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    載脂蛋白J在大鼠頸動脈再狹窄模型中表達規(guī)律的研究

    2017-12-21 05:50:34楊寧蘇斌寇璐董博李楊楊靖宇秦勤
    中國循環(huán)雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:載脂蛋白球囊分化

    楊寧,蘇斌,寇璐,董博,李楊,楊靖宇,秦勤

    基礎(chǔ)與實驗研究

    載脂蛋白J在大鼠頸動脈再狹窄模型中表達規(guī)律的研究

    楊寧,蘇斌,寇璐,董博,李楊,楊靖宇,秦勤

    目的:研究載脂蛋白J(Apo J)在大鼠頸動脈球囊擴張后血管再狹窄模型中的表達規(guī)律。 方法:40只Wistar大鼠隨機分為兩組:實驗組和對照組,每組20只。采用2F Fogarty球囊導(dǎo)管于右側(cè)頸總動脈進行球囊拉傷造模,術(shù)后1、2、3、4周共四個時間點,每組每個時間點5只大鼠。在各時間點,取右側(cè)頸總動脈后,采用蘇木伊紅染色法(HE)觀察其形態(tài)學(xué)變化,免疫組化檢測Apo J蛋白表達,實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)檢測Apo J 基因的表達水平。 結(jié)果:與對照組各時間點相比,實驗組在相同時間點內(nèi)膜增生明顯,Apo J蛋白及基因表達明顯上調(diào)(P<0.05);且實驗組隨著損傷時間延長,內(nèi)膜持續(xù)增生至第四周達到最大值,Apo J蛋白及基因表達在第3周達到高峰,第4周有所下降(P<0.05)。 結(jié)論:Apo J可能與血管損傷及損傷后內(nèi)膜增生密切相關(guān),血管中高表達的Apo J主要來源于損傷組織局部的血管平滑肌細胞(VSMC)合成,推測它可能是損傷后的一種代償,通過抑制VSMC的增值和遷移的活性對再狹窄起保護作用。為尋找新的經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后血管再狹窄的干預(yù)提供新的靶點。

    載脂蛋白J 類;頸動脈狹窄;內(nèi)膜增生

    (Chinese Circulation Journal, 2017,32:1222.)

    冠心病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的重大疾病,其發(fā)病率和死亡率亦逐年攀升[1]。目前,經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)血管成形術(shù)(PTCA)是治療冠心病的有效方法之一,但其再狹窄率高達40%,嚴(yán)重影響了PTCA的遠期療效[2]。 雖然藥物洗脫支架(DES)及聯(lián)合雙聯(lián)抗血小板的藥物治療在某種程度上極大的降低了經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(PCI)后血管再狹窄的發(fā)生[3],但是,DES置入術(shù)后患者再狹窄的發(fā)生率仍高于10%[4]。DES球囊損傷誘導(dǎo)血管平滑肌細胞遷移、增值、基質(zhì)生成及重塑進而導(dǎo)致PCI術(shù)后再狹窄。雖然在預(yù)防PCI術(shù)后血管再狹窄技術(shù)方面已有相關(guān)研究,但并未取得有意義的進展[5],說明PCI術(shù)后再狹窄這一病理生理過程具有復(fù)雜性及挑戰(zhàn)性。載脂蛋白(Apo J)可分為分泌型(s CLU)和核型(n CLU)兩種蛋白[5],主要在肝臟合成,可與高密度脂蛋白、脂質(zhì)、載脂蛋白A、對氧磷酶等多種生物分子相結(jié)合[6],廣泛分布于心臟、腎臟、腦組織等多種組織中,通過促進細胞生存、減少氧化應(yīng)激、促進脂質(zhì)轉(zhuǎn)運[7]、促進泡沫細胞中膽固醇外流[8]等功能發(fā)揮對心血管的保護作用[9]。已有研究報道Apo J參與了動脈粥樣硬化斑塊的內(nèi)中膜及血管成形術(shù)后再狹窄的進程[10],但其在心血管疾病進程中是保護作用還是致病作用尚存在爭議。本研究通過建立Wistar大鼠頸動脈球囊損傷后再狹窄動物模型,檢測Apo J在血管再狹窄進程中不同時間點的表達情況,從而探討Apo J在再狹窄病程中的作用及其可能的機制,為尋找新的PCI術(shù)后再狹窄的干預(yù)靶點提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物與分組:SPF級雄性Wistar大鼠40只,體重350~400 g,由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供。按照隨機數(shù)表法分為實驗組和對照組,每組20只。其中各組再以損傷后的第1、2、3、4周分為四個時間點,每組每個時間點5只。

