金鑫,郭炳彥,楊蓉,常亮,王亞玲,苗成龍,劉素云,張輝,李擁軍
基礎(chǔ)與實驗研究
血管緊張素Ⅱ與分泌型卷曲相關(guān)蛋白5在心肌細胞肥大中相關(guān)性研究
金鑫,郭炳彥,楊蓉,常亮,王亞玲,苗成龍,劉素云,張輝,李擁軍
目的:探討分泌型卷曲相關(guān)蛋白5(sFRP5)在心肌細胞肥大中的表達情況及其發(fā)揮的作用。 方法:體外培養(yǎng)SD乳鼠心肌細胞,應用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘導心肌細胞肥大。替米沙坦、PD123319分別阻滯血管緊張素1型受體(AT1R)、血管緊張素2型受體(AT2R)的表達,逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及蛋白免疫印跡法(Western bolt)檢測sFRP5、腦利鈉肽(BNP)及腫瘤壞死因子-a(TNF-a)的表達。 結(jié)果:sFRP5 能夠在心肌細胞中表達。sFRP5 mRNA及蛋白水平、BNP蛋白水平的表達隨Ang Ⅱ干預時間的延長而增加, 48 h達到最高值 (P<0.05)。與Ang Ⅱ(10-6mol/L)組相比,Ang Ⅱ+替米沙坦(10 μmol/L)組sFRP5 mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05),Ang Ⅱ +PD123319(10 μmol/L)組 sFRP5 mRNA 和蛋白水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);與Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+ sFRP5(0 ng/ml)組比較,Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)組及Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組BNP蛋白及TNF-a的蛋白表達水平明顯下降(P<0.05)。 結(jié)論:在Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大過程中,主要通過血管緊張素Ⅱ型受體上調(diào)sFRP5的表達,且sFRP5在抑制心肌細胞肥大中發(fā)揮作用。
血管緊張素Ⅱ;心肌細胞肥大;脂肪細胞因子
(Chinese Circulation Journal, 2017,32:1227.)
心肌肥厚是由細胞外刺激信號作用于細胞并通過一系列信號轉(zhuǎn)導通路引起細胞內(nèi)基因表達的活化與失活,并最終引起細胞表型改變的過程,主要表現(xiàn)為心肌細胞的肥大和間質(zhì)成分的改變[1]。血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)通常被選擇作為心肌細胞肥大的誘導劑,直接導致心肌肥厚[2]。分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP) 5 屬于分泌型卷曲相關(guān)蛋白(sFRP)家族中的一員,是一種新近發(fā)現(xiàn)的與肥胖和胰島素抵抗有關(guān)的脂肪細胞因子和抗炎因子[3,4]。已有研究證實,sFRP1~4在心肌組織中表達, sFRP3、4在心肌肥厚中表達增加[5]。本研究探討sFRP5在心肌細胞肥大中的表達情況及其發(fā)揮的作用。
1.1 材料:出生2~3天的Sprague-Dawley(SD)大鼠乳鼠(購自河北醫(yī)科大學實驗動物中心),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(DMEM)培養(yǎng)液、青霉素、鏈霉素、D-Hanks、Ⅱ型膠原酶干粉、胰蛋白酶干粉及胎牛血清購自Sigma公司(圣路易斯,美國),Ang Ⅱ、sFRP5抗體、替米沙坦、PD123319系Gibico產(chǎn)品(加利福尼亞,美國)。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、二甲亞砜(DMSO),Trizol試劑, 多聚酶鏈反應(PCR)擴增劑、逆轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)檢測試劑盒購自Promega公司(麥迪遜,美國),腦利鈉肽(BNP)、腫瘤壞死因子(TNF-a)兔抗鼠抗體、二抗IRDye 700 DX購自GIBCO公司(比靈斯,美國)。5-溴脫尿苷(5-BrdU)購自Santa Cruz公司(美國)。
