黔產(chǎn)9種薯蕷屬植物分子鑒別及親緣關(guān)系研究

魏怡冰，魏升華，王志威，嚴(yán)福林

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

黔產(chǎn)9種薯蕷屬植物分子鑒別及親緣關(guān)系研究

魏怡冰，魏升華*，王志威，嚴(yán)福林

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000)

為揭示黔產(chǎn)薯蕷屬植物9個(gè)種之間的親緣關(guān)系，根據(jù)葉綠體matK、rbcL、psbA-trnH序列片段對(duì)其進(jìn)行種間分子鑒別研究。結(jié)果表明，黔產(chǎn)薯蕷屬植物9個(gè)種的matK、psbA-trnH、rbcL序列長(zhǎng)度分別為1 076～1 144 bp、361～382 bp、1 160～1 209 bp，當(dāng)空位始終做缺失處理時(shí)，其變異位點(diǎn)分別占序列總長(zhǎng)度的14.3%、7.8%及8.7%。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，來(lái)自9個(gè)種31份樣本的薯蕷屬植物分為了4個(gè)大組。其中，黃獨(dú)單獨(dú)為一組，為基生翅組；黑珠芽薯蕷和高山薯蕷聚為一組，為復(fù)葉組；光亮薯蕷和毛膠薯蕷聚為一組，為頂生翅組；光葉薯蕷、薯莨、日本薯蕷以及薯蕷聚為一組，為周生翅組。表明matK、rbcL、psbA-trnH序列片段對(duì)薯蕷屬植物的系統(tǒng)分類具有明顯的指導(dǎo)價(jià)值。

薯蕷屬； DNA條形碼；matK；rbcL；psbA-trnH

薯蕷科植物中，我國(guó)僅有薯蕷屬(Dioscorea)1個(gè)屬，共52種，分為8個(gè)組[1-2]。貴州分布的薯蕷屬植物共有25種以及1變種、1引種[3]，大多可作為民族藥材入藥，主要用于脾虛泄瀉、消渴、帶下、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、胃痛、跌打損傷、無(wú)名腫毒等癥。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，原有的薯蕷屬植物分類與分子鑒別試驗(yàn)結(jié)果吻合度不高，對(duì)藥用的準(zhǔn)確性造成了一定影響[4-5]。

分子鑒定方法是指用于動(dòng)植物進(jìn)化關(guān)系及系統(tǒng)學(xué)研究的DNA序列、分子標(biāo)記和指紋圖譜等各種分析技術(shù)的總稱。該方法于20世紀(jì)90年代中期開始用于藥用植物的鑒定，例如Cheung等[6]、曹暉等[7]先后采用AP-PCR、RAPD等方法鑒定人參、苦地膽等中藥材。近年來(lái)，針對(duì)傳統(tǒng)分子遺傳標(biāo)記技術(shù)遇到的瓶頸問(wèn)題，有學(xué)者利用DNA條形碼的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，將其成功應(yīng)用于鹿茸、赤芍和威靈仙等中藥材及其混偽品的鑒別中[8-10]。Guo等[11]利用DNA條形碼psbA-trnH、rbcL、matK 3個(gè)片段對(duì)唇形科藥用植物黃芩及其3種混偽品進(jìn)行了鑒別;Sui等[12]也利用DNA條形碼的這3個(gè)片段對(duì)6種清風(fēng)藤屬植物和7種市場(chǎng)混淆品進(jìn)行鑒定。而薯蕷屬植物藥用易混淆，以常規(guī)鑒別方法難以準(zhǔn)確區(qū)分其種類，因此，為保證薯蕷屬植物的用藥準(zhǔn)確性，選用rbcL、matK及psbA-trnH序列，對(duì)薯蕷屬9個(gè)種31份樣本進(jìn)行分子鑒定，分析薯蕷屬植物9個(gè)種之間的親緣關(guān)系，為薯蕷屬植物的系統(tǒng)分類研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

野外采集薯蕷屬植株活體，引種至貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院種質(zhì)圃，經(jīng)魏升華副教授鑒定，憑證標(biāo)本保存于貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院生藥教研室標(biāo)本室，其樣本具體信息如表1所示。共31份樣本，均為生長(zhǎng)狀況良好的植株中部健康葉片，去掉主脈后用70%乙醇擦去葉面灰塵，用于總DNA的提取。

1.2 試劑

Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒、TaqPCR Master Mix、4S Green Plus染料、DNA Marker等均購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司，引物(表2)合成及序列測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表1 9個(gè)種31份薯蕷屬植物來(lái)源

