鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落高通量分析

陳澤斌，李 冰，高 熹，王定斌，靳 松，郭麗紅

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214； 2.中國科學(xué)院 昆明動物研究所，云南 昆明 650223； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 4.宣威市阿都鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 宣威 655425； 5.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 昆明 650214)

鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細(xì)菌群落高通量分析

陳澤斌1，李 冰2*，高 熹3，王定斌4，靳 松1，郭麗紅5

(1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214； 2.中國科學(xué)院 昆明動物研究所，云南 昆明 650223； 3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201； 4.宣威市阿都鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南 宣威 655425； 5.云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室，云南 昆明 650214)

為揭示鐵皮石斛不同器官中內(nèi)生細(xì)菌的分布規(guī)律,應(yīng)用Illumina測序平臺的MiSeq高通量測序儀對鐵皮石斛根、莖、葉中內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA-V4區(qū)擴(kuò)增子進(jìn)行測序，對測得數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，評價物種Alpha多樣性和Beta多樣性。經(jīng)FLASH軟件對序列進(jìn)行拼接，莖、葉、根樣品分別獲得64 851、77 499、52 157條原始序列，經(jīng)Qiime軟件過濾，再剔除宿主的葉綠體和線粒體序列，最終分別得到64 742、77 351、52 064條有效序列，在97%的序列相似性水平上，這些有效序列被Uparse軟件劃分為61、134、112個操作分類單元(OTUs)。序列比對結(jié)果表明，假單胞菌屬(Pseudomonas)和食酸菌屬(Acidovorax)細(xì)菌在根、莖、葉中都是優(yōu)勢菌，瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、Faecalibacterium屬、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、希瓦氏菌屬(Shewanella)細(xì)菌表現(xiàn)出組織專一性。豐度聚類分析及主成分分析表明，根和葉中內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為相似。鐵皮石斛植株內(nèi)蘊含豐富的細(xì)菌資源，其分布受組織結(jié)構(gòu)及成分因素影響表現(xiàn)出器官差異性。

鐵皮石斛； 內(nèi)生細(xì)菌； 多樣性； 高通量分析

石斛可分為黃草、金釵、馬鞭等數(shù)十種，鐵皮石斛(Dendrobiumcandidum)為石斛中經(jīng)濟(jì)價值最高的一種，有“中華九大仙草之首”的美稱，分布于安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川、云南東南部海拔1 600 m的山地半陰濕的巖石上[1-2]。以鐵皮石斛的莖入藥，具有增加胃液分泌、助消化、促進(jìn)腸胃蠕動、降血糖、降血壓、增強機體免疫力等作用[3-6]。

植物內(nèi)生菌是指整個生活周期都存在于宿主植物體內(nèi)的細(xì)菌、真菌和放線菌，目前還沒有發(fā)現(xiàn)不存在內(nèi)生菌的植物[7]。內(nèi)生菌在石斛屬植物促進(jìn)生長[8]、抑制病原菌[9]、影響宿主代謝成分[10-11]方面起著重要的作用，因此有必要對鐵皮石斛內(nèi)生菌多樣性進(jìn)行研究。洪群艷等[12]認(rèn)為，刺盤孢屬(Colletotrichum)為野生石斛莖和葉的優(yōu)勢種群，占總菌株數(shù)的39.5%。此外還發(fā)現(xiàn),石斛內(nèi)生真菌具有組織差異性和專一性。章華偉等[13]發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌分布在芽孢桿菌屬(Bacillus)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、泛菌屬(Pantoea)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、梭菌屬(Clostridium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)共7個屬。嚴(yán)亮等[14]發(fā)現(xiàn)，Bacillusoceanisediminis、Bacillusberingensis和Bacilluslicheniformis3種菌同時存在于根部和葉部。

