廣西地方雞微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258多態(tài)性研究

黃勛和，鄧春苗，柯振華，謝潔如，陳潔波，鐘福生

(嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

廣西地方雞微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258多態(tài)性研究

黃勛和，鄧春苗，柯振華，謝潔如，陳潔波，鐘福生*

(嘉應(yīng)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 梅州 514015)

通過(guò)微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258基因分型和基因測(cè)序，分析6個(gè)廣西地方雞品種的遺傳變異并構(gòu)建中介網(wǎng)絡(luò)圖，研究廣西地方雞的遺傳多樣性與分子進(jìn)化。結(jié)果表明，120份樣品經(jīng)基因分型，檢測(cè)到38個(gè)等位基因，長(zhǎng)度為181～507 bp，等位基因205出現(xiàn)的頻率最高(0.125)，其次是275(0.113)、310(0.100) 和251(0.067)。廣西地方雞保持著較高的遺傳多樣性水平，觀察雜合度、期望雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.800、0.943和0.936。經(jīng)測(cè)序鑒定出39個(gè)等位基因，其中9個(gè)為首次發(fā)現(xiàn)。11個(gè)等位基因與已知的21種血清型相對(duì)應(yīng)。基于側(cè)翼序列變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示，39個(gè)等位基因分為3個(gè)進(jìn)化枝，紅原雞的部分基因存在于這些進(jìn)化枝中，提示紅原雞可能是廣西地方雞的主要祖先。

廣西地方雞； 微衛(wèi)星； LEI0258； 多態(tài)性； 分子進(jìn)化

家禽遺傳資源是動(dòng)物遺傳資源的重要組成部分，研究家禽遺傳多樣性，有助于揭示品種的形成歷史及其相互之間的親緣關(guān)系，對(duì)科學(xué)保護(hù)和合理利用地方品種的優(yōu)良基因庫(kù)具有重要意義[1]。微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258因位于雞的16號(hào)染色體上主要組織相容性復(fù)合體B區(qū)域(major histocompatibility complex B region，MHC-B)而與常規(guī)的微衛(wèi)星標(biāo)記不同[2]。MHC-B的遺傳多態(tài)性通常與宿主的抗病能力相關(guān)[3-4]，并且微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258與MHC-B血清型有較強(qiáng)的對(duì)應(yīng)性[5]。因此，近年來(lái)微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258被廣泛應(yīng)用于家雞的遺傳多樣性和分子進(jìn)化研究[6-10]。黃勛和等[9]應(yīng)用LEI0258研究了華南家雞的遺傳多樣性與進(jìn)化歷史，發(fā)現(xiàn)華南家雞保持著較高的遺傳多樣性，中介網(wǎng)絡(luò)圖分析提示，紅原雞是華南家雞的主要祖先，同時(shí)探討了應(yīng)用LEI0258變異信息進(jìn)行品種鑒定的可行性。

我國(guó)廣西地區(qū)擁有眾多各具特色的本土雞品種，其中有6個(gè)品種入選《中國(guó)畜禽遺傳資源志·家禽志》[11]，其在家雞的馴化研究中具有重要地位。因此，研究廣西地方雞遺傳多樣性與種系關(guān)系，不僅可以了解廣西地方雞遺傳多樣性水平和保護(hù)潛力，也可為家雞馴化起源和擴(kuò)散研究提供新視野。常規(guī)微衛(wèi)星標(biāo)記和線粒體DNA D-loop研究表明，廣西地方雞保持著較高的遺傳變異水平，具有較高的選育潛力，母系起源于東南亞和我國(guó)西南地區(qū)[12-14]。本研究應(yīng)用微衛(wèi)星LEI0258位點(diǎn)變異信息對(duì)廣西地方雞進(jìn)行遺傳多樣性分析，評(píng)估品種保護(hù)潛力，為了解廣西地方雞品種資源動(dòng)態(tài)、提高保種選育效果和促進(jìn)分子進(jìn)化研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