    1.2 建模方法:所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周。實驗組:手術(shù)當(dāng)天稱重,使用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)進行腹腔注射麻醉。頸部備皮,取頸正中切口約2~3 cm,經(jīng)皮鎖骨下靜脈穿刺(天津市胸科醫(yī)院動物實驗室提供技術(shù)支持)并注射肝素(200 IU/kg)。于原擬定切口切開皮膚,逐層鈍性分離,充分暴露頸內(nèi)動脈、頸外動脈,永久結(jié)扎頸外動脈遠心端,輕微向頭部牽拉血管,用止血夾臨時夾閉頸總動脈近心端及頸內(nèi)動脈起始部。用眼科剪在頸外動脈剪“V”型切口,然后插入2F Fogarty球囊導(dǎo)管(江蘇世泰實驗器材有限公司,中國)約3 cm,給予2~3個大氣壓,輕微回拉球囊至動脈切口處,以出現(xiàn)摩擦感而又能拉動球囊為合適壓力,以此方法反復(fù)損傷3次,撤除2F Fogarty球囊導(dǎo)管,永久結(jié)扎頸外動脈近心端,解除頸總動脈、頸內(nèi)動脈止血夾,觀察頸內(nèi)動脈血流情況,可見明顯搏動表明血流通暢。觀察術(shù)野有無活動性出血,無則逐層縫合傷口,硫酸慶大霉素注射液2萬單位肌肉注射預(yù)防感染。對照組:進行假手術(shù)處理,除不插入2F Fogarty球囊,其他步驟均同實驗組。

    1.3 實驗動物的處死及標(biāo)本獲取:10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉大鼠,將其仰臥固定于動物手術(shù)臺上,鎖骨下靜脈穿刺注射10%氯化鉀溶液2~3 ml處死動物,沿頸正中切口切開皮膚,逐層分離,暴露右側(cè)頸總動脈,并取下頸總動脈全段,剪下大約0.3 cm放入10%中性福爾馬林固定以備蘇木伊紅染色法(HE) 病理檢查,余下血管放入凍存管并放入液氮中速凍,24 h后放入-80℃冰箱中長久保存,為免疫組化和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)備用。本實驗已通過我院動物倫理審查。

    1.4 蘇木伊紅染色觀察頸總動脈血管形態(tài)學(xué)變化:標(biāo)本在10%甲醛溶液中固定3~4 h,進行常規(guī)脫水、石蠟包埋,間斷均勻切片,切片厚度4 μm。HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察血管損傷的情況。

    1.5 免疫組化檢測頸總動脈血管Apo J蛋白的表達:采用免疫組化S-P二步法檢測頸總動脈中是否有Apo J蛋白表達。常規(guī)切片、烘片、脫蠟、滅活內(nèi)源性過氧化物酶、蒸餾水沖洗及抗原修復(fù)、一抗、二抗孵育、最后二氨基聯(lián)苯胺(DAB)方法顯色。一抗(兔抗人Apo J IgG多克隆抗體,美國Santa Cruz公司)。二抗(快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物,福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)。所有照片使用IS Capture系統(tǒng)拍攝并保存,使用Image Pro Plus 6.0進行數(shù)據(jù)采集及分析。使用平均光密度值(MOD)對Apo J蛋白的陽性表達做半定量分析。在400倍光鏡下進行測量,選取血管的中膜及內(nèi)膜為待測區(qū)域,通過測量獲得待測區(qū)域的面積(Area)及積分光密度值(IOD),以平均光密度值表示Apo J蛋白表達的強弱。MOD計算公式如下:MOD=累積光密度值(sum of IOD)/累積面積(sum of Area)。

