水貂阿留申病毒、腸炎病毒與犬瘟熱病毒多 重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

馬 芹，王元智，閆文卓，趙麗麗，陳洪巖，陸濤峰

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 100193)

水貂阿留申病毒、腸炎病毒與犬瘟熱病毒多 重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

馬 芹，王元智，閆文卓，趙麗麗，陳洪巖，陸濤峰*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，黑龍江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 100193)

研究報(bào)告

目的水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響水貂健康的三大疫病，擬建立一種可同時(shí)檢測(cè)三種病毒的多重PCR檢測(cè)方法。方法針對(duì)三種病毒基因保守區(qū)分別設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，對(duì)貂阿留申病毒(ADV)和水貂腸炎病毒(MEV)的DNA模板和犬瘟熱病毒(CDV)的RNA模板進(jìn)行了多重PCR擴(kuò)增和擴(kuò)增條件優(yōu)化。結(jié)果PCR可同時(shí)擴(kuò)增出601 bp(ADV)、205 bp(MEV)和451 bp(CDV)的特異性目的條帶，敏感性試驗(yàn)表明最低核酸檢出量為ADV 每微升2.67×104拷貝、MEV 每微升3.02×104拷貝和CDV每微升1.72×105拷貝。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果表明多重PCR和單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致。結(jié)論建立的多重PCR檢測(cè)方法可快速地檢測(cè)ADV、MEV和CDV單一或混合感染的臨床樣品。

多重PCR；水貂阿留申病毒；水貂腸炎病毒；犬瘟熱病毒

貂作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，不僅僅具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，同時(shí)貂還是流感病毒、SARS、新城疫病毒、貂圓環(huán)病毒、阿留申病毒以及腸炎病毒的宿主，其中雪貂對(duì)流感病毒十分易感，感染后表現(xiàn)出與人相似的癥狀，還能產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此雪貂可作為研究流感病毒最佳的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。貂的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化養(yǎng)殖必須保證背景清晰，并對(duì)其攜帶的病原體進(jìn)行控制，所以需要建立一系列針對(duì)貂攜帶的病原體的檢測(cè)方法。水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響貂健康的三大疫病[2-4]，給貂養(yǎng)殖造成了極大的影響。水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease parvovirus，ADV，單鏈DNA病毒)引起的一種慢性消耗性疾病，主要特征為漿細(xì)胞增多，γ球蛋白增多和免疫復(fù)合物堆積[5,6]。水貂病毒性腸炎是由水貂腸炎病毒(mink enteritis parvovirus，MEV，單鏈DNA病毒)引起的急性、高度接觸性傳染病，主要臨床癥狀是強(qiáng)烈腹瀉[7,8]。水貂犬瘟熱是由犬瘟熱病毒(canine distempervirus，CDV，單鏈RNA病毒)引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病[9,10]。臨床上這三種病混合感染現(xiàn)象愈發(fā)普遍，本試驗(yàn)擬建立多重PCR檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)ADV、MEV和CDV，為這三種疫病的單一或混合感染進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷。

1 材料和方法

1.1 病毒和樣品

水貂阿留申病毒(ADV)，貂腸炎病毒(MEV)，犬瘟熱病毒(CDV)及犬腺病毒(CAV)由本實(shí)驗(yàn)室保存；臨床病料來自黑龍江省周邊發(fā)病貂場(chǎng)。

1.2 主要試劑與儀器

EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒、EasyScript One-Step RT-PCR SuperMix購自于TransGene Biological Science & Technology；AxyPrep DNA Gel Extraction Kit 購自于Axygen；pMD18-T載體購自寶生物(大連)工程有限公司；PCR儀購于Bio-Rad；電泳儀購于北京市六一儀器廠；凝膠成像分析系統(tǒng)購于Sagecreation；其他常規(guī)試劑為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 引物的設(shè)計(jì)

依據(jù)GenBank收錄的ADV、MEV、CDV序列，根據(jù)各自保守序列應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)三對(duì)特異性引物，均由哈爾濱博仕生物技術(shù)有限公司合成，序列如表1。

