應(yīng)用DPO技術(shù)檢測(cè)番茄斑萎病毒方法的建立

劉忠梅，羅 佳，潘仲樂(lè)，劉洪義，李丹丹，韓政坤，魏冬旭，馬 微

(1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001； 3.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570125；4.東寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 東寧 157299)

應(yīng)用DPO技術(shù)檢測(cè)番茄斑萎病毒方法的建立

劉忠梅1，羅 佳2，潘仲樂(lè)1，劉洪義1，李丹丹3，韓政坤1，魏冬旭1，馬 微4

(1.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，遼寧 大連 116001； 3.海南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，海南 ?？?570125；4.東寧出入境檢驗(yàn)檢疫局，黑龍江 東寧 157299)

為了準(zhǔn)確、高效地檢出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)，利用雙啟動(dòng)寡核苷酸引物(DPO)技術(shù)，以TSWV外殼蛋白(CP)基因?yàn)榘谢?，設(shè)計(jì)了一對(duì)DPO引物，對(duì)PCR反應(yīng)體系中的引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶用量進(jìn)行優(yōu)化，建立了TSWV的DPO-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其靈敏度、特異性以及退火溫度敏感性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，應(yīng)用DPO引物建立的PCR技術(shù)能夠成功地?cái)U(kuò)增出TSWV的208 bp特異性條帶，與預(yù)期目標(biāo)相符。經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，DPO-PCR反應(yīng)體系(25 μL)為：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每種2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去離子水補(bǔ)充至25 μL。利用該檢測(cè)方法，在49.8～70.0 ℃的退火溫度范圍內(nèi)，均可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因片段的高效擴(kuò)增，說(shuō)明其對(duì)退火溫度不敏感；利用病毒RNA進(jìn)行檢測(cè)，該方法的靈敏度為7.5 ng；通過(guò)對(duì)TSWV、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒和番茄黑環(huán)病毒的檢測(cè)表明，僅TSWV呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)，說(shuō)明該方法特異性強(qiáng)。所建立的DPO-PCR檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確、高效地檢測(cè)TSWV，可用于進(jìn)出境種苗檢疫篩查及田間病害診斷。

番茄斑萎病毒； 雙啟動(dòng)寡核苷酸引物； DPO-PCR； 檢測(cè)

番茄斑萎病是1915年在澳洲番茄上首次發(fā)現(xiàn)的，其病原于1930年被命名為番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)[1]。該病毒為世界性分布，特別是熱帶、溫帶和亞熱帶地區(qū)比較常見(jiàn)[2]。其寄主范圍廣，可侵染80科1 000多種植物，其中包括番茄、烤煙、辣椒、花生等作物，也包括非洲紫羅蘭、萬(wàn)壽菊等多種觀賞植物[3-4]。TSWV在全世界范圍內(nèi)都導(dǎo)致了重大的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)損失[5]。據(jù)報(bào)道，該病毒曾造成澳大利亞花生產(chǎn)量損失高達(dá)90%，印度花生產(chǎn)量損失達(dá)80%[6]；也曾造成夏威夷生菜和番茄產(chǎn)量虧損50%～90%[7]；而在法國(guó)和西班牙等歐洲地區(qū)，隨著傳播介體薊馬的定殖與擴(kuò)散，該病毒能夠?qū)Ψ?、辣椒等造成毀滅性危害，損失最高可達(dá)100%[8]。因此，TSWV被列為世界危害最大的10種植物病毒之一[9]。TSWV可以通過(guò)汁液接種、種子傳染，薊馬也能傳播。感病種苗的貿(mào)易是該病毒遠(yuǎn)距離傳播的方式之一。TSWV是《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》中列明的有害生物，也是歐洲及地中海植物保護(hù)組織(EPPO)檢疫性有害生物。建立該病毒快速、精準(zhǔn)的檢測(cè)方法，能有效地阻止外來(lái)種苗攜帶的病毒入侵，保護(hù)我國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。