1.2 心肌細胞原代培養(yǎng):將SD乳鼠用75%醫(yī)用酒精消毒,持眼科剪沿劍突下剪開肋骨,暴露心臟,剪取左心室心尖部分,置入預冷的D-Hanks清洗液中,反復清洗3遍;后將心肌組織放入小培養(yǎng)瓶中,應用另一眼科剪剪碎至1 m3左右;加入4 ml預先配好的混合消化酶液,放入無菌小轉(zhuǎn)子,至磁力攪拌器上,在37℃恒溫條件下進行消化,攪拌5 min,棄上清;消化2次后,吸上清液于10 ml離心管中,加入含有10%小牛血清的低糖DMEM 4 ml終止消化,置于離心機中以112 g離心,棄上清,加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基4 ml,離心,再棄上清,最后加入含有10%小牛血清的低糖DMEM 2 ml,重懸后備用;按上述方法重復消化,共約10~12次,直到完全消化;收集心肌細胞,用200目無菌細胞篩過濾并移入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中,溫箱中孵育2 h。
1.3 心肌細胞的純化及培養(yǎng):吸取心肌細胞懸浮液,在另一培養(yǎng)皿中進行細胞計數(shù);加入終濃度為0.1 mmol/L的5-BrdU,后按106/ml的密度將心肌細胞懸液接種于六孔板。于孵育箱中培養(yǎng)48 h;后換為無血清、無5-BrdU的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后進行實驗。
1.4 實驗分組:干預藥物均由無菌過濾器過濾除菌后加入心肌細胞。(1)對照組:正常心肌細胞不加任何干預因素;(2)不同濃度的Ang Ⅱ(10-5~-8mo1/L)、不同作用時間(12、25、48和72 h)對sFRP5 mRNA和蛋白水平及BNP蛋白表達的影響:Ang Ⅱ組:Ang Ⅱ(10-6mol/L)作用心肌細胞48 h刺激心肌細胞肥大;(3)Ang Ⅱ 受體阻滯劑對心肌細胞sFRP5和BNP表達的影響:①Ang Ⅱ + 替米沙坦組及Ang Ⅱ+ PD123319組:分別用AT1R阻滯劑替米沙坦(10 μmol/L)及 AT2R 阻滯劑 PD123319(10 μmol/L)干預心肌細胞30 min,后用Ang Ⅱ (10-6mol/L)刺激48 h;②替米沙坦組及PD123319組:即正常心肌細胞分別給予替米沙坦(10 μmol/L)及 PD123319(10 μmol/L);(4)不同濃度的sFRP5對心肌細胞肥大中BNP和TNF- a表達的影響:分別用不同濃度的sFRP5(0、10和100 ng/ml)干預心肌細胞4 h后,用AngⅡ(10-6mol/L)刺激48 h。分為Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)組,Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)組及Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組,每天加藥一次,每2天換液一次。
1.5 噻唑蘭法檢測心肌細胞活力:心肌細胞以1×105/ml的密度種植于96孔板中,處理心肌細胞后,加入5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT ,商品名:噻唑蘭)溶液20 μl于培養(yǎng)基中,在37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)4 h,之后每孔加入150μl的DMSO,并震蕩10 min,將96孔細胞培養(yǎng)板置入全自動酶標儀,在490 nm波長處測定其光吸收值。
1.6 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應檢測sFRP5、BNP等mRNA的表達:采取Trizol法提取心肌細胞總RNA,取2 μg總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄后取2 μl行PCR反應。sFRP5的上游引物5'-ACTTTGAATGCCGTGAA-3',下游引物5'-AATCCAGTTGGTGAGCC-3',擴增片段長度為多少113 bp,PCR反應體系20 μl,反應條件為94℃變性5 min,94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,30個循環(huán),72 ℃延伸7 min,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的上游引物5'-GAGGCTCTCTTCCAGCCTTC-3',下游引物5'-AGGGTGTAAAAGCAGCTCA-3',PCR 反應體系20μl,反應條件為 94 ℃變性 5 min,94 ℃變性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,28個循環(huán),72℃延伸7 min,得到的PCR產(chǎn)物2%的瓊脂糖電泳并用成像系統(tǒng)掃描攝片。
