• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    羅格列酮對HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡影響 及機(jī)制探究

    2017-12-21 06:39:52楊光華葛志鵬丁家杉黃志強(qiáng)張國志王長友
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:列酮羅格空白對照

    張 琪,楊光華,葛志鵬,丁家杉,黃志強(qiáng),鄭 陽,張國志,王長友*

    (1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 唐山 063000; 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

    羅格列酮對HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡影響 及機(jī)制探究

    張 琪1,楊光華1,葛志鵬1,丁家杉2,黃志強(qiáng)1,鄭 陽1,張國志1,王長友1*

    (1.華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院,河北 唐山 063000; 2.華北理工大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,河北 唐山 063000)

    研究報(bào)告

    目的探討羅格列酮對結(jié)腸癌HT29、HCT116細(xì)胞增殖、凋亡情況的影響以及AKT/GSK3β信號(hào)通路的變化。方法HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度羅格列酮(20.0 μmol/L,40.0 μmol/L,80.0 μmol/L)處理后,采用MTT法檢測細(xì)胞增殖能力的變化,annexin-V FITC/PI試劑盒檢測細(xì)胞凋亡情況,Western blot檢測Bcl2、Bax以及Akt、GSK3β表達(dá)情況。結(jié)果與空白對照組相比,不同濃度的羅格列酮對HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖均有影響(P< 0.01),并且影響呈劑量依賴關(guān)系;不同濃度的羅格列酮對HT29、HCT116細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用(P< 0.01),且誘導(dǎo)HT29、HCT116細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性;羅格列酮處理細(xì)胞48 h后,與空白對照組相比Bcl2/Bax表達(dá)水平、P-GSK3β、P-Akt表達(dá)水平明顯下降(P< 0.01),Akt、GSK3β表達(dá)水平較空白對照組差異無顯著性(P> 0.05)。結(jié)論羅格列酮可能通過抑制Akt/GSK3β通路的激活,改變Bcl2/Bax 情況,發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。

    羅格列酮;結(jié)腸癌;凋亡;Bcl2;Bax;Akt;GSK3β

    由于人口結(jié)構(gòu)和飲食習(xí)慣的改變,結(jié)腸癌在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。在世界范圍內(nèi),結(jié)腸癌的發(fā)病率分別位列女性和男性腫瘤的第二位和第三位[2],因此對于結(jié)腸癌的防治研究尤為重要。噻唑烷二酮類藥物羅格列酮(rosiglitazone, ROZ)是一種PPARγ特異性配體。作為胰島素增敏劑,本身具備較少、較輕的藥物毒副作用,同時(shí)已有許多研究證實(shí)在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為有明顯的抑制作用,但是對于結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用研究甚少,具體發(fā)揮作用的信號(hào)通路尚不可知[3]。因此,我們進(jìn)行體外研究,采用HT29、HCT116人結(jié)腸癌細(xì)胞系,予以不同濃度的羅格列酮,探討結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡情況以及AKT/GSK3β信號(hào)通路的變化。

    1 材料和方法

    1.1 細(xì)胞系及試劑儀器

    人結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29、HCT116,購買于中國科學(xué)院干細(xì)胞庫;DMEM培養(yǎng)基 (Gibco公司);四季青胎牛血清(浙江天杭生物公司);抗體Bcl-2、Bax、P-Akt、Akt、P-GSK3β、GSK3β、annexin-V FITC/PI染料試劑盒(Sigma公司);HR標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗、β-actin抗體、MTT試劑盒、DAB顯影液(上海碧云天生物技術(shù)研究所);BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液、PMSF、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);酶標(biāo)儀、濕轉(zhuǎn)系統(tǒng)(上海Bio-Rad公司);流式細(xì)胞儀(FACS Calibur,BD公司);羅格列酮(上海三維制藥有限公司)。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    HT29、HCT116、細(xì)胞用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基,37.0℃,5% CO2條件下培養(yǎng),每2 d傳代1次。

    1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測

    采用MTT法,取對數(shù)生長期的細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,按 5×103/孔接種于3個(gè)96孔板中,細(xì)胞貼壁后以不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h同步化細(xì)胞。棄去培養(yǎng)基,配置ROZ終濃度為20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L的含10% FBS的完全培養(yǎng)基處理各組細(xì)胞,空白對照組為不含ROZ的完全培養(yǎng)基。每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔,培養(yǎng)24 h、48 h。各孔加入 5 mg/mL MTT 溶液 10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)箱中反應(yīng) 4 h,棄培養(yǎng)基,每孔加入DMSO 100 μL,置于培養(yǎng)箱中反應(yīng)15 min。用酶標(biāo)儀在波長570 nm處測定各孔吸光度值(OD值)。因OD值與孔內(nèi)存活細(xì)胞數(shù)呈正比,故用OD值表示細(xì)胞增殖能力。