目前，對于石斛內(nèi)生菌多樣性的研究仍是采用傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)方法進(jìn)行，然而由于表面消毒過重、所用培養(yǎng)基營養(yǎng)成分單一、有氧的培養(yǎng)條件等因素，實際上只分離到真實存在微生物總數(shù)的0.1%～10%[15-16]，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，為了無偏差地了解內(nèi)生細(xì)菌群落的真實組成，可采用免培養(yǎng)技術(shù)手段直接從DNA層面解析群落中的物種組成。因此，本研究首次采用Illumina高通量測序平臺的 MiSeq測序儀對鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細(xì)菌的16S rDNA擴(kuò)增子進(jìn)行二代測序，相較于傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)法以及基于一代Sanger測序的非培養(yǎng)方法，測序成本更低，深度更大，檢測靈敏度更高，從而實現(xiàn)對鐵皮石斛不同部位內(nèi)生細(xì)菌種類的準(zhǔn)確調(diào)查，為豐富植物微生態(tài)學(xué)理論及基因工程菌的研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

2016年8月于云南省普洱市景東彝族自治縣鐵皮石斛人工栽培基地，采用3點取樣法挖取20株無明顯病蟲害的1年生栽培型鐵皮石斛，去除腐葉，將根、莖、葉分別放入無菌樣品袋中，混合均勻，低溫保鮮，于24 h內(nèi)進(jìn)行表面消毒處理，根、莖、葉樣品分別命名為SG、SJ、SY。

1.2 表面消毒

用無菌水將鐵皮石斛根、莖、葉沖洗干凈，吸干表面水分，再用75%乙醇浸泡30 s，0.1%升汞振蕩浸泡5 min，無菌水沖洗4次，無菌濾紙吸干表面水分，表面消毒效果檢驗參照文獻(xiàn)[17]。

1.3 基因組DNA的提取

采用改進(jìn)的CTAB法[18]提取表面徹底消毒的根、莖、葉組織基因組DNA，并用0.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA的濃度和純度。

1.4 16S rDNA-V4區(qū)的PCR擴(kuò)增

以根、莖、葉基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA的V4可變區(qū)，引物為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[19]，根、莖、葉引物序列前插入6個堿基組成的標(biāo)簽序列，以區(qū)分根、莖、葉樣品。PCR反應(yīng)體系參照文獻(xiàn)[19]。采用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并切膠回收目的條帶，送北京諾禾致源生物信息科技有限公司，用Illumina高通量測序平臺的 MiSeq測序儀測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控

根據(jù)插入標(biāo)簽序列，將下機數(shù)據(jù)拆分為根、莖、葉數(shù)據(jù)，剔除標(biāo)簽序列和引物序列，使用FLASH軟件[20]分別對不同樣品的讀長序列進(jìn)行拼接，Qiime軟件[21]過濾，經(jīng)過以上處理后得到的序列與數(shù)據(jù)庫(Golddatabase,http://drive5.com/uchime/uchime_download.html)進(jìn)行比對，UCHIME軟件[22]檢測嵌合體序列，并去除其中的嵌合體序列，得到最終的有效序列。

1.6 測序數(shù)據(jù)的分析

在97%的相似性水平上用Uparse軟件[23](Uparse v7.0.1001,http://drive5.com/uparse/)對有效序列進(jìn)行操作分類單元(OTUs)聚類，選取代表序列用RDP classifier軟件[24](V2.2,http://sourceforge.net/projects/rdp-classifier/)與GreenGene數(shù)據(jù)庫[25](http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi)進(jìn)行物種注釋分析，剔除宿主葉綠體和線粒體序列，利用Mothur軟件做稀釋度曲線分析，計算文庫覆蓋率，采用Chao 1指數(shù)及香農(nóng)(Shannon)指數(shù)評估根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌多樣性，計算方法參見文獻(xiàn)[26]。采用R語言分析繪制樣品OTUs的維恩圖，通過主成分分析(PCA)挖掘根、莖、葉內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的質(zhì)控及分析