1.7 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測sFRP5、BNP、TNF-α等蛋白的表達:收集細胞,提取細胞總蛋白。取樣品蛋白50μg,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離,轉(zhuǎn)膜,5%BSA封閉2 h后,用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液(Tris-HCl,pH=7.4;NaCl,Tween-20)洗膜,依次加入sFRP5(1:500)及BNP抗體(1:500)及TNF-α(1:500) 4℃孵育過夜,洗完膜后,二抗(1:2 000)孵育2 h后,ECL顯色系統(tǒng)檢測,Ban&can 圖像分析系統(tǒng)定量各蛋白條帶的總灰度值, GAPDH作為內(nèi)參照。
剛提取的心肌細胞在倒置顯微鏡下觀察呈圓形。培養(yǎng)2~4 h細胞開始貼壁生長,后細胞逐漸展開,伸出偽足,變?yōu)槿切?、星形、多邊形等形態(tài),培養(yǎng)12 h后,少數(shù)貼壁的單個細胞出現(xiàn)自發(fā)性搏動。培養(yǎng)24 h后,心肌細胞全部貼壁,自發(fā)性搏動的頻率100 次/min左右。MTT法測定細胞存活率約95%。
心肌細胞mRNA和蛋白水平均可檢測到sFRP5的表達, 且sFRP5在心肌細胞中表達明顯高于心肌成纖維細胞(P<0.05)。
在Ang Ⅱ10-5~10-8mo1/L濃度中,大鼠心肌細胞sFRP5 mRNA及蛋白水平表達的比較分別為1.53±0.01、1.58±0.02、1.85±0.01、1.80±0.01 及0.54±0.01、0.66±0.03、0.93±0.01、0.77±0.02,大鼠心肌細胞細胞中sFRP5 mRNA及蛋白水平表達隨Ang Ⅱ濃度的升高而增加,當濃度達到10-6mo1/L時達到最高值,之后呈下降趨勢(P均<0.05),當Ang Ⅱ濃度增加到10-5mo1/L后sFRP 5 mRNA水平與濃度為10-6mo1/L時相比并未見明顯差異(P>0.05)。由此我們確定10-6mo1/L的Ang Ⅱ濃度作為下一步實驗的依據(jù)。
圖1 RT-PCR(1A)和Western Blot(1B)檢測sFRP5 mRNA和蛋白在心肌細胞中的表達(n=3)
sFRP5 mRNA水平在不同時間點的sFRP5/GAPDH值分別為1.37±0.0、1.53±0.03、1.82±0.01和1.57±0.012 ,隨著干預時間延長,sFRP5/GAPDH值48 h為最高(P>0.05),72 h開始降低(P均>0.05) ;在不同時間點BNP/GAPDH值分別為0.31±0.02 、 0.62±0.04、0.79±0.01 和 0.66±0.01,隨著干預時間延長,48 h達到最高值,72 h后明顯降低(P均<0.05)。但與24 h時相比,無明顯變化,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。
與對照組比較,AngⅡ組sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平顯著升高;與AngⅡ組相比,AngⅡ+替米沙坦組sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05);替米沙坦組sFRP5蛋白和mRNA水平表達水平較對照組無明顯變化(P>0.05,圖2A)。Ang Ⅱ +PD123319組與 Ang Ⅱ組相比,sFRP5 mRNA水平和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖 2B)。
圖2 AngⅡ受體對大鼠心肌細胞sFRP5 mRNA及蛋白表達的影響 (n=3)
圖3 sFRP5對大鼠心肌細胞肥大中BNP及TNF-a蛋白表達的影響(n=3)
與對照組相比,隨著sFRP5刺激濃度的增加,BNP及TNF-a的蛋白表達水平增加(P<0.05),與Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP5(0 ng/ml)組相比,AngⅡ(10-6mo1/L)+sFRP5 (10 ng/ml)及AngⅡ(10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml)組BNP(圖3A)及TNF-a(圖3B)的蛋白表達水平明顯下降,且在Ang Ⅱ(10-6mo1/L)+sFRP 5 (100 ng/ml)組下降最明顯(P<0.05)。
sFRP5除了可以在脂肪組織中表達外,在視網(wǎng)膜色素上皮細胞中高表達,在胰腺中也有表達,在肝臟和肌肉組織中微弱表達[6,7]。研究證實,sFRP1~4在心肌組織中表達,sFRP3、4在心肌肥厚中表達增加。以往關(guān)于sFRP5的研究主要集中在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生及凋亡等過程,近年來其抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗胰島素抵抗等保護作用已經(jīng)有研究相繼報道,但是對于sFRP5在心肌肥厚中的表達情況研究甚少。