雙啟動(dòng)寡核苷酸引物(DPO)技術(shù)2007年由韓國(guó)的Seegene公司首次研制成功[10]，應(yīng)用于感染性疾病診斷，極大地提高了PCR的敏感性和特異性。Kommedal等[11]在人類臨床標(biāo)本細(xì)菌16S rRNA研究中，通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)DPO的設(shè)計(jì)可以防止DNA的交叉反應(yīng)所產(chǎn)生的假陽(yáng)性和假陰性。劉梅等[12]將該技術(shù)應(yīng)用于馬鈴薯病毒的檢測(cè)，表明其特異性強(qiáng)和敏感度高。徐義剛等[13]將該技術(shù)應(yīng)用于食源性致病菌大腸桿菌O157∶H7的檢測(cè)，可以有效阻斷非特異性擴(kuò)增從而避免了假陽(yáng)性的檢測(cè)結(jié)果，顯示出其特異性強(qiáng)。本研究擬采用DPO技術(shù)，建立特異性檢測(cè)TSWV的DPO-PCR方法，為進(jìn)出境種苗檢疫篩查及田間病害診斷提供良好的檢測(cè)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

TSWV、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒和番茄黑環(huán)病毒的陽(yáng)性材料均由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供。

M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶為Promega公司產(chǎn)品，RNasin、 dNTPs、TaqDNA聚合酶和100 bp DNA Ladder(Dye Plus)為大連寶生物(TaKaRa)公司產(chǎn)品，核酸提取試劑為Qiagen RNeasy Plant Mini Kit。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)TSWV 外殼蛋白(CP)基因的保守序列，設(shè)計(jì)了普通引物以及DPO引物(表1)，均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.3 總RNA提取

稱取100 mg TSWV陽(yáng)性材料，用Qiagen RNeasy Plant Mini Kit提取總RNA，用ND-1000超微量分光光度計(jì)測(cè)定其濃度。

1.4 反轉(zhuǎn)錄

反轉(zhuǎn)錄體系20 μL：先加入2 μL總RNA、9 μL DEPC水，70 ℃保溫5 min，冰上放置2 min；再加入4 μL 5×Buffer、2 μL dNTPs (10 mmol/L)、0.5 μL Oligo(dT)18(100 μmol/L)、1 μL Random 6 mer(100 μmol/L)、0.5 μL RNasin (40 U/μL )、1 μL M-MLV (200 U/μL)，42 ℃保溫1 h。95 ℃滅活5 min，放置冰上待用。

1.5 DPO-PCR反應(yīng)

DPO-PCR反應(yīng)體系25 μL：dNTPs(每種2.5 mmol/L)用量范圍為0.01～5.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)用量范圍為0.001～0.5 μL,DPO引物(上、下游引物各20 μmol/L)用量范圍為0.05～2.0 μL，10×Buffer(含Mg+)2.5 μL，模板1 μL，以ddH2O補(bǔ)充至25 μL。反應(yīng)條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s,35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，并記錄結(jié)果。

1.6 DPO-PCR退火溫度敏感性試驗(yàn)

將DPO-PCR退火溫度范圍設(shè)為49.8～70.0 ℃，用DPO引物進(jìn)行擴(kuò)增試驗(yàn)，以普通PCR引物作為參照，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.7 DPO-PCR靈敏度試驗(yàn)

分別取TSWV樣品總RNA 5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μL作為反轉(zhuǎn)錄模板，進(jìn)行RT-PCR，對(duì)DPO-PCR的靈敏度進(jìn)行測(cè)定。

1.8 DPO-PCR特異性試驗(yàn)

取TSWV、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒和番茄黑環(huán)病毒等4種均能侵染茄科植物的檢疫性病毒的cDNA作為模板，同時(shí)用健康馬鈴薯植株葉片作陰性對(duì)照，分析DPO-PCR的特異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法的建立

基于DPO引物設(shè)計(jì)方法，以TSWV CP基因的保守序列為靶序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)DPO引物，經(jīng)反應(yīng)體系優(yōu)化，建立TSWV的DPO-PCR檢測(cè)方法。從圖1a可以看出，隨著dNTPs加入量的增加，擴(kuò)增到的目的條帶逐漸變亮，當(dāng)加入量為2.0 μL時(shí)達(dá)到最亮，之后不再隨加入量的增加而增強(qiáng)。從圖1b可以看出，TaqDNA聚合酶加入量與PCR擴(kuò)增效率呈正相關(guān)，當(dāng)加入量為0.2 μL時(shí)足以有效地?cái)U(kuò)增到目標(biāo)條帶。從圖1c可以看出，隨著引物量的減少，擴(kuò)增的目標(biāo)條帶總體上越來(lái)越弱，當(dāng)加入量為1.0 μL時(shí)擴(kuò)增效果最佳。因此，TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法中最優(yōu)化的反應(yīng)體系(25 μL)為：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每種2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去離子水補(bǔ)充至25 μL。采用該最優(yōu)體系檢測(cè)TSWV陽(yáng)性樣品，可以有效地?cái)U(kuò)增到目標(biāo)條帶(圖1d)。