莖、葉、根樣品分別測得64 851、77 499、52 157條原始序列，經(jīng)過濾后得到的序列拼接總數(shù)分別為64 748、77 361、52 069條，去除出現(xiàn)頻度為1、無法被聚類到OTUs的低頻序列，再剔除宿主的葉綠體和線粒體序列，最終分別得到64 742、77 351、52 064條有效序列，在97%的序列相似性水平上，這些有效序列分別可劃分為61、134、112個OTUs，相對應(yīng)的文庫覆蓋率分別為99.91%、99.83%、99.78%(表1)，物種豐度稀釋曲線見圖1，3個樣品稀釋曲線上升平緩，結(jié)合覆蓋率數(shù)據(jù)認(rèn)為，設(shè)計的測序深度已足夠，可以代表樣品中真實存在的大多數(shù)細(xì)菌種類，但仍有少數(shù)細(xì)菌種類未能檢測到。

表1 鐵皮石斛樣品OTUs豐度和α多樣性指數(shù)

圖1 物種豐度稀釋曲線

2.2 不同部位內(nèi)生細(xì)菌OTUs分布

根、莖、葉細(xì)菌文庫共含OTUs的數(shù)量為307個，特有的OTUs數(shù)量分別為112、61、134個，由此可看出，葉片內(nèi)生細(xì)菌多樣性最高，其次為根，最低為莖，這與Chao 1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)得出的結(jié)果一致(表1)。從圖2可知，有30個OTUs在根、莖、葉中均有分布，只占文庫OTUs總數(shù)的9.77%，說明不同部位內(nèi)生細(xì)菌的種類組成差異大；根和葉文庫共含OTUs的數(shù)量為246個，其中107個OTUs在根和葉中均有分布，占相應(yīng)OTUs總數(shù)的43.50%；葉和莖文庫共含OTUs的數(shù)量為195個，其中35個OTUs在葉和莖中均有分布，占相應(yīng)OTUs總數(shù)的17.95%；根和莖文庫共含OTUs的數(shù)量為173個，其中30個OTUs在根和莖中均有分布，占相應(yīng)OTUs總數(shù)的17.34%。可以看出，根和葉中內(nèi)生細(xì)菌的種類組成較相似。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌OTUs分布維恩圖

2.3 不同部位內(nèi)生細(xì)菌多樣性

選取在屬分類水平上相對豐度排名前10的屬，生成物種相對豐度分布圖(圖3)。在莖樣品中，內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas,54.84%)，其次是食酸菌屬(Acidovorax,22.58%)；在葉樣品中，內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬為假單胞菌屬(Pseudomonas,26.00%)，其次是鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas,24.00%)和食酸菌屬(Acidovorax,10.00%)；在根樣品中，內(nèi)生細(xì)菌優(yōu)勢屬為食酸菌屬(Acidovorax,36.96%)，其次是假單胞菌屬(Pseudomonas,26.09%)和鞘脂單胞菌屬(Sphingomonas,10.87%)。可發(fā)現(xiàn)假單胞菌屬和食酸菌屬細(xì)菌在根、莖、葉中都是優(yōu)勢菌。此外還發(fā)現(xiàn)，鹽單胞菌屬(Halomonas)、布赫納氏菌屬(Buchnera)在根、莖、葉中少量分布。瘤胃球菌屬(Ruminococcus,8.00%)和Faecalibacterium屬(8.00%)只在葉樣品中檢測到，甲基桿菌屬(Methylobacterium)和希瓦氏菌屬(Shewanella)只在根(2.17%、4.35%)和葉(8.00%、2.00%)樣品中檢測到，甲基暖菌屬(Methylocaldum,6.45%)只存在于莖部。

圖3 內(nèi)生細(xì)菌屬水平上的相對豐度

2.4 內(nèi)生細(xì)菌豐度聚類分析

根據(jù)根、莖、葉在屬水平上的物種注釋及豐度信息，選取豐度排名前10的屬及其在不同部位中的豐度信息繪制熱圖(圖4)，并從樣品間差異層面進(jìn)行聚類，發(fā)現(xiàn)樣品SG和SY處于同一分支，最為鄰近，而與樣品SJ距離較遠(yuǎn)，說明根和葉中內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)最為相似。