本試驗(yàn)采取東蘭烏雞(DL)、廣西麻雞(GM)、霞煙雞(XY)、龍勝鳳雞(LS)、南丹瑤雞(ND)、廣西三黃雞(GX)6個(gè)廣西地方品種各20份血液樣品，樣品均來(lái)源于原產(chǎn)地。采用傳統(tǒng)的酚氯仿法提取基因組DNA。PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

1.2 PCR擴(kuò)增與基因分型

引物序列：帶熒光標(biāo)記的上游引物L(fēng)EI0258F為FAM-5′-CACGCAGCAGAACTTGGTAAGG-3′，下游引物L(fēng)EI0258R為5′-AGCTGTGCTCAGTCCTCAGTGC-3′[2]。PCR反應(yīng)體系： 3 μL 10×PCR Buffer,2.4 μL dNTPs(含Mg2+)，上、下游引物(20 μmol/L)各0.3 μL，1 UTaqDNA 聚合酶(大連寶生物工程有限公司)，50 ng DNA模板，用滅菌雙蒸水補(bǔ)至30 μL。PCR擴(kuò)增條件： 94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，36個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸7 min。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，對(duì)目的亮帶大小符合預(yù)期的PCR產(chǎn)物送上海翼和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行基因分型。

1.3 微衛(wèi)星測(cè)序

挑選含不同的等位基因個(gè)體(分布于多個(gè)群體的等位基因則挑選不同品種的個(gè)體)，經(jīng)電泳檢測(cè)后將含有目的亮帶的PCR產(chǎn)物送往廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用軟件Cervus 3.0.3計(jì)算期望雜合度(expected heterozygosity，He)、觀察雜合度(observed heterozygosity，Ho)、多態(tài)信息含量(polymorphic information content，PIC)、等位基因數(shù)(NA)和等位基因頻率等[15]。應(yīng)用軟件ADZE 1.0計(jì)算群體的等位基因豐度(Ar)和私有等位基因豐度(Ap)[16]。應(yīng)用序列分析軟件MEGA 6.0編輯整理等位基因序列[17]，并輔以人工校正。利用軟件SplitsTree 4.10建立基于側(cè)翼序列變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖(median-joining network)[18]。根據(jù)已有研究結(jié)果整理血清型與LEI0258等位基因的對(duì)應(yīng)關(guān)系[5,19-20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 LEI0258基因型多態(tài)性

經(jīng)過(guò)基因分型，120個(gè)樣品中檢測(cè)到等位基因數(shù)38個(gè)，片段長(zhǎng)度為181～507 bp。等位基因頻率最高的是205(0.125),其次是275(0.113)、310(0.100)和251(0.067)(表1)。廣西地方雞大部分品種的觀察雜合度較高，除廣西三黃雞和東蘭烏雞外，觀察雜合度均大于0.8；多態(tài)信息含量均大于0.8(表2)。由此可見(jiàn)，廣西地方雞保持著較高的遺傳變異水平。

表1 廣西地方雞群體微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258等位基因統(tǒng)計(jì)

續(xù)表1 廣西地方雞群體微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258等位基因統(tǒng)計(jì)

