• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    血管緊張素Ⅱ與分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在心肌細胞肥大中相關(guān)性研究

    2017-12-21 05:50:34金鑫郭炳彥楊蓉常亮王亞玲苗成龍劉素云張輝李擁軍
    中國循環(huán)雜志 2017年12期
    關(guān)鍵詞:水平

    金鑫,郭炳彥,楊蓉,常亮,王亞玲,苗成龍,劉素云,張輝,李擁軍

    基礎(chǔ)與實驗研究

    血管緊張素Ⅱ與分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在心肌細胞肥大中相關(guān)性研究

    金鑫,郭炳彥,楊蓉,常亮,王亞玲,苗成龍,劉素云,張輝,李擁軍

    目的:探討分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(sFRP5)在心肌細胞肥大中的表達情況及其發(fā)揮的作用。 方法:體外培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞,應用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導心肌細胞肥大。替米沙坦、PD123319分別阻滯血管緊張素1型受體(AT1R)、血管緊張素2型受體(AT2R)的表達,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western bolt)檢測sFRP5、腦利鈉肽(BNP)及腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的表達。 結(jié)果:sFRP5 能夠在心肌細胞中表達。sFRP5 mRNA及蛋白水平、BNP蛋白水平的表達隨Ang Ⅱ干預時間的延長而增加, 48 h達到最高值 (P<0.05)。與Ang Ⅱ(10-6mol/L)組相比,Ang Ⅱ+替米沙坦(10 μmol/L)組sFRP5 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05),Ang Ⅱ +PD123319(10 μmol/L)組 sFRP5 mRNA 和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+ sFRP5(0 ng/ml)組比較,Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)組及Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組BNP蛋白及TNF-a的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論:在Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大過程中,主要通過血管緊張素Ⅱ型受體上調(diào)sFRP5的表達,且sFRP5在抑制心肌細胞肥大中發(fā)揮作用。

    血管緊張素Ⅱ;心肌細胞肥大;脂肪細胞因子

    (Chinese Circulation Journal, 2017,32:1227.)

    心肌肥厚是由細胞外刺激信號作用于細胞并通過一系列信號轉(zhuǎn)導通路引起細胞內(nèi)基因表達的活化與失活,并最終引起細胞表型改變的過程,主要表現(xiàn)為心肌細胞的肥大和間質(zhì)成分的改變[1]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)通常被選擇作為心肌細胞肥大的誘導劑,直接導致心肌肥厚[2]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP) 5 屬于分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP)家族中的一員,是一種新近發(fā)現(xiàn)的與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)的脂肪細胞因子和抗炎因子[3,4]。已有研究證實,sFRP1~4在心肌組織中表達, sFRP3、4在心肌肥厚中表達增加[5]。本研究探討sFRP5在心肌細胞肥大中的表達情況及其發(fā)揮的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料:出生2~3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠(購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(DMEM)培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、D-Hanks、Ⅱ型膠原酶干粉、胰蛋白酶干粉及胎牛血清購自Sigma公司(圣路易斯,美國),Ang Ⅱ、sFRP5抗體、替米沙坦、PD123319系Gibico產(chǎn)品(加利福尼亞,美國)。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO),Trizol試劑, 多聚酶鏈反應(PCR)擴增劑、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)檢測試劑盒購自Promega公司(麥迪遜,美國),腦利鈉肽(BNP)、腫瘤壞死因子(TNF-a)兔抗鼠抗體、二抗IRDye 700 DX購自GIBCO公司(比靈斯,美國)。5-溴脫尿苷(5-BrdU)購自Santa Cruz公司(美國)。

    1.2 心肌細胞原代培養(yǎng):將SD乳鼠用75%醫(yī)用酒精消毒,持眼科剪沿劍突下剪開肋骨,暴露心臟,剪取左心室心尖部分,置入預冷的D-Hanks清洗液中,反復清洗3遍;后將心肌組織放入小培養(yǎng)瓶中,應用另一眼科剪剪碎至1 m3左右;加入4 ml預先配好的混合消化酶液,放入無菌小轉(zhuǎn)子,至磁力攪拌器上,在37℃恒溫條件下進行消化,攪拌5 min,棄上清;消化2次后,吸上清液于10 ml離心管中,加入含有10%小牛血清的低糖DMEM 4 ml終止消化,置于離心機中以112 g離心,棄上清,加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基4 ml,離心,再棄上清,最后加入含有10%小牛血清的低糖DMEM 2 ml,重懸后備用;按上述方法重復消化,共約10~12次,直到完全消化;收集心肌細胞,用200目無菌細胞篩過濾并移入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中,溫箱中孵育2 h。