圖4 內(nèi)生細(xì)菌OTUs豐度聚類分析

2.5 內(nèi)生細(xì)菌群落主成分分析

主成分分析表明(圖5)，主成分1(PC1)和主成分2(PC2)對樣品差異性的解釋度分別為59.80%和40.19%，合計為99.99%，是差異的主要來源。樣品SG和SY分別位于主成分PC2軸的正負(fù)兩側(cè)，但同時都位于主成分PC1軸的正值區(qū)域；樣品SG和SJ不僅分別位于主成分PC2軸的正負(fù)兩側(cè)，而且也位于主成分PC1軸的正負(fù)兩側(cè)，且間隔較大的距離，說明根與莖間的主成分變異程度比根與葉的顯著，總體看來，內(nèi)生細(xì)菌群落的分布隨部位的不同有顯著變化。

圖5 內(nèi)生細(xì)菌群落主成分分析

3 結(jié)論與討論

隨著MiSeq平臺雙端PE250和PE300測序策略的發(fā)展，讀長不斷增長，使得基于MiSeq測序研究物種多樣性的準(zhǔn)確性大幅度提高。利用MiSeq平臺對16S rDNA的一個或多個高變區(qū)測序，具有測序深度高、利于鑒定低豐度群落物種以及費用低的特點，已成為研究微生物群落多樣性的首選之策。本研究首次采用二代高通量測序技術(shù)對鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)進(jìn)行測序，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)在根、莖、葉中常見的優(yōu)勢細(xì)菌種類為變形菌門(Proteobacteria)的假單胞菌屬(Pseudomonas)和食酸菌屬(Acidovorax)，此外還檢測到一些沒有報道過的低豐度細(xì)菌類群(所占比例小于10.00%)，例如布赫納氏菌屬(Buchnera)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、Faecalibacterium屬、希瓦氏菌屬(Shewanella)，顯示出了新一代測序技術(shù)的優(yōu)勢。在以往通過傳統(tǒng)組織分離方法對鐵皮石斛內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離鑒定的報道中，均發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢菌為厚壁菌門(Firmicutes)的芽孢桿菌屬(Bacillus)細(xì)菌[27]，與本研究的結(jié)果不一致，這可能與芽孢桿菌屬細(xì)菌在植物體內(nèi)多是以孢子形式存在有關(guān)，而提取植物組織DNA目前多采用CTAB、SDS法，無法使其裂解，導(dǎo)致未能獲取到該類群細(xì)菌的基因組DNA。

根、莖、葉細(xì)菌文庫共含OTUs的數(shù)量為307個，只有30個OTUs為根、莖、葉共有，只占文庫OTUs總數(shù)的9.77%，此外Chao 1指數(shù)、香農(nóng)指數(shù)得出的結(jié)果為葉>根>莖，說明內(nèi)生細(xì)菌的分布隨組織器官的不同而各有特點，具有明顯的器官差異性，這可能是由于不同器官的組織結(jié)構(gòu)不同、含有的化學(xué)成分不同造成的。瘤胃球菌屬和Faecalibacterium屬只在葉樣品中檢測到，甲基桿菌屬和希瓦氏菌屬只在根和葉樣品中檢測到，甲基暖菌屬只存在于莖部，表現(xiàn)出部分細(xì)菌種群的組織專一性，這與Petrini等[28]的研究結(jié)果一致，宿主植物受體蛋白能夠影響內(nèi)生細(xì)菌在對其侵入時的識別，同時內(nèi)生細(xì)菌的定殖也受到宿主植物的調(diào)控，這些因素共同造成了內(nèi)生細(xì)菌分布的專一性。本研究發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬和食酸菌屬細(xì)菌在根、莖、葉中都是優(yōu)勢菌，推測這2個屬細(xì)菌的侵入能力強，且在植株體內(nèi)具有較強的競爭力。已有報道表明，假單胞菌屬具有一定的固氮功能，與蘭科植物共生，為其供給氮源。除此之外，假單胞菌屬細(xì)菌還可以降解土壤中有機磷農(nóng)藥殘留物，避免污染環(huán)境[29]。食酸菌屬細(xì)菌曾多次作為植物內(nèi)生細(xì)菌被報道，宿主植株包括水稻、煙草、油菜、薄荷、煙草等[30]，但是關(guān)于其功能、代謝的研究目前還未見報道。