表2 廣西地方雞群體微衛(wèi)星LEI0258遺傳變異分析

2.2 LEI0258核苷酸多態(tài)性

根據(jù)基因分型的結(jié)果，選取46個(gè)等位基因片段進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得了片段長(zhǎng)度從182 bp到501 bp不等的等位基因39個(gè)，其中9個(gè)等位基因?yàn)槭状伟l(fā)現(xiàn)(表3)。大部分等位基因經(jīng)基因分型和基因測(cè)序所得的片段長(zhǎng)度不同，但也有個(gè)別是一致的(193、194、205和206)。LEI0258呈現(xiàn)典型的重復(fù)單元結(jié)構(gòu)，分別是長(zhǎng)度為13 bp的R13(CTATGTCTTCTTT)和12 bp的R12(CTTTCCTTCTTT)，重復(fù)次數(shù)分別為1～17和2～28不等，不同的等位基因由這2個(gè)重復(fù)單元在數(shù)量上的不同組合構(gòu)成。在2個(gè)重復(fù)區(qū)域的上游有55個(gè)堿基(不含引物序列)，共發(fā)現(xiàn)有8個(gè)變異位點(diǎn)，主要以堿基替換為主，其次是堿基缺失(如在-29～-30出現(xiàn)TT堿基缺失)。而在重復(fù)區(qū)下游的54個(gè)堿基(不含引物序列)中，鑒定出6個(gè)變異位點(diǎn)，變異方式以顛換(如A、T堿基的顛換)為主，其次是C/T轉(zhuǎn)換，并且有少數(shù)插入缺失的現(xiàn)象。在片段長(zhǎng)度小于237 bp的等位基因中，下游11～18位點(diǎn)ATTTTGAG缺失的現(xiàn)象比較普遍，該多態(tài)現(xiàn)象雖然與Fulton等[5]報(bào)道的ATTTGAGG缺失現(xiàn)象不一致，但與Han等[19]、Chazara等[20]和黃勛和等[9-10,21]的報(bào)道結(jié)果相同。

2.3 LEI0258側(cè)翼序列中介網(wǎng)絡(luò)圖分析

除去中間的重復(fù)區(qū)域，獲得了39個(gè)等位基因側(cè)翼序列，構(gòu)建了基于側(cè)翼序列變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。根據(jù)先前的命名方法[9,20]，39個(gè)等位基因分為3個(gè)進(jìn)化枝(A、B和D)，每個(gè)進(jìn)化枝包含等位基因數(shù)7～21個(gè)不等。每個(gè)進(jìn)化枝所包括的品種較豐富，其中南丹瑤雞、龍勝鳳雞和廣西三黃雞更多地集中在A進(jìn)化枝上。雖然有些等位基因在各個(gè)品種中廣泛分布(如205、273、307、309)，但大部分等位基因僅分布于少數(shù)品種中，如193(東蘭烏雞、廣西三黃雞)、283(廣西麻雞、南丹瑤雞)、379(廣西麻雞、霞煙雞)等，并且有個(gè)別等位基因僅存在于某個(gè)單一群體，如206(廣西三黃雞)、237(龍勝鳳雞)、259(南丹瑤雞)、357(霞煙雞)等。綜合之前的測(cè)定數(shù)據(jù)分析可知，紅原雞有部分等位基因與這3個(gè)進(jìn)化枝相同[5,9,20]，11個(gè)LEI0258等位基因與21種已知的MHC血清型相對(duì)應(yīng)，在每個(gè)進(jìn)化枝都有分布[22-23]。

圖1 基于微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258側(cè)翼區(qū)變異信息的中介網(wǎng)絡(luò)圖

3 結(jié)論與討論

群體等位基因豐度、雜合度和多態(tài)信息含量可用于評(píng)價(jià)群體的遺傳變異水平[1]。本研究應(yīng)用微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258分析了6個(gè)廣西地方雞品種的遺傳多樣性及分子進(jìn)化?？傮w上，廣西地方雞保持著較高的遺傳多樣性水平，如觀測(cè)雜合度大部分大于0.8，而多態(tài)信息含量均大于0.8，這與之前的相關(guān)報(bào)道是相符的[9,12-14]。通常地方家雞品種的遺傳多樣性較高，如文昌雞、惠陽(yáng)胡須雞、五華三黃雞等[9]，這與品種的群體數(shù)量和所受選擇壓力較小有關(guān)[1]。此外，廣西地方雞微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258的11個(gè)等位基因分別與21種已知血清型相對(duì)應(yīng)[22-23]，可為其疾病方面的研究提供理論參考。因此，將微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258作為分子標(biāo)記研究雞的群體遺傳多樣性是可行的。