    1.3 心肌細胞的純化及培養(yǎng):吸取心肌細胞懸浮液,在另一培養(yǎng)皿中進行細胞計數(shù);加入終濃度為0.1 mmol/L的5-BrdU,后按106/ml的密度將心肌細胞懸液接種于六孔板。于孵育箱中培養(yǎng)48 h;后換為無血清、無5-BrdU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。

    1.4 實驗分組:干預藥物均由無菌過濾器過濾除菌后加入心肌細胞。(1)對照組:正常心肌細胞不加任何干預因素;(2)不同濃度的Ang Ⅱ(10-5~-8mo1/L)、不同作用時間(12、25、48和72 h)對sFRP5 mRNA和蛋白水平及BNP蛋白表達的影響:Ang Ⅱ組:Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用心肌細胞48 h刺激心肌細胞肥大;(3)Ang Ⅱ 受體阻滯劑對心肌細胞sFRP5和BNP表達的影響:①Ang Ⅱ + 替米沙坦組及Ang Ⅱ+ PD123319組:分別用AT1R阻滯劑替米沙坦(10 μmol/L)及 AT2R 阻滯劑 PD123319(10 μmol/L)干預心肌細胞30 min,后用Ang Ⅱ (10-6mol/L)刺激48 h;②替米沙坦組及PD123319組:即正常心肌細胞分別給予替米沙坦(10 μmol/L)及 PD123319(10 μmol/L);(4)不同濃度的sFRP5對心肌細胞肥大中BNP和TNF- a表達的影響:分別用不同濃度的sFRP5(0、10和100 ng/ml)干預心肌細胞4 h后,用AngⅡ(10-6mol/L)刺激48 h。分為Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)組,Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)組及Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組,每天加藥一次,每2天換液一次。

    1.5 噻唑蘭法檢測心肌細胞活力:心肌細胞以1×105/ml的密度種植于96孔板中,處理心肌細胞后,加入5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT ,商品名:噻唑蘭)溶液20 μl于培養(yǎng)基中,在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h,之后每孔加入150μl的DMSO,并震蕩10 min,將96孔細胞培養(yǎng)板置入全自動酶標儀,在490 nm波長處測定其光吸收值。

    1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測sFRP5、BNP等mRNA的表達:采取Trizol法提取心肌細胞總RNA,取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后取2 μl行PCR反應。sFRP5的上游引物5'-ACTTTGAATGCCGTGAA-3',下游引物5'-AATCCAGTTGGTGAGCC-3',擴增片段長度為多少113 bp,PCR反應體系20 μl,反應條件為94℃變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán),72 ℃延伸7 min,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的上游引物5'-GAGGCTCTCTTCCAGCCTTC-3',下游引物5'-AGGGTGTAAAAGCAGCTCA-3',PCR 反應體系20μl,反應條件為 94 ℃變性 5 min,94 ℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,28個循環(huán),72℃延伸7 min,得到的PCR產(chǎn)物2%的瓊脂糖電泳并用成像系統(tǒng)掃描攝片。

    1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測sFRP5、BNP、TNF-α等蛋白的表達:收集細胞,提取細胞總蛋白。取樣品蛋白50μg,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉2 h后,用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(Tris-HCl,pH=7.4;NaCl,Tween-20)洗膜,依次加入sFRP5(1:500)及BNP抗體(1:500)及TNF-α(1:500) 4℃孵育過夜,洗完膜后,二抗(1:2 000)孵育2 h后,ECL顯色系統(tǒng)檢測,Ban&can 圖像分析系統(tǒng)定量各蛋白條帶的總灰度值, GAPDH作為內(nèi)參照。

    2 結(jié)果

    2.1 心肌細胞形態(tài)學觀察

    剛提取的心肌細胞在倒置顯微鏡下觀察呈圓形。培養(yǎng)2~4 h細胞開始貼壁生長,后細胞逐漸展開,伸出偽足,變?yōu)槿切?、星形、多邊形等形態(tài),培養(yǎng)12 h后,少數(shù)貼壁的單個細胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動。培養(yǎng)24 h后,心肌細胞全部貼壁,自發(fā)性搏動的頻率100 次/min左右。MTT法測定細胞存活率約95%。