    1.2.3 Anneixin-V/ PI染色檢測羅格列酮對細(xì)胞凋亡影響

    取對數(shù)生長期細(xì)胞,制備成單細(xì)胞懸液,接種于6孔板中,同步化細(xì)胞。按空白對照組,以及不同濃度的ROZ分組,每孔加入2 mL培養(yǎng)基。37℃,5% CO2條件下培養(yǎng)48 h,胰酶消化,1000 r/min離心5 min,棄上清,PBS重懸細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,棄上清,加入185 μL annexin V-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞后,加入 5 μL annexin V-FITC、10 μL PI染色液混勻。室溫避光孵育10 min,1 h內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測分析,以早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的含量合計(jì)為凋亡細(xì)胞,3次獨(dú)立的重復(fù)實(shí)驗(yàn)獲得以下數(shù)據(jù)。

    1.2.4 Western blot檢測相關(guān)蛋白表達(dá)

    兩株細(xì)胞經(jīng)濃度為40.0 μm/L ROZ處理48 h后,RIPA裂解液充分裂解細(xì)胞,離心收集蛋白。BCA法定量總蛋白,加入等體積2×蛋白上樣緩沖液后100℃變性5 min,-80℃保存?zhèn)溆谩_M(jìn)行SDS-PAGE蛋白電泳,再分別進(jìn)行轉(zhuǎn)膜(90 V,90 min),10%脫脂奶封閉,一抗孵育過夜(1∶1000),二抗(1∶100)37℃ 孵育2 h,熒光顯色。Image J軟件分析灰度值。相關(guān)蛋白表達(dá)量計(jì)算=(所測蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值)×100%。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度ROZ對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響

    MTT結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后不同濃度的ROZ對兩株結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖均有影響,并且影響呈劑量依賴關(guān)系。ROZ濃度越高,對細(xì)胞增殖影響越大,20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L組與空白對照組相比差異有顯著性(P< 0.01)。(見表1)

    2.2 不同濃度ROZ對HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡促進(jìn)作用

    通過annexin-V/ PI染色檢測細(xì)胞凋亡,結(jié)果顯示,濃度為20.0 μmol/L、40.0 μmol/L、80.0 μmol/L的ROZ對HT29、HCT116細(xì)胞均有誘導(dǎo)凋亡的作用,各組凋亡率均高于空白對照組,差異有顯著性(P< 0.01)。且ROZ誘導(dǎo)HT29、HCT116細(xì)胞凋亡呈劑量依賴性,兩兩比較LSD檢驗(yàn)組間差異有顯著性(P< 0.01)。(見圖1,表2)

    表1 各組不同時(shí)間OD值檢測Tab.1 OD values of different cells at different time points

    注:與空白對照組比,*P< 0.01。

    Note.Compared with the control group,*P< 0.01.

    圖1 羅格列酮對HT29、HCT116細(xì)胞凋亡率的影響Fig.1 Effect of ROZ on the apoptosis rate of HT29 and HCT116 cells表2 羅格列酮對HT29、HCT116細(xì)胞凋亡率的影響Tab.2 Effect of ROZ on the apoptosis rate ofHT29 and HCT116 cells

    組別Groups凋亡率/%ApoptosisrateHT29HCT116對照組Controlgroup257±036350±036ROZ200μmol/L487±038▲596±052▲ROZ400μmol/L737±112▲954±105▲ROZ800μmol/L1356±101▲1593±055▲

    注:與空白對照組比,▲P< 0.01。

    Note.Compared with the control group,▲P< 0.01.

    2.3 ROZ誘導(dǎo)HT29、HCT116結(jié)腸癌凋亡相關(guān)蛋白的檢測

    Western blot進(jìn)行相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)量的檢測,結(jié)果顯示(圖3),與空白對照組相比,抗凋亡蛋白Bcl2表達(dá)水平降低,促凋亡蛋白Bax表達(dá)水平上升,差異有顯著性(P< 0.01)。這表示,ROZ誘導(dǎo)HT29、HCT116結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡可能與Bcl-2/Bax表達(dá)水平下降有關(guān)系。(見圖2)

    2.4 ROZ對HT29、HCT116細(xì)胞Akt/GSK3β蛋白信號(hào)通路蛋白的調(diào)控

    細(xì)胞經(jīng)濃度為40.0 μm/L的ROZ處理48 h后,消化收集細(xì)胞提取蛋白。在驗(yàn)證了細(xì)胞發(fā)生凋亡了之后,我們驗(yàn)證了Akt及其下游GSK3β的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,各組總Akt,GSK3β的表達(dá)含量不變,與對照組相比差異無顯著性(P> 0.05),但各組p-Akt和p-GSK3β的表達(dá)含量下降明顯,與對照組相比差異有顯著性(P< 0.01)。p-Akt減少可以使GSK3β磷酸化下降,導(dǎo)致GSK3β失活減少,從而促進(jìn)凋亡。這表明在ROZ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中,Akt/GSK3β信號(hào)通路可能起到了重要的作用。(見圖3)