以LEI0258稀有等位基因作為家雞品種鑒定的依據(jù)已得到進(jìn)一步論證[9,19]。本研究首次發(fā)現(xiàn)的9個(gè)LEI0258等位基因中，有部分是特定品種所特有的，如249(南丹瑤雞)、369(廣西麻雞)、332(龍勝鳳雞)和393(霞煙雞)，說(shuō)明LEI0258可作為品種鑒定的候選分子標(biāo)記之一。但由于本研究受限于樣品數(shù)量，后續(xù)研究還需加大樣品數(shù)量，以及結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和其他有效技術(shù)，如DNA條形碼[24]和細(xì)胞色素b基因[25]等進(jìn)一步的探索。

微衛(wèi)星位點(diǎn)LEI0258由2個(gè)重復(fù)單元(R13、R12)的不同數(shù)量組合組成。此外，側(cè)翼序列的變異也可作為等位基因的定義標(biāo)準(zhǔn)，因而等位基因數(shù)量眾多。目前，除本研究新發(fā)現(xiàn)的9個(gè)廣西地方雞特有基因外，在GenBank登錄的LEI0258等位基因已有160個(gè)。基于側(cè)翼區(qū)變異信息構(gòu)建的中介網(wǎng)絡(luò)圖顯示，廣西地方雞分為3個(gè)進(jìn)化枝，而紅原雞中也有部分基因存在于這些進(jìn)化枝中，因此，廣西地方雞可能起源于紅原雞，與先前的研究相吻合[9]。

致謝：感謝廣西大學(xué)夏中生教授、楊秀榮教授、研究生侯宇在采集樣品時(shí)提供的幫助。

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Polymorphisms at the Microsatellite Locus LEI0258 in the Indigenous Chickens from Guangxi Province

HUANG Xunhe,DENG Chunmiao,KE Zhenhua,XIE Jieru,CHEN Jiebo,ZHONG Fusheng*

(School of Life Sciences,Jiaying University,Meizhou 514015)

In order to uncover the genetic diversity and molecular evolution of indigenous chicken of Guangxi province,120 blood samples from 6 breeds were used to microsatellite LEI0258 genotyping and sequencing,and the data were used to analyse genetic variation and construct median-joining network.A total of 38 alleles ranging from 181 bp to 507 bp were found by genotyping,with the allele frequency arrangement of 205(0.125),275(0.113),310(0.100) and 251(0.067).The LEI0258 showed high levels of polymorphism in Guangxi indigenous chickens,with 0.800,0.943 and 0.936 for observed heterozygosity,expected heterozygosity and polymorphic information content,respectively.Thirty-nine alleles were identified by DNA sequencing,and nine of which were newly found.Eleven alleles of LEI0258 were corresponding to 21 available serotypes of MHC.The median-joining network,which was based on the SNPs and indels found within the flanking sequences,39 alleles were classified into three clusters,and partial of those were also found in Red junglefowl.Our results pointed out the Red junglefowl origin for Guangxi indigenous chickens.

Guangxi indigenous chicken; microsatellite; LEI0258; polymorphism; molecular evolution

S831.2

A

1004-3268(2017)11-0127-06

2017-06-16

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014A030307018)；廣東省公益研究與能力建設(shè)項(xiàng)目(2015A020208020, 2016A030303068)；嘉應(yīng)學(xué)院省市共建重點(diǎn)建設(shè)項(xiàng)目(嘉院[2017]27號(hào))

黃勛和(1982-)，男，廣東河源人，副教授，博士，主要從事中國(guó)家雞遺傳多樣性與進(jìn)化研究。

E-mail:hxh826@jyu.edu.cn

*

鐘福生(1958-)，男，湖南衡陽(yáng)人，教授，博士，主要從事動(dòng)物生產(chǎn)與畜牧工程方面研究。

E-mail:zfs@jyu.edu.cn