    1.6 qRT-PCR檢測頸總動脈血管中Apo J mRNA的表達:用Trizol一步法提取RNA,然后按試劑盒說明書操作進行逆轉(zhuǎn)錄操作。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃1 h,95℃ 5 min,4℃ 10 min。Apo J引物上游 5’-TAA GGA GAT TCA GAA CGC CG-3’, 下 游 5’-ATC CCT GGT GTC ATC TAG AG-3’;GAPDH 引物上游5’- GTG ATG CTG GTG CCG AGT AG-3’,下游5’-GGT GGC AGT GAT GGC GTG C-3’。 按 SYBR?Premix Ex Taq?system (Perfect Real -time)試劑盒(日本Takara公司)進行Real-time PCR操作。在ABI7500實時定量PCR儀中進行擴增(美國Applied Biosystems公司)。擴增條件:預(yù)變性95℃ 30 s,變性 95℃5 s,退火60℃ 34 s,進行40個循環(huán),每個樣本設(shè)置3個重復(fù)。2-ΔΔCt的分析方法比較各組mRNA的差異。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法:使用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,兩組間比較使用獨立樣本t檢驗,組內(nèi)比較采用重復(fù)測量資料的方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 建模存活率及成功率:實驗組20只大鼠中1只因術(shù)中操作不慎壓迫氣道致窒息死亡,1只因血管切口剪開大小不當(dāng),無法插入球囊導(dǎo)管,造模失敗,1只因動脈出血于術(shù)后12 h死亡,最終存活大鼠17只,存活率85%。實驗組病理檢查均出現(xiàn)內(nèi)膜增生增厚,成活的大鼠均造模成功。平均手術(shù)時間(34.19±6.09)min。

    2.2 形態(tài)學(xué)檢查結(jié)果:

    2.2.1 各組血管切片形態(tài)學(xué)顯微鏡檢測及大鼠頸總動脈內(nèi)膜/中膜面積比(I/M)的比較結(jié)果:血管切片形態(tài)學(xué)顯微鏡檢測詳見圖1~5。大鼠頸總動脈I/M的比較(表1),對照組的I/M接近于0。實驗組1、2、3、4周的I/M較同時間點的對照組均升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。實驗組損傷后各時間點間的I/M逐漸升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.2.2 各組大鼠頸總動脈Apo J蛋白表達情況:免疫組化實驗結(jié)果顯示Apo J蛋白主要在細胞漿中表達,對照組血管全層中未見Apo J蛋白的表達,實驗組各時間點均可檢測到Apo J表達(圖6)。

    以MOD表示Apo J蛋白表達的情況(表2),對照組的MOD接近于0,實驗組各時間點Apo J蛋白的表達均高于其對照組, 3周Apo J蛋白表達最強, 4周表達強度減弱,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    圖1 ~5 蘇木伊紅染色法染色檢查各組大鼠頸總動脈血管切片形態(tài)意圖

    表1 各組大鼠頸總動脈I/M的比較

    表1 各組大鼠頸總動脈I/M的比較

    注: I/M:總動脈內(nèi)膜/中膜面積比。與實驗組1周比較aP<0.05;與實驗組2周比較 b P<0.05; 與實驗組3周比較 cP<0.05。*:存活大鼠