表2 試驗(yàn)所用引物

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總DNA提取 總DNA的提取按照生工生物工程(上海)股份有限公司的Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒操作說(shuō)明書進(jìn)行，提取所得基因組DNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增 對(duì)9種薯蕷屬植物共計(jì)31份樣本的matK、rbcL及psbA-trnH片段分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增反應(yīng)在ProFlex PCR System上進(jìn)行。反應(yīng)體系為50 μL，其中包括：2 μL DNA模板、正向和反向引物各2 μL、TaqPCR Master Mix 24 μL，以ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，適度退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)熱循環(huán)；72 ℃后延伸2 min。取2 μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)4S Green Plus染色，用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察并拍照。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，送樣至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序引物為PCR引物。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析 得到測(cè)序結(jié)果后，將所有序列用Muscle 3.6軟件進(jìn)行排序，然后利用Gblock 0.91b軟件進(jìn)行序列保守區(qū)的選擇并將兩端切平。利用Mega 4.0對(duì)處理好的序列構(gòu)建Maximum Parsimony(MP)樹，設(shè)置Close-neighbor-interchange(CNI)水平為3，Random Addition trees為10。獲取50%一致性系統(tǒng)進(jìn)化樹(50% Majority rule consensus tree)，進(jìn)行靴帶法(Bootstrap analysis)檢測(cè)，抽樣次數(shù)為1 000。根據(jù)靴帶支持率(BS)評(píng)估各分支可靠性。BS≤50為不支持；BS介于51～75為低支持，BS介于76～85為中度支持；BS≥86為高支持或強(qiáng)烈支持。

2 結(jié)果與分析

2.1 matK、rbcL及psbA-trnH片段擴(kuò)增

測(cè)序后所得的各片段長(zhǎng)度及堿基含量如表3所示，薯蕷屬植物9個(gè)種31份樣本的3條基因片段matK、psbA-trnH、rbcL長(zhǎng)度分別為1 076～1 144 bp、361～382 bp、1 160～1 209 bp。序列經(jīng)比對(duì)，排序后兩端切平，31份材料中3條基因片段的序列總長(zhǎng)度在2 628～2 710 bp，(G+C)含量在38.24%～39.38%。

表3 matK、rbcL及psbA-trnH 3條片段擴(kuò)增結(jié)果

2.2 matK、psbA-trnH、rbcL片段的序列分析

31份材料的片段擴(kuò)增中，matK序列排序后兩端切平，當(dāng)空位始終做缺失處理時(shí)，序列長(zhǎng)1 032 bp，含變異位點(diǎn)148個(gè)，占序列總長(zhǎng)度的14.3%；psbA-trnH序列排序后兩端切平，當(dāng)空位始終做缺失處理時(shí)，序列長(zhǎng)361 bp，含變異位點(diǎn)28個(gè)，占序列總長(zhǎng)度的7.8%；rbcL序列排序后兩端切平，當(dāng)空位始終做缺失處理時(shí)，序列長(zhǎng)1 103 bp，含變異位點(diǎn)96個(gè)，占序列總長(zhǎng)度的8.7%。

2.3 基于matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的系統(tǒng)發(fā)育分析

從圖1可以看出，基于對(duì)matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP分析，來(lái)自9個(gè)種31份樣本的薯蕷屬植物分為了4組。其中，來(lái)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院A3苗圃(HD-1—HD-3)、貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院苗圃(HD-4)和紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)(HD-5)的黃獨(dú)單獨(dú)為一組，為基生翅組；來(lái)自紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)(HZY)的黑珠芽薯蕷和來(lái)自平壩縣高峰山(GS-1)、紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)(GS-2)、貴陽(yáng)市花溪區(qū)平橋(GS-3)及貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院苗圃(GS-4)的高山薯蕷聚為一組，為復(fù)葉組；來(lái)自平壩縣高峰山(GL-1—GL-3)的光亮薯蕷和來(lái)自貴陽(yáng)市花溪區(qū)思雅(MJ-1)、紫云縣板當(dāng)鎮(zhèn)(MJ-2)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?MJ-3—MJ-5)的毛膠薯蕷聚為一組，為頂生翅組；來(lái)自大方縣天生橋(GY)的光葉薯蕷，來(lái)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院苗圃(SL)的薯莨，來(lái)自貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院苗圃(RB-1)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?RB-2—RB-4)的日本薯蕷，來(lái)自苗圃(SY-1—SY-3)、貴陽(yáng)市花溪區(qū)思雅(SY-4)、施秉縣雙井鎮(zhèn)龍?zhí)链?SY-5—SY-7)的薯蕷聚為一組，為周生翅組。