    2.2 RT-PCR和Western Blot檢測sFRP5 mRNA和蛋白在心肌細胞中的表達(圖1)

    心肌細胞mRNA和蛋白水平均可檢測到sFRP5的表達, 且sFRP5在心肌細胞中表達明顯高于心肌成纖維細胞(P<0.05)。

    2.3 不同濃度的 Ang Ⅱ( 10-5~10-8mo1/L )對 sFRP5 mRNA、蛋白水平的影響

    在Ang Ⅱ10-5~10-8mo1/L濃度中,大鼠心肌細胞sFRP5 mRNA及蛋白水平表達的比較分別為1.53±0.01、1.58±0.02、1.85±0.01、1.80±0.01 及0.54±0.01、0.66±0.03、0.93±0.01、0.77±0.02,大鼠心肌細胞細胞中sFRP5 mRNA及蛋白水平表達隨Ang Ⅱ濃度的升高而增加,當濃度達到10-6mo1/L時達到最高值,之后呈下降趨勢(P均<0.05),當Ang Ⅱ濃度增加到10-5mo1/L后sFRP 5 mRNA水平與濃度為10-6mo1/L時相比并未見明顯差異(P>0.05)。由此我們確定10-6mo1/L的Ang Ⅱ濃度作為下一步實驗的依據(jù)。

    圖1 RT-PCR(1A)和Western Blot(1B)檢測sFRP5 mRNA和蛋白在心肌細胞中的表達(n=3)

    2.4 Ang Ⅱ(10-6mo1/L )在不同時間點(12、24、48和72 h)對心肌細胞sFRP 5和BNP表達的影響

    sFRP5 mRNA水平在不同時間點的sFRP5/GAPDH值分別為1.37±0.0、1.53±0.03、1.82±0.01和1.57±0.012 ,隨著干預時間延長,sFRP5/GAPDH值48 h為最高(P>0.05),72 h開始降低(P均>0.05) ;在不同時間點BNP/GAPDH值分別為0.31±0.02 、 0.62±0.04、0.79±0.01 和 0.66±0.01,隨著干預時間延長,48 h達到最高值,72 h后明顯降低(P均<0.05)。但與24 h時相比,無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

    2.5 AngⅡ受體阻滯劑對大鼠心肌細胞sFRP5 mRNA和蛋白表達的影響

    與對照組比較,AngⅡ組sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平顯著升高;與AngⅡ組相比,AngⅡ+替米沙坦組sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);替米沙坦組sFRP5蛋白和mRNA水平表達水平較對照組無明顯變化(P>0.05,圖2A)。Ang Ⅱ +PD123319組與 Ang Ⅱ組相比,sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖 2B)。

    圖2 AngⅡ受體對大鼠心肌細胞sFRP5 mRNA及蛋白表達的影響 (n=3)

    圖3 sFRP5對大鼠心肌細胞肥大中BNP及TNF-a蛋白表達的影響(n=3)

    2.6 不同濃度sFRP5對心肌細胞BNP及TNF-a蛋白表達的影響(圖3)

    與對照組相比,隨著sFRP5刺激濃度的增加,BNP及TNF-a的蛋白表達水平增加(P<0.05),與Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)組相比,AngⅡ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)及AngⅡ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組BNP(圖3A)及TNF-a(圖3B)的蛋白表達水平明顯下降,且在Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP 5 (100 ng/ml)組下降最明顯(P<0.05)。

    3 討論

    sFRP5除了可以在脂肪組織中表達外,在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中高表達,在胰腺中也有表達,在肝臟和肌肉組織中微弱表達[6,7]。研究證實,sFRP1~4在心肌組織中表達,sFRP3、4在心肌肥厚中表達增加。以往關(guān)于sFRP5的研究主要集中在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生及凋亡等過程,近年來其抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗胰島素抵抗等保護作用已經(jīng)有研究相繼報道,但是對于sFRP5在心肌肥厚中的表達情況研究甚少。

    Ang Ⅱ的生物學作用主要是通過 AngⅡ 1型受體(Ang Ⅱ types 1 receptor, AT1R)和 AngⅡ 2型受體(Ang Ⅱ types 2 receptor, AT2R)介導的,這兩種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體[8],但是它們的組織分布以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑是不相同的。AT1R在成年組織器官中豐富表達,主要分布于肺、血管平滑肌細胞、肝、腎、腎上腺[9]。AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起心肌肥厚和細胞外基質(zhì)蛋白的積聚、促進醛固酮分泌、內(nèi)皮細胞的損傷以及調(diào)節(jié)細胞因子、化學趨化因子和黏附分子等炎癥介質(zhì)的表達等[10]。Ang Ⅱ與AT2R結(jié)合則起與AT1R結(jié)合相反的作用。在病理情況下,AT2R表達上調(diào),參與細胞分化、組織再生、擴張血管、促進尿鈉排泄、抑制內(nèi)皮和平滑肌細胞增殖、細胞凋亡等過程[11]。也有研究證實在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭時AT2R表達相對上調(diào),介導AngⅡ的主要作用[12]。因此,在Ang Ⅱ誘導心肌肥厚過程中,sFRP5的表達增加與哪個受體有關(guān),尚不明確。