    圖2 ROZ對HT29、HCT116細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of ROZ on apoptosis protein expression in HT29 cells and HCT116 cells detected by Western blot

    圖3 ROZ對HT29、HCT116細(xì)胞AKT/GSK3β蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of ROZ on protein expressions of AKT/GSK3β of HT29 cells and HCT116 cells detected by Western blot

    3 討論

    結(jié)腸癌發(fā)病原因及機(jī)制尚不清楚,目前研究認(rèn)為,結(jié)腸癌的發(fā)生是由環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣以及遺傳因素等共同作用的結(jié)果[4, 5]。目前對于結(jié)腸癌的治療依然是以手術(shù)治療為主并結(jié)合放化療,但治療效果并不理想,面對著復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、抗藥性同時(shí)以及輔助治療時(shí)嚴(yán)重的副作用等問題[6, 7]。

    既往大量研究發(fā)現(xiàn)PPARγ在腫瘤組織中表達(dá)均有不同程度的上調(diào),PPARγ配體可以抑制腫瘤細(xì)胞生長從而達(dá)到腫瘤的化學(xué)預(yù)防和治療的作用[8-11]。Chen等[12]研究證明PPARγ配體抑制HT29細(xì)胞生長和誘導(dǎo)其凋亡是通過下調(diào)bcl-2的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。許多研究證實(shí)Bcl-2家族不僅調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡而且能改變化療藥物對腫瘤的敏感性[13, 14]。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是目前大多數(shù)抗癌藥物的主要作用位點(diǎn),這也成為評(píng)價(jià)抗癌藥物能力的指標(biāo)[15]。本次實(shí)驗(yàn)通過MTT,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡,Western blot檢測相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)證實(shí)了ROZ可以通過凋亡途徑抑制HT29和HCT116細(xì)胞,并且呈劑量依賴性。Western blot 結(jié)果顯示抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào),促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào),我們推測ROZ促進(jìn)HT29、HCT116細(xì)胞凋亡可能是通過Bcl-2/Bax表達(dá)水平下降來實(shí)現(xiàn)的。

    Akt/GSK3β信號(hào)通路是一個(gè)重要的抗凋亡、促增殖的信號(hào)通路,在多種人類腫瘤中都可檢測到該信號(hào)通路的異常[16-18], GSK3β的磷酸化可以抑制Bax線粒體轉(zhuǎn)位和Bcl-2的降解,從而抑制凋亡,故干擾Akt/GSK3β的表達(dá)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-21]。因此本實(shí)驗(yàn)探究了ROZ對Akt/GSK3β信號(hào)通路的影響。

    本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ROZ處理HT29、HCT116細(xì)胞48 h后,GSK3β、Akt的活化產(chǎn)物P-GSK3β、P-Akt表達(dá)水平明顯降低,因此推測ROZ可能通過抑制Akt/GSK3β通路的激活,破壞Bcl-2/Bax 比例,發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。但Akt/GSK3β可能不是ROZ誘導(dǎo)HT29、HCT116細(xì)胞凋亡的唯一通路,其對凋亡的影響及其中具體的作用機(jī)制需后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步深入研究。

    [1] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA Cancer J Clin, 2016, 66(2): 115-132.

    [2] Ferlay J, Soerjomataram I, Dikshit R, et al. Cancer incidence and mortality worldwide: sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 [J]. Int J Cancer, 2015, 136(5): E359-E386.

    [3] Goel H, Tikoo K, Arun Karpe P, et al. Ameliorated chemotherapeutic potential of diverse dose flouropyrimidine therapy by etodolac via NF-ΚB pathway, PPAR-γ expression and COX-II inhibition in DMH induced colon cancer rats [J]. Clin Cancer Drugs, 2016, 3(2): 109-120.

    [4] Vargas AJ, Thompson PA. Diet and nutrient factors in colorectal cancer risk [J]. Nutr Clin Pract, 2012, 27(5): 613-623.

    [5] 張海燕, 孫勇, 夏惠, 等. 脫氧紫色桿菌素抑制結(jié)腸癌TH29細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)凋亡作用與機(jī)制[J]. 中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 27(05): 89-93.

    [6] Laszlo L. Predictive and prognostic factors in the complex treatment of patients with colorectal cancer [J]. Magy Onkol, 2010, 54(4): 383-394.