    表2 各組大鼠勁總動脈Apo J蛋白表達水平

    表2 各組大鼠勁總動脈Apo J蛋白表達水平

    注: Apo J:載脂蛋白J;與實驗組1周比較aP<0.05;與實驗組2周比較bP<0.05; 與實驗組3周比較 cP<0.05。*:存活大鼠

    圖6 免疫組化檢測各組大鼠頸總動脈Apo J蛋白表達情況(x400)

    2.2.3 各組大鼠頸總動脈Apo J mRNA表達情況(表3):與對照組相比,Apo J mRNA在實驗組1周未升高(P>0.05), 2周顯著升高, 3周達到最高,約為對照組的8倍, 4周開始下降,但仍高于對照組,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動脈Apo J mRNA表達水平

    表3 qRT-PCR比較各組大鼠勁總動脈Apo J mRNA表達水平

    注:qRT-PCR:實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);Apo J:載脂蛋白J。與實驗組1周比較aP<0.05;與實驗組2周比較 bP<0.05; 與實驗組3周比較cP<0.05。*:存活大鼠

    3 討論

    目前,大量的研究結(jié)果提示Apo J/CLU可以通過抑制p53和p21的表達,刺激敲除CLU-KO小鼠的血管平滑肌細胞(VSMC)增殖和遷移[11],進而促進PCI術(shù)后血管再狹窄的發(fā)生[12]。而Orlandi等[13]通過誘導(dǎo)Apo J亞型轉(zhuǎn)變的深入研究發(fā)現(xiàn), n CLU對VSMC有促進凋亡、抑制增殖的作用,而Kim等[14]卻提出高表達的s CLU能抑制VSMC的遷移、增殖,及抑制細胞的凋亡,但他們的研究并沒有直接的證實s CLU和n CLU各自對于VSMC的作用。

    VSMC的增殖和遷移是導(dǎo)致PCI術(shù)后再狹窄的主要原因。VSMC又分為分化型(收縮型)和未分化型(合成型)兩種亞型。正常血管壁中的VSMC為分化型,無DNA的合成及增殖和遷移的能力,細胞中富含肌纖維,主要維持血管的彈性和收縮。心肌細胞及骨骼肌細胞一旦分化后就失去增殖的能力,但是VSMC與這些細胞不同,分化型的VSMC在應(yīng)激性刺激的誘導(dǎo)下出現(xiàn)表型轉(zhuǎn)化而變?yōu)槲捶只?。未分化型的VSMC肌纖維的含量較少,結(jié)構(gòu)蛋白少,合成和分泌細胞外基質(zhì)的能力強,有較強的增殖活性和向內(nèi)膜遷移的生物學(xué)特性[15]。VSMC表型的轉(zhuǎn)化使VSMC獲得了增殖和遷移的能力,進而導(dǎo)致了PCI術(shù)后再狹窄的發(fā)生發(fā)展。

    本研究發(fā)現(xiàn)在Wistar大鼠頸動脈球囊損傷術(shù)后,血管內(nèi)膜于第1周時開始出現(xiàn)增生,并于第2周明顯可見大量的VSMC向內(nèi)膜遷移,內(nèi)膜中的VSMC數(shù)量較多,細胞核密集、排列紊亂,提示其轉(zhuǎn)化為增殖活躍狀態(tài)的未分化型,而與之伴隨的是Apo J mRNA的表達水平開始顯著升高,其蛋白質(zhì)的表達水平亦顯著升高。第3周時內(nèi)膜的增生更加明顯,I/M面積比進一步的增大,同時Apo J mRNA及蛋白的表達均達到最高,這提示Apo J的表達與平滑肌細胞的增殖、遷移有密切的關(guān)系。在第4周時血管內(nèi)膜增生達到最大,而在其增生內(nèi)膜的管腔側(cè)仍可發(fā)現(xiàn)未分化型的VSMC,但是其管壁側(cè)的VSMC的排列開始趨向于整齊,多平行于管壁排列,細胞核趨向于成熟且數(shù)目減少,而細胞外基質(zhì)開始增多,表明VSMC再次轉(zhuǎn)化為無內(nèi)分泌及增殖活性的分化型,此時,Apo J mRNA及蛋白的表達水平開始下降,但仍是高于對照組,進一步說明血管增生內(nèi)膜內(nèi)的Apo J表達與未分化型的VSMC密切相關(guān)。