    本研究體外大鼠心肌細胞培養(yǎng)并給予Ang Ⅱ刺激,誘導心肌細胞肥大,觀察Ang Ⅱ兩種受體在sFRP5表達增加中所起的作用。結(jié)果顯示,sFRP5能夠在心肌細胞中表達。Ang Ⅱ誘導心肌細胞肥大,通過檢測BNP蛋白表達情況間接評價心肌細胞肥大情況。證明不同濃度Ang Ⅱ干預心肌細胞后,sFRP5的表達隨著干預濃度和干預時間的變化有所變化,且呈濃度和時間依賴性,并且和BNP的變化趨勢有相關(guān)性。通過不同濃度的sFRP5干預肥大的心肌細胞,從而發(fā)現(xiàn),sFRP5抑制BNP及TNF-a的表達增加,證實sFRP5的心臟保護作用。

    替米沙坦和PD123319分別是AT1R和AT2R特異性受體拮抗劑,sFRP5的表達在替米沙坦+AngⅡ組中明顯低于Ang Ⅱ組,Ang Ⅱ引起的sFRP5表達增加幾乎完全可以被替米沙坦抑制,說明Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大主要由AT1R介導,而不是通過AT2R起作用。這和我們上述的推測一致。

    總之,本文的研究證實sFRP5可以在心肌細胞中表達,并且在心肌肥大過程中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。這一過程主要是由AT1R介導的。sFRP5在抑制心肌細胞肥大中發(fā)揮保護作用。

    [1] 張昌琳, 喬樹賓. Apelin-APJ 系統(tǒng)在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究進展. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 398-400.

    [2] Rosenbaugh EG, Savalia KK, Manickam DS, et al. Antioxidant-based therapies for angiotensin Ⅱ-associated cardiovascular diseases. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013, 304: R917-R928.

    [3] Ouchi N, Higuchi A, Ohashi K. Sfrp5 is an anti-inflammatory adipokine that modulates metabolic dysfunction in obesity. Science,2010, 329: 454-457.

    [4] Almario RU, Karakas SE. Roles of circulating WNT-signaling proteins and WNT-inhibitors in human adiposity, insulin resistance, insulin secretion, and inflammation. Horm Metab Res, 2015, 47: 152-157.

    [5] Schumann H, Holtz J, Zerkowski HR, et al. Expression of secreted frizzled related proteins 3 and 4 in human ventricular myocardium correlates with apoptosis related gene expression. Cardiovasc Res,2000, 45: 720-728.

    [6] Holly VL, Widen SA, Famulski JK, et al. Sfrp1a and Sfrp5 function as positive regulators of Wnt and BMP signaling during early retinal development. Dev Biol, 2014, 388: 192-204.

    [7] Peng C, Xiao X, Kang B, et al. Serum secreted frizzled-related protein 5 levels differentially decrease in patients with hepatitis B virusassociated chronic infection and hepatocellular carcinoma. Oncol Lett,2014, 8: 1340-1344.

    [8] Branco AF, Allen BG. G protein-coupled receptor signaling in cardiac nuclear membranes. J Cardiovasc Pharmacol, 2015, 65: 101-109.

    [9] Magnani F, Pappas CG, Crook T, et al. Electronic sculpting of ligand-GPCR subtype selectivity: the case of angiotensin Ⅱ. ACS Chem Biol,2014, 9: 1420-1425.

    [10] McNeill H, Vinson GP. Regulation of MAPK activity in response to dietary sodium in the rat adrenal gland. Endocr Res, 2000, 26: 879-883.

    [11] Gao J, Chao J, Parbhu KJ, et al. Ontogeny of angiotensin type 2 and type 1 receptor expression in mice. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2012, 13: 341-352.

    [12] Horiuchi M, Akishita M, Dzau VJ. Recent progress in angiotensin Ⅱtype 2 receptor research in the cardiovascular system. Hypertension,1999, 33: 613-621.

    Relationship Between Angiotensin Ⅱ, Secreted Frizzled-related Protein 5 and Rat's Cardiomyocyte Hypertrophy in Vitro

    JIN Xin, GUO Bing-yan, YANG Rong, CHANG Liang, WANG Ya-ling, MIAO Cheng-long, LIU Su-yun, ZHANG Hui,LI Yong-jun.
    Department of Cardiology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050000), Hebei, China

    LI Yong-jun, Email:lyjbs001@163.com

    Objective: To investigate the expression and effect of secreted frizzled-related protein 5 (sFRP5) in rat’s cardiomyocyte hypertrophy in vitro.