    [7] Zhang Q, Sha S, Xu B, et al. Prevalence of colorectal cancer in patients with ulcerative colitis: A retrospective, monocenter study in China [J]. J Cancer Res Ther, 2015, 11(4): 899-903.

    [8] Galli A, Ceni E, Mello T, et al. Thiazolidinediones inhibit hepatocarcinogenesis in hepatitis B virus-transgenic mice by peroxisome proliferator-activated receptor gamma-independent regulation of nucleophosmin [J]. Hepatology, 2010, 52(2): 493-505.

    [9] Rageul J, Mottier S, Jarry A, et al. KLF4-dependent, PPARγ-induced expression of GPA33 in colon cancer cell lines [J]. Int J Cancer, 2009, 125(12): 2802-2809.

    [10] Toaldo C, Pizzimenti S, Cerbone A, et al. PPARγ ligands inhibit telomerase activity and hTERT expression through modulation of the Myc/Mad/Max network in colon cancer cells [J]. J Cell Mol Med, 2010, 14(6A): 1347-1357.

    [11] Tencer L, Burgermeister E, Ebert MP, et al. Rosiglitazone induces caveolin-1 by PPARγ-dependent and PPRE-independent mechanisms: the role of EGF receptor signaling and its effect on cancer cell drug resistance [J]. Anticancer Res, 2008, 28(2A): 895-906.

    [12] Chen GG, Lee JF, Wang SH, et al. Apoptosis induced by activation of peroxisome-proliferator activated receptor-gamma is associated with Bcl-2 and NF-κB in human colon cancer [J]. Life Sci, 2002, 70(22): 2631-2646.

    [13] Wang J, Liu X, Jiang W. Co-transfection of MRP and bcl-2 antisense S-oligodeoxynucleotides reduces drug resistance in cisplatin-resistant lung cancer cells [J]. Chin Med J (Engl), 2000, 113(10): 957-960.

    [14] Haddad JJ. On the antioxidant mechanisms of Bcl-2: a retrospective of NF-kappaB signaling and oxidative stress [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2004, 322(2): 355-363.

    [15] Safarzadeh E, Sandoghchian SS, Baradaran B. Herbal medicine as inducers of apoptosis in cancer treatment [J]. Adv Pharm Bull, 2014, 4(Suppl 1): 421-427.

    [16] Chiara F, Rasola A. GSK-3 and mitochondria in cancer cells [J]. Front Oncol, 2013, 3: 16.

    [17] Ban KC, Singh H, Krishnan R, et al. GSK-3beta phosphorylation and alteration of beta-catenin in hepatocellular carcinoma [J]. Cancer Lett, 2003, 199(2): 201-208.

    [18] Shakoori A, Ougolkov A, Yu ZW, et al. Deregulated GSK3beta activity in colorectal cancer: its association with tumor cell survival and proliferation [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 334(4): 1365-1373.

    [19] Dan S, Yoshimi H, Okamura M, et al. Inhibition of PI3K by ZSTK474 suppressed tumor growth not via apoptosis but G0/G1 arrest [J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009, 379(1): 104-109.

    [20] Sokolosky M, Chappell WH, Stadelman K, et al. Inhibition of GSK-3beta activity can result in drug and hormonal resistance and alter sensitivity to targeted therapy in MCF-7 breast cancer cells [J]. Cell Cycle, 2014, 13(5): 820-833.

    [21] Dinamarca MC, Sagal JP, Quintanilla RA, et al. Amyloid-beta-Acetylcholinesterase complexes potentiate neurodegenerative changes induced by the Abeta peptide. Implications for the pathogenesis of Alzheimer’ s disease [J]. Mol Neurodegener, 2010, 5: 4.

    RosiglitazonepromotesapoptosisincoloncancerHT29andHCT116cellsthroughAKT/GSK3βsignallingpathway

    ZHANG Qi1, YANG Guang-hua1, GE Zhi-peng1, DING Jia-shan2, HUANG Zhi-qiang1, ZHEN Yang1, ZHANG Guo-zhi1, WANG Chang-you1*

    (1.Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Tangshan 063000, China; 2.Clinical Medical School of North China University of Science and Technology, Tangshan 063000)