在將16S rDNA-V4區(qū)測得序列與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對的過程中發(fā)現(xiàn)，一部分序列歸屬于宿主植物的葉綠體和線粒體，因此，在進(jìn)行后續(xù)分析之前，剔除了這部分無關(guān)的序列。本研究只選擇了普遍用于水體、土壤、糞便等環(huán)境樣品[31]細(xì)菌多樣性研究的16S rDNA-V4區(qū)作為測序區(qū)域，但從研究結(jié)果看來，選擇V4區(qū)進(jìn)行植物內(nèi)生細(xì)菌研究，效果并不理想，由于葉綠體和線粒體與細(xì)菌在系統(tǒng)發(fā)育上具有高度的同源性[32]，產(chǎn)生了宿主污染的現(xiàn)象。下一步應(yīng)嘗試測序16S rDNA 9個可變區(qū)中的其他區(qū)域或者幾個區(qū)域，尋找能夠避開線粒體和葉綠體干擾的理想測序區(qū)域。

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High Throughput Analysis of the Endophytic Bacterial Community in Different Parts of Dendrobium candidum

CHEN Zebin1,LI Bing2*,GAO Xi3,WANG Dingbin4,JIN Song1,GUO Lihong5

(1.Agriculture College of Kunming University,Kunming 650214,China;2.Kunming Institute of Zoology,the Chinese Academy of Sciences,Kunming 650223,China;3.Plant Protection College,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;4.Xuanwei City Adu Township Comprehensive Agricultural Service Center,Xuanwei 655425,China; 5.Key Laboratory of Special Biological Resource Development and Utilization of Universities in Yunnan Province,Kunming 650214,China)

In order to disclose the distribution rule of endophytic bacteria in different organs ofDendrobiumcandidum,the MiSeq high-throughput sequencer of Illumina sequencing platform was used to sequence the amplicon of 16S rDNA-V4 of endophytic bacteria in the root,stem and leaves ofDendrobiumcandidum.Further Bioinformatics analysis was conducted to evaluate the Alpha and Beta diversities of species.After sequence assembly using FLASH software,64 851,77 499 and 52 157 original sequences were obtained from the stem,leaf and root samples,respectively.Filtered by Qiime software,the chloroplast and mitochondria sequences were eliminated,and 64 742,77 351 and 52 064 valid sequences were finally obtained.Based on 97% sequence similarity,these valid sequences were divided into 61,134 and 112 operational taxonomic units(OTUs).The sequence alignment result showed that bothPseudomonasandAcidovoraxbacteria were in the root,stem and leaves,theRuminococcu,Faecalibacterium,MethylobacteriumandShewanellabacteria presented tissue specificity.The abundance clustering analysis and main component analysis showed that the endophytic bacteria in root and leaves had the most similar community structure.TheDendrobiumcandidumplant contains rich bacterial resources,which present organ differentiation under the influence of organizational structure and composition factors.

Dendrobiumcandidum; endophytic bacteria; diversity; high throughput analysis

S567.239

A

1004-3268(2017)11-0098-06

2017-06-27

國家自然科學(xué)基金項目(31460491)；云南省科技廳基礎(chǔ)研究項目(2013FD040)；云南省教育廳科學(xué)研究項目(2014Y390)；昆明學(xué)院大學(xué)生科研項目(XJD16081)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)項目(YJL14005)；云南省高校特色生物資源開發(fā)與利用重點實驗室開放基金項目(GXKJ201621);云南省高校優(yōu)勢特色重點學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項目(05000511311)

陳澤斌(1985-)，男，云南昆明人，副教授，博士，主要從事環(huán)境微生物的教學(xué)及科研工作。

E-mail:zbchenkmu@163.com

*

李 冰(1973-)，女，遼寧沈陽人，高級工程師，碩士，主要從事非臨床藥物安全性評價工作。

E-mail:libing@mail.kiz.ac.cn