a.dNTPs(每種2.5 mmol/L)用量?jī)?yōu)化，其中，M:100 bp DNA Ladder(下同);1—9:dNTPs用量分別為0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μL。b.Taq DNA聚合酶(5 U/μL)用量?jī)?yōu)化，其中，1—9:Taq DNA聚合酶用量分別為0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μL。c.DPO 引物(20 μmol/L)用量?jī)?yōu)化，其中，1—6:DPO 引物用量分別為2.0、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05 μL。d.TSWV DPO-PCR最優(yōu)化的反應(yīng)體系，其中，1—2:DPO-PCR反應(yīng)結(jié)果

2.2 TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法退火溫度敏感性試驗(yàn)結(jié)果

圖2結(jié)果顯示，所建立的DPO-PCR方法在49.8～70.0 ℃的退火溫度范圍內(nèi)均能進(jìn)行高效率的擴(kuò)增，且擴(kuò)增效率基本保持一致，說(shuō)明DPO引物的退火溫度范圍較寬；而普通PCR方法則存在最適退火溫度。

M:100 bp DNA Ladder;1—9:退火溫度分別為49.8、51.5、53.4、58.3、61.0、63.7、66.1、68.0、70.0 ℃,其中，左邊1—9泳道為普通PCR結(jié)果，右邊1—9泳道為DPO-PCR結(jié)果

2.3 TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法靈敏度試驗(yàn)結(jié)果

經(jīng)分光光度計(jì)測(cè)定，提取的TSWV樣品總RNA質(zhì)量濃度為150 ng/μL。對(duì)不同用量的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后采用DPO-PCR方法擴(kuò)增檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著反轉(zhuǎn)錄模板用量的降低，目標(biāo)條帶逐漸變?nèi)?。?dāng)總RNA取5～0.05 μL時(shí)，DPO-PCR均能擴(kuò)增到目標(biāo)條帶，而總RNA取0.025 μL時(shí)，DPO-PCR不能擴(kuò)增到目標(biāo)條帶(圖3)。因此，利用建立的DPO-PCR方法能有效地檢出7.5 ng 的TSWV RNA，該方法的檢測(cè)靈敏度為7.5 ng。

M:DL2000 DNA Marker;1—8:分別取5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μL TSWV RNA作為模板，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和DPO-PCR反應(yīng)

2.4 TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的DPO-PCR方法檢測(cè)4種供試植物病毒，結(jié)果表明，以TSWV cDNA為模板能夠擴(kuò)增出208 bp條帶，與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致，而其他病毒陽(yáng)性材料和陰性對(duì)照均未擴(kuò)增到目的條帶，且無(wú)非特異性擴(kuò)增(圖4)，說(shuō)明本研究建立的TSWV DPO-PCR檢測(cè)方法特異性強(qiáng)。

M:DL2000 DNA Marker;1—4:分別取TSWV、番茄環(huán)斑病毒、煙草環(huán)斑病毒和番茄黑環(huán)病毒的cDNA作為模板，進(jìn)行DPO-PCR反應(yīng)；5：陰性對(duì)照