    ObjectiveTo investigate the effect of rosiglitazone on the proliferation and apoptosis of colon cancer cells and the changes in the AKT/GSK3β signaling pathway.MethodsDifferent concentrations of rosiglitazone (20.0 μmol/L, 40.0 μmol/L, 80.0 μmol/L) were used to treat colon cancer HT29 cells and HCT116 cells. Cell proliferation was detected by MTT assay. Annexin V FITC/PI cell death detection kit was used to test the cell apoptosis rate. The expression of apoptotic protein Bcl-2, Bax and Akt, GSK3β were detected by Western blot.ResultsDifferent concentrations of rosiglitazone had different effect on the proliferation of colon cancer cells compared with the blank control group, and showed a dose dependence (P< 0.01). With the increase of rosiglitazone dose, the apoptosis-inducing effect was increased dose-dependently (P< 0.01). When the cells were treated with rosiglitazone for 48 h, the expressions of Bcl-2/Bax, p-GSK3β, and p-Akt were significantly decreased compared with the blank control group (P< 0.01), but the expression level of Akt and GSK3β was not significantly different compared with the blank control group (P> 0.05).ConclusionsRosiglitazone significantly induces apoptosis and inhibits the proliferation of HT29 cells. It may be via inhibiting Akt/GSK3β signaling pathway and change the ratio of Bcl-2/Bax.

    Rosiglitazone; Colon cancer; Apoptosis; Bcl-2; Bax; Akt; GSK3β

    2017年政府資助省級(jí)臨床醫(yī)學(xué)優(yōu)秀人才項(xiàng)目;中國煤炭工業(yè)協(xié)會(huì)2017年度科學(xué)技術(shù)研究指導(dǎo)性計(jì)劃項(xiàng)目(MTKJ2017-331)。

    張琪(1992-),男,碩士研究生,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail: izhangqi1004@163.com