Ang Ⅱ的生物學作用主要是通過 AngⅡ 1型受體(Ang Ⅱ types 1 receptor, AT1R)和 AngⅡ 2型受體(Ang Ⅱ types 2 receptor, AT2R)介導的,這兩種受體均屬于G蛋白偶聯(lián)受體[8],但是它們的組織分布以及細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導途徑是不相同的。AT1R在成年組織器官中豐富表達,主要分布于肺、血管平滑肌細胞、肝、腎、腎上腺[9]。AngⅡ與AT1R結(jié)合可引起心肌肥厚和細胞外基質(zhì)蛋白的積聚、促進醛固酮分泌、內(nèi)皮細胞的損傷以及調(diào)節(jié)細胞因子、化學趨化因子和黏附分子等炎癥介質(zhì)的表達等[10]。Ang Ⅱ與AT2R結(jié)合則起與AT1R結(jié)合相反的作用。在病理情況下,AT2R表達上調(diào),參與細胞分化、組織再生、擴張血管、促進尿鈉排泄、抑制內(nèi)皮和平滑肌細胞增殖、細胞凋亡等過程[11]。也有研究證實在心室肥厚、心肌梗死以及心力衰竭時AT2R表達相對上調(diào),介導AngⅡ的主要作用[12]。因此,在Ang Ⅱ誘導心肌肥厚過程中,sFRP5的表達增加與哪個受體有關(guān),尚不明確。
本研究體外大鼠心肌細胞培養(yǎng)并給予Ang Ⅱ刺激,誘導心肌細胞肥大,觀察Ang Ⅱ兩種受體在sFRP5表達增加中所起的作用。結(jié)果顯示,sFRP5能夠在心肌細胞中表達。Ang Ⅱ誘導心肌細胞肥大,通過檢測BNP蛋白表達情況間接評價心肌細胞肥大情況。證明不同濃度Ang Ⅱ干預心肌細胞后,sFRP5的表達隨著干預濃度和干預時間的變化有所變化,且呈濃度和時間依賴性,并且和BNP的變化趨勢有相關(guān)性。通過不同濃度的sFRP5干預肥大的心肌細胞,從而發(fā)現(xiàn),sFRP5抑制BNP及TNF-a的表達增加,證實sFRP5的心臟保護作用。
替米沙坦和PD123319分別是AT1R和AT2R特異性受體拮抗劑,sFRP5的表達在替米沙坦+AngⅡ組中明顯低于Ang Ⅱ組,Ang Ⅱ引起的sFRP5表達增加幾乎完全可以被替米沙坦抑制,說明Ang Ⅱ誘導的心肌細胞肥大主要由AT1R介導,而不是通過AT2R起作用。這和我們上述的推測一致。
總之,本文的研究證實sFRP5可以在心肌細胞中表達,并且在心肌肥大過程中呈現(xiàn)上調(diào)趨勢。這一過程主要是由AT1R介導的。sFRP5在抑制心肌細胞肥大中發(fā)揮保護作用。
[1] 張昌琳, 喬樹賓. Apelin-APJ 系統(tǒng)在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中作用的研究進展. 中國循環(huán)雜志, 2015, 30: 398-400.
[2] Rosenbaugh EG, Savalia KK, Manickam DS, et al. Antioxidant-based therapies for angiotensin Ⅱ-associated cardiovascular diseases. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2013, 304: R917-R928.
[3] Ouchi N, Higuchi A, Ohashi K. Sfrp5 is an anti-inflammatory adipokine that modulates metabolic dysfunction in obesity. Science,2010, 329: 454-457.
[4] Almario RU, Karakas SE. Roles of circulating WNT-signaling proteins and WNT-inhibitors in human adiposity, insulin resistance, insulin secretion, and inflammation. Horm Metab Res, 2015, 47: 152-157.
[5] Schumann H, Holtz J, Zerkowski HR, et al. Expression of secreted frizzled related proteins 3 and 4 in human ventricular myocardium correlates with apoptosis related gene expression. Cardiovasc Res,2000, 45: 720-728.