1.3.2 病毒DNA/RNA的提取

阿留申病毒的DNA、腸炎病毒的DNA及犬瘟熱病毒的RNA模板，按照EasyPure Viral DNA/RNA Kit試劑盒說明書進(jìn)行提取。

1.3.3 PCR擴(kuò)增

利用One-Step RT-PCR試劑盒，以提取的DNA和RNA為模板先進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增，檢測(cè)引物間的特異性。又將三種模板混合，構(gòu)建三重PCR擴(kuò)增體系：R-mix 10 μL，E-mix 1 μL，模板1.5 μL，引物F各0.5 μL，引物R各0.5 μL，ddH2O 4.5 μL。擴(kuò)增條件為：45℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸 45 s，40個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min。

1.3.4 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物，計(jì)算Tm=(A+T)×2+(G+C)×4，再根據(jù)實(shí)際情況，設(shè)定溫度梯度PCR反應(yīng)(梯度為58℃，57℃，56℃，55℃，54℃)，摸索合適的退火溫度。將三對(duì)引物等量混合，分別加入2、1.5、1、0.5 μL進(jìn)行PCR擴(kuò)增，摸索合適的引物濃度，確定最佳的多重PCR擴(kuò)增條件。

1.3.5 特異性試驗(yàn)

利用上述最佳多重PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件，對(duì)水貂阿留申病毒、貂腸炎病毒、犬瘟熱病毒及犬腺病毒樣品進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證多重PCR擴(kuò)增的特異性。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

注:A、B和C分別為ADV、CDV和MEV的PCR擴(kuò)增結(jié)果；泳道1為陰性對(duì)照； M為DL 2000 marker；泳道2～4分別為MEV、CDV和ADV。圖1 單一PCR擴(kuò)增結(jié)果Note.A,B,C were the amplification products of ADV, CDV and MEV PCR, respectively. Line 1 was negative control. M was DL 2000 marker. Lines 2-4 were MEV, CDV and ADV, respectively.Fig.1 Amplification products of single PCR test

1.3.6 敏感性試驗(yàn)

將ADV、MEV、CDV擴(kuò)增產(chǎn)物(片段分別為601 bp、205 bp和451 bp)與pMD18-T載體連接構(gòu)建陽性質(zhì)粒，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度并換算成質(zhì)粒拷貝數(shù)。將三種陽性質(zhì)粒等量混合，并進(jìn)行10倍系列稀釋，利用多重PCR進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)方法的靈敏性。

1.3.7 臨床樣品的檢測(cè)

利用構(gòu)建的多重PCR方法，對(duì)黑龍江省周邊貂場(chǎng)疑似水貂阿留申病、貂病毒性腸炎和犬瘟熱感染的10份病料進(jìn)行PCR檢測(cè)，并與單一PCR檢測(cè)結(jié)果比較。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增

單一和多重PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，三對(duì)引物分別擴(kuò)增出各自的目的條帶，即ADV為601 bp，MEV為205 bp，CDV為451 bp(圖1)，無擴(kuò)增交叉現(xiàn)象，多重PCR能同時(shí)擴(kuò)增出三條片段大小差異明顯的條帶，與單一PCR擴(kuò)增片段大小一致，不存在引物干擾現(xiàn)象(圖2)，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增產(chǎn)物為三種病毒的特異性片段。

2.2 多重PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化

通過設(shè)置不同的退火溫度，優(yōu)化多重PCR擴(kuò)增條件，結(jié)果表明，在58℃、57℃、56℃、55℃和54℃溫度下均能擴(kuò)增出3條目的條帶，但當(dāng)退火溫度設(shè)為55℃時(shí)，擴(kuò)增條帶最亮。通過加入不同體積的引物，優(yōu)化多重PCR擴(kuò)增條件，結(jié)果表明，在2 μL和1.5 μL引物下能擴(kuò)增出3條目的條帶，1 μL的引物不能擴(kuò)增出MEV目的條帶，0.5 μL的引物不能擴(kuò)增，當(dāng)加入1.5 μL體積的引物時(shí)，多重PCR擴(kuò)增結(jié)果最佳(圖3)。在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳下擴(kuò)增條帶效果最佳。

注：泳道1～4分別為ADV、CDV、MEV、ADV+CDV+MEV；泳道5為5:陰性對(duì)照；M為DL 2000 Marker。圖2 三重PCR擴(kuò)增結(jié)果Note.Line 1-4 was ADV, CDV, MEV, and ADV+CDV+MEV, respectively. Line 5 was the negative control; M was the DL 2000 marker.Fig.2 Amplification products of the multiplex PCR test