    王長友(1971-),男,教授,碩士生,研究方向:胃腸道腫瘤。E-mail: fhbj-2004@163.com

    R-33

    A

    1671-7856(2017) 12-0056-05

    10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.010

    猜你喜歡
    列酮羅格空白對照
    曾擔(dān)任過12年國際奧委會(huì)主席的雅克·羅格逝世,享年79歲
    英語文摘(2021年11期)2021-12-31 03:25:24
    例析陰性對照與陽性對照在高中生物實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用
    你看到的是美,我看到的是責(zé)任
    過表達(dá)H3K9me3去甲基化酶對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響(內(nèi)文第 96 ~ 101 頁)圖版
    Identifying vital edges in Chinese air route network via memetic algorithm
    對不起
    金山(2016年9期)2016-10-12 14:22:23
    吡格列酮對肥胖小鼠血清抵抗素的影響及其對腎臟的作用
    吡格列酮對肥胖小鼠腎臟中TNF-α表達(dá)的影響
    8 種外源激素對當(dāng)歸抽薹及產(chǎn)量的影響
    吡格列酮對膀胱癌患者機(jī)體炎癥因子抑制作用的分析
    伊人久久精品亚洲午夜| 日韩精品青青久久久久久| 国产真实伦视频高清在线观看 | 窝窝影院91人妻| av福利片在线观看| 色噜噜av男人的天堂激情| 露出奶头的视频| 精品一区二区三区视频在线| 真实男女啪啪啪动态图| 国产一区二区三区视频了| 国产精品久久久久久精品电影| 搡老妇女老女人老熟妇| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久久中文| 一进一出抽搐gif免费好疼| 91麻豆精品激情在线观看国产| 日韩av在线大香蕉| 午夜福利成人在线免费观看| 国语自产精品视频在线第100页| 午夜免费成人在线视频| 日韩欧美免费精品| 亚洲一区高清亚洲精品| 亚洲精华国产精华液的使用体验 | 99视频精品全部免费 在线| 少妇丰满av| av在线天堂中文字幕| 一进一出抽搐动态| 在线观看舔阴道视频| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩精品青青久久久久久| 国产一区二区在线av高清观看| 亚洲最大成人手机在线| 免费人成在线观看视频色| 身体一侧抽搐| 十八禁网站免费在线| 午夜免费激情av| 99久久成人亚洲精品观看| 一个人看的www免费观看视频| 午夜福利欧美成人| 狠狠狠狠99中文字幕| 成人二区视频| 欧美不卡视频在线免费观看| 香蕉av资源在线| 亚洲五月天丁香| 亚洲不卡免费看| 欧美不卡视频在线免费观看| 一进一出好大好爽视频| 在现免费观看毛片| 窝窝影院91人妻| 国产爱豆传媒在线观看| 听说在线观看完整版免费高清| 午夜激情欧美在线| 国产探花极品一区二区| 午夜a级毛片| 男女视频在线观看网站免费| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲久久久久久中文字幕| 深爱激情五月婷婷| 听说在线观看完整版免费高清| 少妇人妻精品综合一区二区 | 欧美成人a在线观看| 亚洲av电影不卡..在线观看| 国产熟女欧美一区二区| 有码 亚洲区| 人妻少妇偷人精品九色| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲成人精品中文字幕电影| 欧美在线一区亚洲| 国产色爽女视频免费观看| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲国产欧美人成| 国产精品伦人一区二区| 亚洲最大成人中文| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 97热精品久久久久久| 国产av一区在线观看免费| 精品不卡国产一区二区三区| 国产成人福利小说| 国产成人aa在线观看| 中文字幕高清在线视频| 色噜噜av男人的天堂激情| 天天躁日日操中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| 欧美区成人在线视频| 日韩欧美三级三区| 午夜激情福利司机影院| 看免费成人av毛片| 91麻豆精品激情在线观看国产| 毛片女人毛片| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 久久欧美精品欧美久久欧美| 欧美激情在线99| 九九爱精品视频在线观看| 国产精品亚洲一级av第二区| 国产一区二区亚洲精品在线观看| 女的被弄到高潮叫床怎么办 | 久久久久九九精品影院| 如何舔出高潮| 99久久精品国产国产毛片| 久久人人爽人人爽人人片va| 久久久久久大精品| 特大巨黑吊av在线直播| 国产熟女欧美一区二区| 黄色视频,在线免费观看| 男人狂女人下面高潮的视频| 熟女电影av网| 欧美不卡视频在线免费观看| 91av网一区二区| 久久亚洲真实| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 此物有八面人人有两片| 天天躁日日操中文字幕| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 婷婷精品国产亚洲av在线| 免费大片18禁| 老女人水多毛片| 成人国产综合亚洲| 国内精品一区二区在线观看| 精品久久久久久成人av| 日韩欧美在线乱码| 国产午夜福利久久久久久| 日韩精品有码人妻一区| 色噜噜av男人的天堂激情| 久久久成人免费电影| 五月玫瑰六月丁香| 成人av在线播放网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 成人国产麻豆网| 亚洲精品久久国产高清桃花| 欧美潮喷喷水| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 成人无遮挡网站| 观看免费一级毛片| 午夜影院日韩av| 一个人观看的视频www高清免费观看| 99久久成人亚洲精品观看| 国产精品一区二区性色av| 丰满乱子伦码专区| 日本三级黄在线观看| 日本黄大片高清| 最近视频中文字幕2019在线8| 久久草成人影院| 亚洲av二区三区四区| 日本精品一区二区三区蜜桃| 免费看日本二区| 欧美最新免费一区二区三区| 九九热线精品视视频播放| 极品教师在线视频| 国产免费一级a男人的天堂| 丰满乱子伦码专区| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 我的老师免费观看完整版| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 蜜桃亚洲精品一区二区三区| 12—13女人毛片做爰片一| 国产精品自产拍在线观看55亚洲| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 99久久久亚洲精品蜜臀av| 俄罗斯特黄特色一大片| 天堂网av新在线| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 日本 欧美在线| 成人综合一区亚洲| 精品国产三级普通话版| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 国国产精品蜜臀av免费| 国产v大片淫在线免费观看| 一级黄色大片毛片| 有码 亚洲区| 国产v大片淫在线免费观看| 在线天堂最新版资源| a级毛片a级免费在线| 成人亚洲精品av一区二区| 成年女人看的毛片在线观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久久国产精品人妻蜜桃| 婷婷色综合大香蕉| 精品一区二区三区视频在线| 国语自产精品视频在线第100页| 长腿黑丝高跟| 别揉我奶头 嗯啊视频| 免费在线观看影片大全网站| а√天堂www在线а√下载| 国产aⅴ精品一区二区三区波| 日本免费一区二区三区高清不卡| 午夜福利在线观看吧| 欧美潮喷喷水| 国产私拍福利视频在线观看| 免费看日本二区| 寂寞人妻少妇视频99o| 国产精品女同一区二区软件| 在线观看人妻少妇| 日本色播在线视频| 51国产日韩欧美| 