    Methods: Neonatal rat’s ventricular myocytes were cultured in vitro, cardiomyocyte hypertrophy was induced by Ang Ⅱ.Telmisartan and PD123319 were used to block angiotensin type 1 receptor (AT1R) and angiotensin type 2 receptor (AT2R)respectively. RT-PCR and Western-blot analysis were conducted to examine the expressions of sFRP5, BNP and TNF-α.

    Results: sFRP5 was expressed in cardiomyocytes. The mRNA and protein expressions of sFRP5, protein expression of BNP were increased by prolonged time of AngⅡ treatment, the maximum expression was observed at 48 h, P<0.05.Compared with Ang Ⅱ (10-6mol/L) group, the mRNA and protein expressions of sFRP5 in AngⅡ +Telmisartan (10 μmol/L)group were decreased, P<0.05, those expressions were similar in AngⅡ +PD123319 (10 μmol/L) group, P>0.05. Compared with AngⅡ (10-6mo1/L)+sFRP5 (0 ng/ml) group, protein expressions of BNP and TNF-α were decreased in Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5(10 ng/ml) group and in Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml) group respectively, P<0.05.

    Conclusion: For in vitro process of Ang Ⅱ induced neonatal rat’s cardiomyocyte hypertrophy, using Ang Ⅱ receptor could up-regulate sFRP5 expression and sFRP5 plays an important role in cardiomyocyte hypertrophy.

    AngiotensinⅡ; Cardiomyocyte hypertrophy; Adipokine

    國家自然科學基金(81570345);國家自然科學基金青年科學基金(81400217)

    050000 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 心內(nèi)科

    金鑫 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病研究 Email:jinxin99123@163.com 通訊作者:李擁軍 Email:lyjbs001@163.com

    R541

    A

    1000-3614(2017)12-1227-05

    10.3969/j.issn.1000-3614.2017. 12.020

    2016-12-25)

    (編輯:曹洪紅)