2.3 特異性試驗(yàn)

在最佳的多重PCR擴(kuò)增條件下，只能對(duì)含有ADV、CDV及MEV模板的樣品擴(kuò)增出601 bp、451 bp、205 bp條帶，CAV樣品未擴(kuò)增出目的條帶(圖4)。

2.4 敏感性試驗(yàn)

將ADV、MEV、CDV與pMD18-T載體構(gòu)建的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序和序列比對(duì)分析，表明成功構(gòu)建陽性質(zhì)粒。利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒濃度并換算成拷貝數(shù)，ADV的拷貝數(shù)為每微升2.67×1010個(gè)，MEV的拷貝數(shù)為每微升3.02×1010個(gè)，CDV的拷貝數(shù)為每微升1.72×1010個(gè)。將混合的模板進(jìn)行10倍系列稀釋，取不同濃度模板1.5 μL進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，結(jié)果是拷貝數(shù)為每微升105個(gè)時(shí)能同時(shí)擴(kuò)增出三條目的條帶，拷貝數(shù)為每微升104個(gè)倍時(shí)只能擴(kuò)增出ADV和MEV，不能擴(kuò)增出CDV，拷貝數(shù)為每微升103個(gè)時(shí)不能擴(kuò)增出目的條帶(圖4)。多重PCR最低檢測(cè)到ADV 每微升2.67×104拷貝、MEV每微升3.02×104拷貝和CDV 每微升1.72×105拷貝。

2.5 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)來自黑龍江省周邊貂場(chǎng)的10份病貂樣品進(jìn)行多重PCR和單一PCR檢測(cè)，(圖5)，兩種PCR檢測(cè)結(jié)果均發(fā)現(xiàn)ADV感染病例有6例，MEV感染病例有5例，CDV感染病例有4例，表明多重PCR 與單一PCR檢測(cè)結(jié)果一致，可以用于臨床樣品檢測(cè)。另外，多重PCR檢測(cè)結(jié)果顯示三重感染率為20%，ADV和MEV感染率超過50%，臨床ADV、MEV和CDV混合感染較嚴(yán)重。

注：A為特異性分析；B為敏感性分析；泳道2、12為陰性對(duì)照；M為DL 2000 marker；泳道1、3分別為ADV+CDV+MEV、CAV；泳道4～11陽性質(zhì)粒濃度分別為每微升107、106、105、104、103、102、101、100拷貝。圖4 特異性和敏感性分析Note.A,specificity analysis；B, sensitivity analysis；Lines 2 and 12 were negative control. M, DL 2000 marker. Lines 1 and 3 were ADV+CDV+MEV and CAV, respectively. Lines 4-11 were different concentrations of the positive recombinant plasmids at 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, and 100 copies/μL.Fig.4 Specificity and sensitivity analysis

注：泳道1～10分別為臨床樣品1～10；M為DL 2000 Marker。圖5 臨床樣品檢測(cè)Note.Lines 1-10 were clinical samples 1-10. M was DL 2000 marker.Fig.5 Detection of the clinical samples

3 討論

多重PCR反應(yīng)體系較為特殊，需在同一個(gè)反應(yīng)條件和反應(yīng)體系下加入多個(gè)模板和多對(duì)引物，因此擴(kuò)增條件要求較高，需摸索最佳的擴(kuò)增條件，以提高擴(kuò)增反應(yīng)的效率。影響擴(kuò)增效率的主要因素有引物和退火溫度[11,12]等。在引物方面，需注意以下幾點(diǎn)：(1)引物間不存在互補(bǔ)結(jié)構(gòu)及發(fā)卡結(jié)構(gòu)[13]，排除引物干擾現(xiàn)象，提高引物的特異性擴(kuò)增；(2)多條擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小差異明顯，在瓊脂糖凝膠電泳中可明顯區(qū)分；(3)引物間的Tm值和GC%含量相近，保證在同一退火溫度下能同時(shí)擴(kuò)增出多條產(chǎn)物；(4)多重PCR擴(kuò)增體系內(nèi)，引物濃度直接影響擴(kuò)增的結(jié)果，有必要設(shè)立引物濃度梯度摸索合適的引物濃度。在擴(kuò)增溫度方面，退火溫度對(duì)擴(kuò)增結(jié)果影響較大，需設(shè)立溫度梯度確定最佳的擴(kuò)增條件。