免费少妇av软件| 国产乱人偷精品视频| 国产片特级美女逼逼视频| 婷婷色av中文字幕| 欧美日本视频| 国产成人免费观看mmmm| 国产精品久久久久久精品古装| 国产熟女欧美一区二区| 久久97久久精品| 男女无遮挡免费网站观看| 久久国产乱子免费精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 熟女电影av网| 国产成人免费无遮挡视频| h视频一区二区三区| 黄片wwwwww| 在线 av 中文字幕| 亚洲中文av在线| 夫妻午夜视频| 亚洲人成网站高清观看| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 最近的中文字幕免费完整| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 2018国产大陆天天弄谢| 国产 一区 欧美 日韩| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 性色avwww在线观看| 国产精品不卡视频一区二区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 欧美 日韩 精品 国产| 免费观看av网站的网址| 国产精品久久久久久av不卡| 精品少妇黑人巨大在线播放| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| av线在线观看网站| 美女主播在线视频| 久久人人爽人人片av| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 日韩欧美一区视频在线观看 | 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 久久久a久久爽久久v久久| 少妇人妻一区二区三区视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| av福利片在线观看| 久久 成人 亚洲| 99久久人妻综合| 97超碰精品成人国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 国产 一区精品| 久久6这里有精品| 中文字幕亚洲精品专区| 国产有黄有色有爽视频| 欧美日韩精品成人综合77777| 日本-黄色视频高清免费观看| 99热国产这里只有精品6| 一区二区三区四区激情视频| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 亚洲精品自拍成人| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成人二区视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲欧洲日产国产| 人妻系列 视频| 亚洲无线观看免费| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 内地一区二区视频在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久久久亚洲中文字幕| 午夜日本视频在线| 欧美zozozo另类| 久久久a久久爽久久v久久| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久综合国产亚洲精品| 最近2019中文字幕mv第一页| 午夜福利视频精品| 又爽又黄a免费视频| 三级国产精品欧美在线观看| 国产精品国产av在线观看| av播播在线观看一区| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 国产在线男女| 2022亚洲国产成人精品| 91精品国产国语对白视频| 国产成人精品一,二区| 婷婷色麻豆天堂久久| 国产高清有码在线观看视频| 青春草视频在线免费观看| 只有这里有精品99| 男男h啪啪无遮挡| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 国产成人a∨麻豆精品| 嘟嘟电影网在线观看| 老司机影院毛片| 日韩中文字幕视频在线看片 | 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲,欧美,日韩| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品久久久精品久久久| 97超碰精品成人国产| 男女啪啪激烈高潮av片| 视频中文字幕在线观看| 国产精品久久久久久久久免| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一本色道久久久久久精品综合| 水蜜桃什么品种好| 久久亚洲国产成人精品v| 看非洲黑人一级黄片| 毛片女人毛片| 麻豆成人av视频| 99久久中文字幕三级久久日本| 99久久精品热视频| 日韩欧美一区视频在线观看 | 国产色婷婷99| 欧美区成人在线视频| 亚洲成人中文字幕在线播放| 麻豆国产97在线/欧美| 一区二区三区乱码不卡18| 成人特级av手机在线观看| 乱系列少妇在线播放| 在线观看一区二区三区激情| 黄色日韩在线| 美女主播在线视频| 日本爱情动作片www.在线观看| 免费看日本二区| 久久精品人妻少妇| 下体分泌物呈黄色| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 亚洲,一卡二卡三卡| 精品一区二区三卡| 777米奇影视久久| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲国产av新网站| 欧美极品一区二区三区四区| 国产精品无大码| 少妇 在线观看| 日本黄大片高清| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 精品久久久久久久末码| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 激情五月婷婷亚洲| 久久婷婷青草| 国产男女内射视频| 少妇精品久久久久久久| 亚洲综合色惰| 精品人妻一区二区三区麻豆| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 日本黄色片子视频| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产老妇伦熟女老妇高清| 大陆偷拍与自拍| 一二三四中文在线观看免费高清| 日韩国内少妇激情av| 久久久久人妻精品一区果冻| 蜜桃在线观看..| 色哟哟·www| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲成人一二三区av| 午夜福利在线在线| 少妇熟女欧美另类| 这个男人来自地球电影免费观看 | 一本久久精品| 色网站视频免费| 欧美成人a在线观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 一区二区三区四区激情视频| 九草在线视频观看| 欧美成人a在线观看| 女性生殖器流出的白浆| 午夜福利视频精品| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 国产av国产精品国产| 亚洲在久久综合| 成人影院久久| 尾随美女入室| 中国国产av一级| 欧美日本视频| 一级毛片久久久久久久久女| 99国产精品免费福利视频| 观看美女的网站| 久久av网站| 我要看日韩黄色一级片| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片| 久久综合国产亚洲精品| 内射极品少妇av片p| 18禁在线播放成人免费| 亚洲久久久国产精品| 美女xxoo啪啪120秒动态图| kizo精华| 久久综合国产亚洲精品| 国产成人精品福利久久| 天天躁日日操中文字幕| 国产av精品麻豆| av国产久精品久网站免费入址| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 欧美成人a在线观看| 夫妻性生交免费视频一级片| 性色avwww在线观看| 色网站视频免费| 亚洲欧美清纯卡通| 三级国产精品欧美在线观看| 51国产日韩欧美| 日韩一本色道免费dvd| 水蜜桃什么品种好| 国产精品国产三级专区第一集| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产视频内射| 一区在线观看完整版| 午夜精品国产一区二区电影| 日韩制服骚丝袜av| 