    猜你喜歡
    水平
    張水平作品
    作家葛水平
    火花(2019年12期)2019-12-26 01:00:28
    深化精神文明創(chuàng)建 提升人大工作水平
    加強上下聯(lián)動 提升人大履職水平
    水平有限
    雜文月刊(2018年21期)2019-01-05 05:55:28
    加強自身建設(shè) 提升人大履職水平
    老虎獻臀
    中俄經(jīng)貿(mào)合作再上新水平的戰(zhàn)略思考
    建機制 抓落實 上水平
    中國火炬(2010年12期)2010-07-25 13:26:22
    做到三到位 提升新水平
    中國火炬(2010年8期)2010-07-25 11:34:30
    大片电影免费在线观看免费| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| a级片在线免费高清观看视频| 国产成人精品一,二区| 乱人伦中国视频| 香蕉精品网在线| 下体分泌物呈黄色| 男人爽女人下面视频在线观看| 天美传媒精品一区二区| 午夜久久久在线观看| 国产精品免费大片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一级毛片 在线播放| 成人国产av品久久久| 大香蕉久久网| 人妻一区二区av| 美女中出高潮动态图| 久久狼人影院| 在线 av 中文字幕| 自线自在国产av| 亚洲无线观看免费| av免费观看日本| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产色爽女视频免费观看| 国产乱人偷精品视频| 99久久人妻综合| 美女视频免费永久观看网站| 美女视频免费永久观看网站| 久热久热在线精品观看| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 少妇 在线观看| 国产在视频线精品| 一区二区三区四区激情视频| 久久99热这里只频精品6学生| 精品少妇内射三级| 久久久久久久精品精品| 色视频在线一区二区三区| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 精品午夜福利在线看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| av免费在线看不卡| 日韩伦理黄色片| a级毛片在线看网站| a级毛片在线看网站| 只有这里有精品99| 欧美日韩视频精品一区| 久久免费观看电影| 国产黄频视频在线观看| 免费观看a级毛片全部| 中国三级夫妇交换| 成人国产av品久久久| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 成年女人在线观看亚洲视频| 久热这里只有精品99| 少妇精品久久久久久久| 老熟女久久久| 久久久a久久爽久久v久久| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 亚洲人成网站在线播| 国产乱人偷精品视频| 乱人伦中国视频| 在线观看一区二区三区激情| videos熟女内射| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 国产91av在线免费观看| 午夜影院在线不卡| 国产精品免费大片| 少妇人妻久久综合中文| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 日韩有码中文字幕| av福利片在线| 欧美黄色淫秽网站| 99热国产这里只有精品6| 亚洲伊人久久精品综合| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 精品福利观看| 好男人电影高清在线观看| av天堂在线播放| 亚洲视频免费观看视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线看a的网站| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 日本av免费视频播放| 热99re8久久精品国产| 91麻豆av在线| 高潮久久久久久久久久久不卡| 亚洲欧美清纯卡通| 国产视频一区二区在线看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 日韩视频在线欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲精品美女久久av网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女 | 亚洲国产欧美一区二区综合| 黄片大片在线免费观看| 成人国语在线视频| 伦理电影免费视频| 在线观看舔阴道视频| 国产精品一二三区在线看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 在线观看免费视频网站a站| 国产一区二区三区综合在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 这个男人来自地球电影免费观看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 高清在线国产一区| 精品国产国语对白av| 午夜激情av网站| 午夜福利视频在线观看免费| 日韩三级视频一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 美女主播在线视频| 国产亚洲欧美精品永久| av国产精品久久久久影院| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 精品人妻熟女毛片av久久网站| 大香蕉久久网| 亚洲精华国产精华精| 女警被强在线播放| 国产成人啪精品午夜网站| xxxhd国产人妻xxx| 下体分泌物呈黄色| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 老熟女久久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 日韩欧美免费精品| tocl精华| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区 | 人成视频在线观看免费观看| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 桃花免费在线播放| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费日韩欧美在线观看| 亚洲熟女毛片儿| 精品人妻1区二区| 午夜福利乱码中文字幕| kizo精华| 日韩欧美免费精品| 成人黄色视频免费在线看| 一级片'在线观看视频| 精品高清国产在线一区| 国产视频一区二区在线看| 免费黄频网站在线观看国产| 精品少妇黑人巨大在线播放| 51午夜福利影视在线观看| 亚洲天堂av无毛| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | av国产精品久久久久影院| 一级黄色大片毛片| 精品人妻1区二区| 久久久水蜜桃国产精品网| 视频在线观看一区二区三区| 亚洲伊人久久精品综合| 免费在线观看日本一区| av电影中文网址| 麻豆乱淫一区二区| 天天影视国产精品| 99国产精品免费福利视频| 亚洲九九香蕉| 99久久国产精品久久久| 久久午夜综合久久蜜桃| 中文字幕高清在线视频| 在线 av 中文字幕| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 色视频在线一区二区三区| 色视频在线一区二区三区| 欧美日韩av久久| av天堂在线播放| 高清视频免费观看一区二区| 满18在线观看网站| 在线观看免费午夜福利视频| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 热re99久久国产66热| 亚洲成人免费电影在线观看| videos熟女内射| 蜜桃在线观看..| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲精品日韩在线中文字幕| 最黄视频免费看| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 中文字幕精品免费在线观看视频| 动漫黄色视频在线观看| 国产成人系列免费观看| av有码第一页| 亚洲精华国产精华精| 操美女的视频在线观看| 精品一区在线观看国产| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产成人影院久久av| 欧美一级毛片孕妇| 黄色毛片三级朝国网站| 久热爱精品视频在线9| 成年av动漫网址| 欧美黑人欧美精品刺激| 欧美精品一区二区大全| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 中文字幕精品免费在线观看视频| 999精品在线视频| 欧美黑人精品巨大| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产av又大| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | videosex国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 欧美 亚洲 国产 日韩一| 亚洲欧美激情在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 精品人妻一区二区三区麻豆| 在线精品无人区一区二区三| 啪啪无遮挡十八禁网站| 美女大奶头黄色视频| 日韩制服骚丝袜av| 亚洲免费av在线视频| svipshipincom国产片| 老司机在亚洲福利影院| 免费少妇av软件| 日韩视频一区二区在线观看| 午夜精品久久久久久毛片777| 欧美另类亚洲清纯唯美| 亚洲精品av麻豆狂野| 日韩一区二区三区影片| 精品视频人人做人人爽| 成人亚洲精品一区在线观看| 免费人妻精品一区二区三区视频| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 亚洲情色 制服丝袜| 欧美日韩av久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 人人妻人人澡人人看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 亚洲三区欧美一区| 亚洲视频免费观看视频| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 欧美中文综合在线视频| a级毛片黄视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 啦啦啦 在线观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲avbb在线观看| 咕卡用的链子| 日韩制服丝袜自拍偷拍| av有码第一页| 亚洲人成电影免费在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 日本wwww免费看| 日日爽夜夜爽网站| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲精品粉嫩美女一区| 大香蕉久久成人网| av网站在线播放免费| 下体分泌物呈黄色| 久久狼人影院| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 大码成人一级视频| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 女人久久www免费人成看片| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 女性被躁到高潮视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 黑丝袜美女国产一区| 国产一区二区在线观看av| 99国产精品99久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 午夜精品久久久久久毛片777| 多毛熟女@视频| 一级a爱视频在线免费观看| 他把我摸到了高潮在线观看 | 最新的欧美精品一区二区| 两个人看的免费小视频| 性色av一级| 亚洲精品美女久久av网站| 国产av又大| 黄色怎么调成土黄色| 免费在线观看影片大全网站| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产av又大| 99国产精品99久久久久| 成人国产一区最新在线观看| 亚洲久久久国产精品| tocl精华| 日本av手机在线免费观看| 丝袜在线中文字幕| 精品少妇黑人巨大在线播放| 国产成人影院久久av| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 久久狼人影院| 天天操日日干夜夜撸| 午夜成年电影在线免费观看| 亚洲五月色婷婷综合| a级片在线免费高清观看视频| 国产色视频综合| 窝窝影院91人妻| 嫩草影视91久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 成人国语在线视频| 超碰成人久久| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 在线看a的网站| 亚洲欧洲日产国产| 国产精品一二三区在线看| 国产一区二区三区综合在线观看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 久久久欧美国产精品| 后天国语完整版免费观看| 色播在线永久视频| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 女人精品久久久久毛片| 在线 av 中文字幕| 亚洲成人国产一区在线观看| 99精品久久久久人妻精品| 我的亚洲天堂| 亚洲伊人色综图| 91精品三级在线观看| 母亲3免费完整高清在线观看| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 老司机午夜福利在线观看视频 | 亚洲avbb在线观看| 国产视频一区二区在线看| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 国产成人免费观看mmmm| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 欧美黑人精品巨大| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品久久久av美女十八| 一级片免费观看大全| 国产免费视频播放在线视频| 丝袜喷水一区| 国产成人影院久久av| 两个人看的免费小视频| 免费在线观看影片大全网站| 亚洲九九香蕉| 国产人伦9x9x在线观看| 一区二区三区激情视频| 亚洲中文av在线| 狂野欧美激情性xxxx| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 亚洲av美国av| 免费在线观看黄色视频的| 真人做人爱边吃奶动态| 丝袜喷水一区| 日韩人妻精品一区2区三区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人影院久久| 嫩草影视91久久| 久久精品人人爽人人爽视色| 狂野欧美激情性xxxx| 又紧又爽又黄一区二区| 亚洲久久久国产精品| e午夜精品久久久久久久| 亚洲专区国产一区二区| 99国产精品免费福利视频| 久久这里只有精品19| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 亚洲男人天堂网一区| bbb黄色大片| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久天堂一区二区三区四区| 99香蕉大伊视频| 免费日韩欧美在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 视频区图区小说| 在线 av 中文字幕| 亚洲久久久国产精品| 成人国产av品久久久| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久 | 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 成人三级做爰电影| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产三级黄色录像| 国产男人的电影天堂91| 亚洲精品第二区| 91成年电影在线观看| 伦理电影免费视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 