水貂阿留申病、病毒性腸炎與犬瘟熱并稱影響水貂健康的三大疫病，臨床上多為混合感染[2,14]，其中水貂阿留申病毒和病毒性腸炎為DNA病毒，而犬瘟熱病毒為RNA病毒，由于三種病毒類型不一致，對(duì)多重PCR方法的構(gòu)建要求較高。本試驗(yàn)采用了DNA/RNA提取試劑盒和一步法擴(kuò)增試劑盒，將DNA和RNA模板同時(shí)在一個(gè)擴(kuò)增體系內(nèi)擴(kuò)增，縮短了樣品處理和擴(kuò)增的時(shí)間，可更快地獲取到檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果及時(shí)地采取防控措施。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)的三對(duì)引物在擴(kuò)增過程中不存在引物干擾現(xiàn)象，可同時(shí)擴(kuò)增出三條目的片段，最佳的退火溫度為55℃；最佳引物體積為1.5 μL；三重PCR敏感性試驗(yàn)表明可檢測(cè)到每微升2.67×104拷貝的阿留申病毒、每微升3.02×104拷貝的水貂腸炎病毒和每微升1.72×105拷貝的犬瘟熱病毒，與杜偉雄[15]的水貂阿留申病毒的敏感性檢測(cè)相比，敏感度提高了10倍。

多重PCR和單一PCR都具有相當(dāng)高的敏感性，可以檢測(cè)出痕量的核酸模板。對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物貂的常規(guī)病原檢測(cè)，本實(shí)驗(yàn)建立的多重PCR可同時(shí)檢測(cè)ADV、MEV及CDV三種病原，與單一PCR相比，大大降低了工作量，節(jié)約了檢測(cè)成本，可更快地給出檢測(cè)結(jié)果，及時(shí)采取相應(yīng)的防治措施。有研究[16]報(bào)道多重PCR的靈敏度有所下降，但足以達(dá)到檢測(cè)的要求。本實(shí)驗(yàn)所建立的三重PCR可在一次反應(yīng)中對(duì)疑似ADV、MEV及CDV感染的水貂進(jìn)行分子

生物學(xué)診斷，且快速、特異、簡(jiǎn)便和靈敏，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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EstablishmentandapplicationofamultiplexPCRassayfordetectionofAleutiandiseaseparvovirus,enteritisparvovirusandcaninedistempervirusinthemink

MA Qin， WANG Yuan-zhi， YAN Wen-zhuo， ZHAO Li-li， CHEN Hong-yan， LU Tao-feng*

(Harbin Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Laboratory Animal and Comprative Medicine,Harbin 100193, China)

ObjectiveAleutian disease, mink enteritis and canine distemper are the three major diseases affecting health of mink. This study intends to establish a multiplex PCR assay for simultaneously detecting of these three viruses.MethodsAccording to the conservative sequences reported in GenBank, three pairs of specific primers were designed to amplify the DNA templates of Aleutian mink disease parvovirus (ADV), mink enteritis parvovirus (MEV), and RNA templates of canine distemper virus (CDV), and optimized the amplifying conditions.ResultsThe specific objective strips of 601 bp (ADV), 205 bp (MEV) and 451 bp (CDV) were amplified simultaneously. The sensitivity test showed that the lowest nucleic acid detection limits were 2.67×104copies per μL for ADV, 3.02×104copies per μL for MEV, and 1.72×105copies per μL for CDV. The results of test of the clinical samples showed that the multiple PCR and single PCR assay were consistent.ConclusionsThe established multiplex PCR assay in this study can be used to rapidly detect the clinical samples of ADV, MEV and CDV single or mixed infections.

Multiplex PCR; Aleutian mink disease parvovirus; Mink enteritis parvovirus; Canine distemper virus

國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015BA107B02)。

馬芹(1990-)，女，碩士研究生，專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail： 542446515@qq.com

陸濤峰(1982-)，男，助理研究員，博士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail： taofenglu@126.com

R-33

A

1671-7856(2017) 12-0097-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.12.017

2017-04-20