    Apo J是一種應(yīng)激蛋白,多在有損傷、應(yīng)激的情況下表達增加。結(jié)合本研究的結(jié)果,我們認為球囊損傷作為機械刺激,誘導(dǎo)VSMC由分化型向未分化型轉(zhuǎn)變,未分化型的VSMC大量地向內(nèi)膜遷移并增殖,同時合成和分泌大量含Apo J的細胞外基質(zhì)。Apo J表達的持續(xù)增加可能作為一種應(yīng)答機制,反饋性地抑制VSMC的增殖和遷移,隨著VSMC增殖活性的降低,Apo J的表達開始減少。因此,我們進一步推測Apo J有望作為干預(yù)術(shù)后血管再狹窄的一個靶點,通過局部或系統(tǒng)地調(diào)節(jié)Apo J的表達,從而減少血管再狹窄的發(fā)生,但需要進一步的研究來證實這些推測。本研究尚存在一些不足之處,實驗所使用的抗體主要用于檢測s CLU,而未能探討n CLU在再狹窄過程中的變化,因此,針對不同的Apo J蛋白表達在PCI術(shù)后再狹窄進程中的作用及分子機制的研究將是解決PCI術(shù)后再狹窄的關(guān)鍵。

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    Expression Pattern of Apolipoprotein J in Rat’s Model of Carotid Artery Restenosis

    YANG Ning, SU Bin, KOU Lu, DONG Bo, LI Yang, YANG Jing-yu, QIN Qin.
    Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital, Tianjin (300051), China

    QIN Qin, Email: qinqin6351@163.com

    Objective: To study the expression pattern of apolipoprotein J (Apo J) in rat’s model of vascular restenosis after cartid balloon dilation.

    Methods: A total of 40 Wistar rats were randomly divided into 2 groups: Experimental group, the rat’s model of carotid artery injury was established by 2 F Fogarty balloon catheter scratching in right carotid artery and Control group, the rats received sham operation without catheter scratching. n=20 in each group. Right carotid artery tissue was taken at 1, 2, 3, 4 weeks after the operation respectively and 5 rats were used for each time point. The morphological changes were measured by HE staining, protein and gene expressions of Apo J were examined by immunohistochemistry and qRT-PCR.

    Results: Compared with Control group, at each time point Experimental group had obvious intimal hyperplasia and upregulated protein and gene expressions of Apo J, P<0.05. In Experimental group, with prolonged time of injury, consistent endometrial hyperplasia was observed and it reached the maximum at 4 weeks after operation; the peak protein and gene expressions of Apo J was found at 3 weeks after operation, then decreased at certain point at 4 weeks after operation, P<0.05.

    Conclusion: Apo J might be closely related to intimal hyperplasia after vascular injury, high expression of vascular Apo J was mainly derived from vascular smooth muscle cell synthesis, it could be a kind of compensation with protective role and might be used as a new biological target for treating vascular retenosis after percutaneous coronary intervention.

    Apolipoprotein J; Carotid stenosis; Intimal hyperplasia

    天津市衛(wèi)計委重點攻關(guān)項目(13KG131);天津市衛(wèi)計委科技基金重點項目(2015KR07)

    300051 天津市胸科醫(yī)院 心內(nèi)科

    楊寧 主治醫(yī)師 碩士 主要從事冠心病防治的臨床與基礎(chǔ)研究 Email:mengshateng@163.com 通訊作者:秦勤 Email:qinqin6351@163.com

    R541

    A

    1000-3614(2017)12-1222-05

    10.3969/j.issn.1000-3614.2017. 12.019

    2016-12-25)

    (編輯:曹洪紅)

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