收集方法且具體化，并增加必要的討論。

3 灌洗部位

大小鼠的肺葉分部與我們?nèi)舜嬖诿黠@差異，左肺為單葉，右肺由上、中、下及副葉組成，因此根據(jù)實驗?zāi)康臎Q定是全肺灌洗或單肺灌洗，如果要求灌洗標(biāo)本更多，則選取灌洗全肺或右肺，如果對組織病理學(xué)要求更高，則選擇左肺進行灌洗，國內(nèi)外實驗人員對于選取實驗動物灌洗部位也有著明顯的差別，國內(nèi)實驗人員通常灌洗左肺[1,11]，為了避免氣管插管進入復(fù)雜的右肺肺葉，也有學(xué)者灌洗全肺[13]，雖然全肺灌洗可以獲得更多的灌洗標(biāo)本，但也在一定程度上限制了動物的有效利用，同時增加實驗動物數(shù)量，違反了實驗動物的減量化(reducing)、再利用(reusing)和再循環(huán)(recycling)原則，反之，國外學(xué)者更偏向于結(jié)扎左主支氣管灌洗右肺[14-16]，Shin等[14]用3 mL預(yù)熱的含有Ca2+、Mg2+離子的磷酸鹽緩沖液對右肺進行了14次灌洗。Kim等[15]同樣使用了含有Ca2+、Mg2+離子的磷酸鹽緩沖液對右肺進行了4次灌洗，他們的操作方法基本一致。國外學(xué)者認為BAL是一項十分重要的操作技術(shù)，BALF中各種細胞因子、免疫因子以及細胞涂片等的檢測結(jié)果至關(guān)重要，大小鼠右肺組織明顯多于左肺，因而灌洗右肺能夠獲得更多的標(biāo)本，可供參考的數(shù)據(jù)更多更準(zhǔn)確，也遵循了動物福利，這也是他們絕大部分實驗選擇灌洗右肺的根本原因。

4 灌洗方式

灌洗方式是指離體操作或在體操做，在體灌洗只需通過手術(shù)暴露實驗動物整個肺組織及氣管并行插管后對其進行灌洗，相比之下，離體灌洗就稍顯復(fù)雜，還需要將肺部及氣管完整的取出后再進行灌洗，兩種方式都存在明顯的利弊，雖然在體灌洗對BALF中的細胞因子活性影響較小，但灌洗液回收率比較低，盡管離體灌洗時灌洗液回收量比較大，然而對細胞活性影響比較大，同時離體灌洗還需要對肺部進行手術(shù)分離，稍有不慎就可能刺穿肺葉，影響灌洗，導(dǎo)致整個實驗失敗，使得灌洗操作變得更加復(fù)雜，費時費力，值得注意的是在對小鼠進行操作時應(yīng)格外小心，如果沒有剝離干凈，在行氣管插管時，血管可能被手術(shù)器械挑破，導(dǎo)致血液流出不僅會干擾插管的視野，還會導(dǎo)致BALF污染，影響B(tài)ALF生化因子和細胞成分的分析。當(dāng)前并沒有實驗研究明確揭示在體灌洗與離體灌洗的差異，對細胞活性有著怎樣的影響，國內(nèi)外研究人員也并未對其進行深入探討，這應(yīng)當(dāng)是今后相關(guān)實驗研究的一個重點。

5 灌洗液的處理

收集到BALF之后，為了分離灌洗液中的多種成分，將對其離心，使相關(guān)細胞因子留在上清液中用于相關(guān)細胞因子的檢測，而細胞等成分則沉淀下來通過重懸，給沉淀細胞一個合適的環(huán)境，并使其形態(tài)保持完整性后行染色涂片、細胞計數(shù)以及顯微鏡鏡檢。國內(nèi)外實驗研究人員對于離心速度、離心時間、離心溫度和細胞重懸所用的液體都沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這也使得相關(guān)實驗數(shù)據(jù)的結(jié)果缺乏可比性。國外實驗人員BAL匯總?cè)绫?所示。

6 灌洗過程的注意事項及討論

6.1 氣管插管的選取

由于大小鼠實驗動物的氣管管徑不同，行BAL時所使用的導(dǎo)管也略有不同，小鼠氣管直徑1.5 mm左右，大鼠氣管2～2.5 mm左右，灌洗套管太粗不容易插進去，還會損傷氣管，致使起到穿孔，灌洗管太細又容易導(dǎo)致液體外溢，使回收率降低，因此選用適合的導(dǎo)管十分關(guān)鍵。史菲等[11]采用外徑為1.8 mm的靜脈導(dǎo)管作為氣管插管。酆孟潔等[28]使用24 G靜脈留置套管針收集小鼠BALF，在灌洗液中觀察到大量嗜酸性粒細胞，成功收集到了哮喘小鼠模型BALF。曹君等[12]采用22G靜脈留置針套管行氣管插管收集BALF，與酆孟潔等使用的氣管插管方法基本一致。