圖1 matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP進(jìn)化樹分析

3 結(jié)論與討論

從葉綠體基因組中選擇植物DNA條形碼對(duì)植物進(jìn)行分類鑒別是可行的[13]，但是，單一片段解決全球植物的分類鑒定問(wèn)題不太可能，Kress等[14]提出的多片段組合方法得到了廣泛認(rèn)可。生命條形碼聯(lián)盟建議將葉綠體基因matK、rbcL、psbA-trnH和核基因ITS作為陸地植物通用的DNA條形碼。matK基因全長(zhǎng)約1 500 bp，是葉綠體基因組的蛋白質(zhì)編碼基因中進(jìn)化速率最快的基因之一，常用于分析被子植物中科級(jí)水平的系統(tǒng)關(guān)系[15-16]。其變異較為均一，在構(gòu)建系統(tǒng)樹時(shí)不必對(duì)不同類型的變異進(jìn)行加權(quán)，極大地增強(qiáng)了分子系統(tǒng)樹的可靠性[15]。rbcL基因全長(zhǎng)約1 434 bp，進(jìn)化速率較低，常用于分析遠(yuǎn)緣屬間及科以上水平的系統(tǒng)發(fā)育問(wèn)題[16]。psbA-trnH間隔序列較短，通用性好，且具有足夠變異，對(duì)近緣種有較好的識(shí)別能力。ITS片段在物種水平上變異較大，且已廣泛應(yīng)用于物種分類及系統(tǒng)進(jìn)化研究，但擴(kuò)增成功率是ITS作為條形碼應(yīng)用的一個(gè)限制因素[17-18]。

本研究采集了貴州省8個(gè)不同環(huán)境的9種薯蕷屬植物，共計(jì)31個(gè)樣本，分別對(duì)其進(jìn)行了DNA條形碼3條序列的擴(kuò)增。結(jié)果顯示，matK序列的變異位點(diǎn)占序列總長(zhǎng)度的14.3%，psbA-trnH序列的變異位點(diǎn)占總長(zhǎng)度的7.8%，rbcL序列變異位點(diǎn)占總長(zhǎng)度的8.7%。相對(duì)而言，在黔產(chǎn)9種薯蕷屬植物中，matK片段顯示出較高的變異速率。由遺傳相似性分析可知，基于對(duì)matK、psbA-trnH、rbcL聯(lián)合片段的MP分析，來(lái)自9個(gè)種31份材料的薯蕷屬植物被分為周生翅組、基生翅組、頂生翅組和復(fù)葉組。其中，黃獨(dú)單獨(dú)為一組。黑珠芽薯蕷和高山薯蕷聚為一組，且該分支下黑珠芽薯蕷與高山薯蕷得到較為明顯的區(qū)分。而在周生翅組中，光葉薯蕷、薯莨和日本薯蕷及薯蕷聚為一組，且光葉薯蕷、薯莨與后兩者有較為明顯的區(qū)分，但是，日本薯蕷與薯蕷在系統(tǒng)進(jìn)化樹中并未得到明顯的區(qū)分。光亮薯蕷和毛膠薯蕷聚為一組，且分支下有種間交錯(cuò)現(xiàn)象。從本研究所得的系統(tǒng)進(jìn)化結(jié)果來(lái)看，單純的DNA條形碼(matK、psbA-trnH、rbcL)研究可以滿足薯蕷屬下9個(gè)種絕大多數(shù)植物的鑒別，而對(duì)于毛膠薯蕷與光亮薯蕷、薯蕷與日本薯蕷等極為相近的種，需做進(jìn)一步的條形碼引物篩選。

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Molecular Identification and Genetic Relationship of 9 Dioscorea Species in Guizhou Province

WEI Yibing，WEI Shenghua*，WANG Zhiwei，YAN Fulin

(Guiyang University of Chinese Medicine,Guiyang 550000,China)

In order to reveal the genetic relationship between 9 species ofDioscoreain Guizhou province,the molecular identification of the species was conducted using the sequence fragments of chloroplast genesmatK,rbcL andpsbA-trnH.The results showed that the lengths ofmatK,psbA-trnH andrbcL in 9 species ofDioscoreain Guizhou province were 1 076—1 144 bp,361—382 bp and 1 160—1 209 bp.When the vacancy was treated as deletion,the ratio of the mutation site in the total length was 14.3%,7.8% and 8.7%,respectively.Phylogenetic analysis showed that 9 species ofDioscoreaderived from the 31 provenances were divided into four groups.Among them,DioscoreabulbiferaL.belonged to the cluster of Sect.Opsophyton Uline.DioscoreamelanophymaPrain et Burkill andDioscoreahenryi(Prain et Burkill) C.T.Ting belonged to the cluster of Sect.Lasiophyton Uline.DioscoreasubcalvaPrain et Burkill andDioscoreanitensPrain et Burkill belonged to the cluster of Sect.Shannicorea Prainet Burkill.DioscoreaglabraRoxb.,DioscoreacirrhosaLour.,DioscoreajaponicaThunb.andDioscoreaoppositaThunb.belonged to the cluster of Sect.Enantiophyllum Uline.The results show thatmatK,rbcL andpsbA-trnH have obvious guidance for systematic classification ofDioscorea.

Dioscorea； DNA barcode；matK；rbcL；psbA-trnH

S567.23+9

A

1004-3268(2017)11-0108-05

2017-05-08

國(guó)家中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目

魏怡冰(1994-)，女，河北趙縣人，在讀碩士研究生，研究方向：中藥與民族藥品質(zhì)鑒定。

E-mail:1530112096@qq.com

*

魏升華(1965-)，男，貴州黔西人，教授，主要從事藥用植物資源、引種馴化、中藥材生產(chǎn)與民族醫(yī)藥開發(fā)等教學(xué)和研究。E-mail:weishenghua6512@126.com