[6] Holly VL, Widen SA, Famulski JK, et al. Sfrp1a and Sfrp5 function as positive regulators of Wnt and BMP signaling during early retinal development. Dev Biol, 2014, 388: 192-204.
[7] Peng C, Xiao X, Kang B, et al. Serum secreted frizzled-related protein 5 levels differentially decrease in patients with hepatitis B virusassociated chronic infection and hepatocellular carcinoma. Oncol Lett,2014, 8: 1340-1344.
[8] Branco AF, Allen BG. G protein-coupled receptor signaling in cardiac nuclear membranes. J Cardiovasc Pharmacol, 2015, 65: 101-109.
[9] Magnani F, Pappas CG, Crook T, et al. Electronic sculpting of ligand-GPCR subtype selectivity: the case of angiotensin Ⅱ. ACS Chem Biol,2014, 9: 1420-1425.
[10] McNeill H, Vinson GP. Regulation of MAPK activity in response to dietary sodium in the rat adrenal gland. Endocr Res, 2000, 26: 879-883.
[11] Gao J, Chao J, Parbhu KJ, et al. Ontogeny of angiotensin type 2 and type 1 receptor expression in mice. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst, 2012, 13: 341-352.
[12] Horiuchi M, Akishita M, Dzau VJ. Recent progress in angiotensin Ⅱtype 2 receptor research in the cardiovascular system. Hypertension,1999, 33: 613-621.
Relationship Between Angiotensin Ⅱ, Secreted Frizzled-related Protein 5 and Rat's Cardiomyocyte Hypertrophy in Vitro
JIN Xin, GUO Bing-yan, YANG Rong, CHANG Liang, WANG Ya-ling, MIAO Cheng-long, LIU Su-yun, ZHANG Hui,LI Yong-jun.
Department of Cardiology, The Second Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang (050000), Hebei, China
LI Yong-jun, Email:lyjbs001@163.com
Objective: To investigate the expression and effect of secreted frizzled-related protein 5 (sFRP5) in rat’s cardiomyocyte hypertrophy in vitro.
Methods: Neonatal rat’s ventricular myocytes were cultured in vitro, cardiomyocyte hypertrophy was induced by Ang Ⅱ.Telmisartan and PD123319 were used to block angiotensin type 1 receptor (AT1R) and angiotensin type 2 receptor (AT2R)respectively. RT-PCR and Western-blot analysis were conducted to examine the expressions of sFRP5, BNP and TNF-α.
Results: sFRP5 was expressed in cardiomyocytes. The mRNA and protein expressions of sFRP5, protein expression of BNP were increased by prolonged time of AngⅡ treatment, the maximum expression was observed at 48 h, P<0.05.Compared with Ang Ⅱ (10-6mol/L) group, the mRNA and protein expressions of sFRP5 in AngⅡ +Telmisartan (10 μmol/L)group were decreased, P<0.05, those expressions were similar in AngⅡ +PD123319 (10 μmol/L) group, P>0.05. Compared with AngⅡ (10-6mo1/L)+sFRP5 (0 ng/ml) group, protein expressions of BNP and TNF-α were decreased in Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5(10 ng/ml) group and in Ang Ⅱ (10-6mo1/L)+sFRP5 (100 ng/ml) group respectively, P<0.05.
Conclusion: For in vitro process of Ang Ⅱ induced neonatal rat’s cardiomyocyte hypertrophy, using Ang Ⅱ receptor could up-regulate sFRP5 expression and sFRP5 plays an important role in cardiomyocyte hypertrophy.
AngiotensinⅡ; Cardiomyocyte hypertrophy; Adipokine
國家自然科學基金(81570345);國家自然科學基金青年科學基金(81400217)
050000 河北省石家莊市,河北醫(yī)科大學第二醫(yī)院 心內(nèi)科
金鑫 主治醫(yī)師 博士 主要從事冠心病研究 Email:jinxin99123@163.com 通訊作者:李擁軍 Email:lyjbs001@163.com
R541
A
1000-3614(2017)12-1227-05
10.3969/j.issn.1000-3614.2017. 12.020
2016-12-25)
(編輯:曹洪紅)