6.2 抽吸力度和速度

灌洗操作過程中的抽吸速度、抽吸力度和抽洗次數(shù)同樣也是收集BALF的關(guān)鍵，極容易被人忽視，在灌洗過程中，抽吸速度過快、力度過大，不僅灌洗不徹底，影響實驗結(jié)果，還會導(dǎo)致管腔壓力劇增，灌洗液溢出，甚至細胞變形破裂，包漿丟失，灌注壓力過大會使灌洗液從肺組織表面滲出，抽吸力度過大易導(dǎo)致氣管和靜脈導(dǎo)管變形，反而不容易吸出液體。反復(fù)抽吸的次數(shù)過多，雖然收集到的標(biāo)本中的細胞會相應(yīng)增多，但灌洗量卻會隨之減少，導(dǎo)致回收率降低，此外抽吸次數(shù)過多還可能導(dǎo)致細胞受擠壓變形而破裂嚴(yán)重干擾實驗結(jié)果，國外研究人員大多抽吸2～4次。

表1 支氣管肺泡灌洗術(shù)匯總表Tab.1 Summary of bronchoalveolar lavage techniques

6.3 灌洗量和停留時間

眾所周知大鼠肺組織容量大于小鼠，因此大鼠和小鼠的肺泡灌洗量也有所區(qū)別，灌洗液量過大將導(dǎo)致肺內(nèi)壓力急劇升高，嚴(yán)重時可導(dǎo)致灌洗液由肺組織包膜滲入胸腔中，過小則會導(dǎo)致回收不全，影響實驗結(jié)果。常用的大鼠肺泡單次灌洗量為3～5 mL，小鼠為0.2～1 mL，除此之外，灌洗液在肺組織內(nèi)停留時間的長短對實驗結(jié)果的影響也不容忽視，停留時間過短也會導(dǎo)致灌洗液回收不徹底，目前，絕大多數(shù)實驗都將15～30 s作為灌洗液在肺組織內(nèi)最合適的停留時間。

6.4 回收率

值得提出的是，我們不難發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗操作過程一點的不同，BALF的回收率千差萬別，同時BALF回收率也飽受爭議，在實際操作過程中想要每一個灌洗標(biāo)本都得到一個較高的回收率并不容易，尤其是第一個灌洗標(biāo)本的回收量是最少的，再者如果只行單側(cè)肺泡灌洗, 回收率將進一步降低，回收率是否應(yīng)當(dāng)納入標(biāo)準(zhǔn)肺泡灌洗還需更進一步的探討。

鑒于BAL對今后開展呼吸系統(tǒng)相關(guān)研究的意義重大[29-33]，必然會對研究實驗動物呼吸道、肺部疾病做出更大貢獻，同時也應(yīng)該看到灌洗液的種類、灌洗方式以及灌洗操作等均會對BALF的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾，在研究不同疾病時，BAL的操作可能不盡相同，因此有必要對其深入探討，相關(guān)研究有待進一步深化。

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Researchprogressofbronchoalveolarlavageinratsandmice

LONG Long1,2， ZHAO Xian-li2， TAN Hong2*， ZHANG Ai-hua1， YANG Hong-bo2， HE Jin-lin2

(1.School of Public Health of Guizhou Medical University, Guiyang 550025, China； 2.Guizhou Academy of Testing and Analysis, Guiyang 550002)

Bronchoalveolar lavage is an important animal experimental technique in the study of respiratory system and its pathological changes. It can acquire a variety of biochemical factors, inflammatory mediators and immune cells from the respiratory tract and lungs, and provides an important evaluation index and reference for animal experiment. Bronchoalveolar lavage is an effective and reliable method for the diagnosis of respiratory diseases. It has been gradually standardized and widely used in clinical practice at present, however, there is no set of standard for bronchoalveolar lavage in rats and mice. The results of bronchoalveolar lavage fluid are affected by many factors, such as the lavage fluid, suction pressure, the amount of lavage and recovery, and the retention time of lavage fluid in the lungs. Successful and efficient acquisition of lavage specimens is the key to the study and evaluation of respiratory diseases. This paper summarizes the current lavage methods commonly used by domestic and foreign researchers, and provides a reference for further research in the this field.

Bronchoalveolar Lavage; Animal experiment; Respiratory system

貴州省科技計劃(黔科合外G字[2015]7001號)；中央引導(dǎo)地方科技科技發(fā)展專項(黔科中引地[2016]4001號)；環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室開放基金(KF2016-21)；遺傳資源與進化國家重點實驗室開放課題(GREKF17-15)。

龍隆(1991-)男，碩士研究生，專業(yè)：公共衛(wèi)生-環(huán)境醫(yī)學(xué)與衛(wèi)生監(jiān)督。E-mail： 497192979@qq.com

譚紅(1959-)女，研究員，研究方向：食品安全、環(huán)境監(jiān)測、新化學(xué)物質(zhì)毒理測試研究。E-mail: tan-hong@tom.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0115-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.020

2017-04-19