亚洲精华国产精华精| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 日韩制服丝袜自拍偷拍| cao死你这个sao货| 搡老乐熟女国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品久久久av美女十八| 成人手机av| 搡老熟女国产l中国老女人| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区三区av在线| 99国产精品一区二区三区| 免费在线观看完整版高清| 国产麻豆69| 国产精品一区二区精品视频观看| 日本精品一区二区三区蜜桃| 爱豆传媒免费全集在线观看| 日韩一区二区三区影片| 国产成人精品在线电影| 欧美另类一区| 午夜免费成人在线视频| 18在线观看网站| 亚洲欧美清纯卡通| 欧美黄色片欧美黄色片| 99热网站在线观看| 一级a爱视频在线免费观看| 女性生殖器流出的白浆| 久久这里只有精品19| 99热全是精品| 国产精品九九99| 男女国产视频网站| 亚洲成人免费av在线播放| 1024视频免费在线观看| 大片免费播放器 马上看| 国产精品久久久人人做人人爽| 精品一区二区三区四区五区乱码| 午夜两性在线视频| 91av网站免费观看| 日本av手机在线免费观看| 久久亚洲精品不卡| 国产一区二区在线观看av| 国产视频一区二区在线看| 日韩欧美免费精品| 亚洲色图综合在线观看| 日韩欧美一区二区三区在线观看 | 亚洲五月色婷婷综合| 国产有黄有色有爽视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 日韩电影二区| 99热网站在线观看| 悠悠久久av| 国产成人影院久久av| 咕卡用的链子| 国产欧美日韩精品亚洲av| 老司机福利观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 成人黄色视频免费在线看| 我要看黄色一级片免费的| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 91字幕亚洲| 丝袜人妻中文字幕| 久久精品国产综合久久久| 十八禁网站网址无遮挡| 国产高清国产精品国产三级| 国产亚洲精品第一综合不卡| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲九九香蕉| 啦啦啦在线免费观看视频4| 欧美变态另类bdsm刘玥| 老司机午夜福利在线观看视频 | 高清欧美精品videossex| 午夜福利在线免费观看网站| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产淫语在线视频| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品国产区一区二| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 人妻人人澡人人爽人人| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美大码av| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 女人精品久久久久毛片| 999久久久国产精品视频| 欧美精品一区二区免费开放| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 俄罗斯特黄特色一大片| 中文字幕最新亚洲高清| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av日韩在线播放| 国产区一区二久久| 亚洲 欧美一区二区三区| 丝袜脚勾引网站| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲av美国av| a级毛片在线看网站| 亚洲国产av新网站| 欧美日韩精品网址| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 久久国产精品人妻蜜桃| 美女中出高潮动态图| av又黄又爽大尺度在线免费看| 新久久久久国产一级毛片| 男人操女人黄网站| 亚洲五月色婷婷综合| 精品福利永久在线观看| 一本综合久久免费| 国产男女超爽视频在线观看| 国产免费视频播放在线视频| 日本精品一区二区三区蜜桃| 国产高清videossex| 精品一区二区三卡| 91麻豆av在线| 日本91视频免费播放| 视频区图区小说| 久久久久久久国产电影| 亚洲熟女精品中文字幕| 丝袜在线中文字幕| 国产av又大| 婷婷成人精品国产| 成人手机av| 在线观看www视频免费| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| av免费在线观看网站| 乱人伦中国视频| 青草久久国产| 最新的欧美精品一区二区| 国产视频一区二区在线看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 久久国产精品大桥未久av| 一区二区三区乱码不卡18| 捣出白浆h1v1| 免费在线观看日本一区| 国产精品二区激情视频| 久久久久久久久免费视频了| 一区二区日韩欧美中文字幕| 国产亚洲欧美精品永久| 搡老岳熟女国产| 国产av一区二区精品久久| 一本色道久久久久久精品综合| 丝瓜视频免费看黄片| 久久这里只有精品19| 极品少妇高潮喷水抽搐| 十分钟在线观看高清视频www| 极品少妇高潮喷水抽搐| 首页视频小说图片口味搜索| 国产日韩欧美亚洲二区| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 好男人电影高清在线观看| 一区二区av电影网| 嫩草影视91久久| 精品熟女少妇八av免费久了| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 亚洲熟女精品中文字幕| 少妇粗大呻吟视频| 99香蕉大伊视频| 纯流量卡能插随身wifi吗| 一区在线观看完整版| 国产一级毛片在线| 国产精品成人在线| 婷婷成人精品国产| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 欧美日韩亚洲高清精品| 操出白浆在线播放| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久香蕉激情| 久久久久久人人人人人| 后天国语完整版免费观看| 啦啦啦啦在线视频资源| 国产一区二区三区av在线| 少妇粗大呻吟视频| 精品国产一区二区久久| 99久久人妻综合| 国产97色在线日韩免费| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 午夜激情久久久久久久| 天天影视国产精品| 多毛熟女@视频| 深夜精品福利| 国产99久久九九免费精品| 亚洲av电影在线进入| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美精品亚洲一区二区| 1024视频免费在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 波多野结衣一区麻豆| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 欧美日韩视频精品一区| 久久久久久人人人人人| 国产麻豆69| 丁香六月天网| 久久久国产一区二区| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 成人影院久久| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99国产精品99久久久久| 国产男女超爽视频在线观看| 色婷婷久久久亚洲欧美| 中亚洲国语对白在线视频| 一级黄色大片毛片| 麻豆国产av国片精品| 12—13女人毛片做爰片一| 两个人看的免费小视频| 欧美久久黑人一区二区| 午夜福利,免费看| 午夜福利视频精品| 久久中文字幕一级| 国产xxxxx性猛交| 蜜桃国产av成人99| 国产91精品成人一区二区三区 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 在线永久观看黄色视频| 国产成人欧美在线观看 | 最黄视频免费看| 秋霞在线观看毛片| 18在线观看网站| 少妇 在线观看| 成在线人永久免费视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面 | 黄色怎么调成土黄色|