最近最新中文字幕大全电影3| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 一个人免费看片子| 国产亚洲欧美精品永久| 少妇的逼水好多| 久久ye,这里只有精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 观看美女的网站| 少妇高潮的动态图| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 黑丝袜美女国产一区| 性色avwww在线观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 精品一区二区三区视频在线| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 观看免费一级毛片| 国产一区亚洲一区在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 五月玫瑰六月丁香| 午夜免费男女啪啪视频观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 国产探花极品一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 三级经典国产精品| 最近手机中文字幕大全| 亚洲精品aⅴ在线观看| 熟女人妻精品中文字幕| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产v大片淫在线免费观看| 日韩伦理黄色片| av线在线观看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 青春草视频在线免费观看| 国国产精品蜜臀av免费| 高清视频免费观看一区二区| 久久国产亚洲av麻豆专区| 色网站视频免费| 老司机影院成人| 三级国产精品欧美在线观看| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 毛片女人毛片| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产成人一精品久久久| av免费在线看不卡| 国产精品国产av在线观看| 久久综合国产亚洲精品| 久久国产精品大桥未久av | 精品一品国产午夜福利视频| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲av成人精品一区久久| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲无线观看免费| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 国产精品一区二区性色av| 欧美xxxx性猛交bbbb| 街头女战士在线观看网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 一本色道久久久久久精品综合| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产高清国产精品国产三级 | 免费观看的影片在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 青春草国产在线视频| 精品久久久久久久久亚洲| 亚洲图色成人| 国产男人的电影天堂91| 熟女av电影| 免费观看无遮挡的男女| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 最近2019中文字幕mv第一页| 哪个播放器可以免费观看大片| 久久精品国产a三级三级三级| 国产亚洲欧美精品永久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 大片免费播放器 马上看| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩一区二区三区影片| 精品国产三级普通话版| 欧美一级a爱片免费观看看| 伦理电影免费视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产高潮美女av| 久久精品久久久久久久性| 亚洲国产精品专区欧美| 另类亚洲欧美激情| 91精品国产国语对白视频| 免费观看在线日韩| 人妻系列 视频| 日韩精品有码人妻一区| 日韩视频在线欧美| 青青草视频在线视频观看| 黄色日韩在线| 久久精品夜色国产| 男女下面进入的视频免费午夜| 日韩视频在线欧美| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产av精品麻豆| 亚洲欧美日韩另类电影网站 | 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 中文字幕久久专区| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 人妻一区二区av| 欧美成人一区二区免费高清观看| 高清黄色对白视频在线免费看 | 一个人看视频在线观看www免费| 能在线免费看毛片的网站| 久久热精品热| 丝瓜视频免费看黄片| 国产精品三级大全| 黄色一级大片看看| 男人爽女人下面视频在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 日日啪夜夜爽| 伦理电影免费视频| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲欧美日韩无卡精品| 丝瓜视频免费看黄片| 欧美国产精品一级二级三级 | 99国产精品免费福利视频| 国产精品久久久久成人av| av在线观看视频网站免费| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 97在线视频观看| 黄色一级大片看看| 99久国产av精品国产电影| 2022亚洲国产成人精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人免费观看mmmm| 在线观看一区二区三区激情| 2018国产大陆天天弄谢| 国产 一区 欧美 日韩| 99热国产这里只有精品6| 久热久热在线精品观看| 黄片wwwwww| 免费黄网站久久成人精品| 亚洲综合色惰| h视频一区二区三区| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 国产精品.久久久| 国产精品熟女久久久久浪| 三级国产精品欧美在线观看| 久久精品国产亚洲网站| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美日韩亚洲高清精品| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲在久久综合| 97热精品久久久久久| 成年美女黄网站色视频大全免费 | 日本wwww免费看| 国产爽快片一区二区三区| 少妇丰满av| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 亚洲自偷自拍三级| 在线观看人妻少妇| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 麻豆国产97在线/欧美| 亚洲经典国产精华液单| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲伊人久久精品综合| 麻豆成人av视频| 大香蕉97超碰在线| 亚洲天堂av无毛| 亚洲三级黄色毛片| 一二三四中文在线观看免费高清| 亚洲精品亚洲一区二区| 丝袜喷水一区| 观看美女的网站| 男的添女的下面高潮视频| 成年av动漫网址| av一本久久久久| 大陆偷拍与自拍| 成人二区视频| 亚洲欧洲日产国产| .国产精品久久| 干丝袜人妻中文字幕| 777米奇影视久久| 一个人看的www免费观看视频| 国产中年淑女户外野战色| 久久久久视频综合| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 免费黄色在线免费观看| 高清日韩中文字幕在线| 亚洲久久久国产精品| 精品人妻熟女av久视频| 精品久久久久久电影网| 欧美日本视频| 久久久久网色| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 精品一品国产午夜福利视频| 天美传媒精品一区二区| 大陆偷拍与自拍| 多毛熟女@视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 欧美区成人在线视频| 久久国内精品自在自线图片| 日本免费在线观看一区|