3 結(jié)論與討論

植物檢疫是種傳病害風(fēng)險(xiǎn)管理中一個(gè)重要的措施，各國(guó)政府制定相應(yīng)的政策法規(guī)對(duì)種苗健康進(jìn)行檢測(cè)和管理，阻止外來(lái)病原物(病毒、真菌、細(xì)菌等)的進(jìn)入，保護(hù)本國(guó)的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。隨著種苗調(diào)運(yùn)和國(guó)際種苗貿(mào)易的迅速發(fā)展，植物病毒檢疫在國(guó)際種苗貿(mào)易中受到越來(lái)越多的重視，研究一些快速、準(zhǔn)確、靈敏的種苗病毒檢疫技術(shù)成為各國(guó)植物檢疫技術(shù)研究的重點(diǎn)。目前，TSWV快速檢測(cè)最常見(jiàn)的方法是普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。引物設(shè)計(jì)是制約該類檢測(cè)方法成敗的關(guān)鍵性因素[14-15]。本研究引入一種利用DPO引物的PCR技術(shù)，用于檢測(cè)TSWV。與普通PCR引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物相比，DPO引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，不需要反復(fù)比對(duì)引物的特異性，也不需要優(yōu)化引物的各項(xiàng)參數(shù)與反應(yīng)條件。本研究還表明，采用DPO-PCR方法檢測(cè)TSWV時(shí)，在49.8～70.0 ℃的退火溫度下，均能保持高效擴(kuò)增，不同于普通PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR需要選擇最適的退火溫度。因此，DPO-PCR大大地簡(jiǎn)化了引物設(shè)計(jì)、試驗(yàn)操作，且節(jié)約成本。經(jīng)過(guò)對(duì)引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶用量的優(yōu)化，建立了TSWV DPO-PCR反應(yīng)體系(25 μL)：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每種2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去離子水補(bǔ)充至25 μL。采用該最優(yōu)體系檢測(cè)TSWV陽(yáng)性樣品，可以有效地?cái)U(kuò)增到目標(biāo)條帶。

DPO引物中加入了多聚次黃嘌呤(polyI)，該多聚次黃嘌呤由弱的氫鍵連接，所以它比其他堿基的熔點(diǎn)低，同時(shí)多聚次黃嘌呤把DPO引物分成了兩部分，起到了固定作用并決定著引物的特異性延伸。由于DPO引物特殊的結(jié)構(gòu)，使其自身或者引物之間很少形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二級(jí)結(jié)構(gòu)，提高了擴(kuò)增效率，DPO引物與模板發(fā)生錯(cuò)配的概率很小，一旦有3個(gè)以上堿基錯(cuò)配，就不會(huì)成功擴(kuò)增，保證了擴(kuò)增的特異性[16-17]。本研究中特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，DPO技術(shù)能準(zhǔn)確地鑒定出目標(biāo)植物病毒，其他植物病毒無(wú)交叉反應(yīng)和非特異性反應(yīng)。該技術(shù)顯示出了良好的可靠性和實(shí)用性，為T(mén)SWV的準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新手段，為種苗調(diào)運(yùn)和國(guó)際種苗貿(mào)易的迅速發(fā)展提供了技術(shù)保障。

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Development of DPO-PCR Detection Method for Tomato Spotted Wilt Virus

LIU Zhongmei1,LUO Jia2,PAN Zhongle1,LIU Hongyi1,LI Dandan3,HAN Zhengkun1,WEI Dongxu1,MA Wei4

(1.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;2.Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian 116001,China; 3.Technical Centre of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570125,China; 4.Dongning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Dongning 157299,China)

In order to accurately and efficiently detect tomato spotted wilt virus(TSWV),in this study,a pair of dual-priming oligonucleotide(DPO) primers was designed based on TSWV coat protein(CP) gene by DPO technology and through optimization of reaction system factors including concentrations of primer,dNTPs andTaqDNA polymerase,a DPO-PCR detection method for TSWV was established.Its sensitivity,specificity and annealing temperature sensitivity were also evaluated.The results showed that the expected fragment of 208 bp was successfully amplified by the DPO-PCR system.The optimal DPO-PCR system(25 μL) was as follows:DNA 1 μL，10×Buffer (Mg2+Plus ) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L for each)2.0 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，each primer(20 μmol/L)1.0 μL，with deionized water to supplement the system.The target gene could be efficiently amplified by the DPO primers in the annealing temperature range from 49.8 ℃ to 70.0 ℃,showing that the method was insensitive to annealing temperature.The detection sensitivity of the method was 7.5 ng when viral RNA was used as template.TSWV,tomato ringsopt virus,tobacco ring spot virus and tomato black ring virus were simultaneously detected by the method,and positive reaction appeared only for TSWV,indicating that the method had strong specificity.The established method can detect TSWV accurately and efficiently,and thus can be used for quarantine screening and disease diagnosis of entry and exit seedlings.

tomato spotted wilt virus; dual-priming oligonucleotide; DPO-PCR; detection

S432.4+1

A

1004-3268(2017)11-0093-05

2017-05-13

哈爾濱市科技創(chuàng)新人才研究專項(xiàng)(2012RFQQN029)；國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013IK051)

劉忠梅(1976-)，女，山東萊州人，高級(jí)農(nóng)藝師，博士，主要從事植物檢疫工作。E-mail:liuzhmei@163.com