番茄與葉霉菌互作過程中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)和功能分析

王秋穎，薛東齊，陳秀玲，李景富，王傲雪,*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

番茄與葉霉菌互作過程中WRKY轉(zhuǎn)錄因子的生物信息學(xué)和功能分析

王秋穎1，薛東齊2，陳秀玲2，李景富2，王傲雪1,2*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030； 2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030)

為了明確含Cf-12基因的番茄與葉霉菌非親和互作過程中WRKY轉(zhuǎn)錄因子所扮演的角色，首先對(duì)非親和互作4 d和8 d轉(zhuǎn)錄組中WRKY基因的表達(dá)量進(jìn)行比較分析，然后對(duì)相關(guān)WRKY基因進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和病毒接種的基因沉默驗(yàn)證。結(jié)果表明，非親和互作過程中共富集到22個(gè)WRKY基因，其中Solyc07g047960.2在接菌后8 d時(shí)的表達(dá)量達(dá)到近20倍。依據(jù)WRKY基因CDS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹以及表達(dá)量分析結(jié)果，部分WRKY基因的表達(dá)量在兩時(shí)間點(diǎn)差異不大，但Cluster Ⅲ中有7個(gè)WRKY基因呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)。對(duì)WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默(接種TRV-WRKY)后的番茄植株接種葉霉菌進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，接菌后該基因的表達(dá)量相對(duì)于接菌前所有提升，且葉片上的過敏性壞死斑點(diǎn)數(shù)量明顯低于對(duì)照組(接種TRV)。以上結(jié)果表明，WRKY(Solyc07g047960.2)基因在含Cf-12基因的番茄與葉霉菌的非親和互作過程中呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，積極地參與到對(duì)葉霉菌的抗性反應(yīng)過程中。

番茄； 葉霉菌； WRKY； 差異表達(dá)； 基因沉默； 抗性反應(yīng)

番茄為世界上重要的食用果蔬，其植株在生長(zhǎng)發(fā)育過程中時(shí)刻受到生物和非生物因素的影響，其中尤以生物因素中病毒和病原真菌的侵染最為嚴(yán)重。番茄應(yīng)對(duì)病原物的侵染主要表現(xiàn)出病原相關(guān)因子激發(fā)的抗性(pathogen associated molecular pattern triggered immunity，PTI)[1]和效應(yīng)因子激發(fā)的免疫(effector triggered immunity，ETI)[2]。針對(duì)番茄與葉霉菌的互作，目前已在智利番茄、秘魯番茄和多毛番茄等多個(gè)野生番茄中發(fā)現(xiàn)和克隆出Cf-1、Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9、Cf-9DC等多個(gè)抗性基因[3]，同時(shí)也在葉霉菌中發(fā)現(xiàn)了與之對(duì)應(yīng)的效應(yīng)因子Avr1、Avr2、Avr4、Avr5、Avr9等[4-6]，也證實(shí)番茄Cf抗性基因與葉霉菌的Avr效應(yīng)因子符合“gene-for-gene”假說[7]。在Cf-4、Cf-9介導(dǎo)的下游抗性反應(yīng)通路中，大量的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor，TF)參與其中，調(diào)控著靶基因的表達(dá)，發(fā)揮著重要的作用。根據(jù)核心結(jié)構(gòu)域的不同，可將TF分為bHLH、bZIP、MYB、ERF、MADS、Zinc-finger、WRKY等多個(gè)不同的家族[8]。WRKY是其中一類重要的TF家族[9]，其N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，并在水稻[10]、擬南芥[11-12]、棉花[13]、煙草[14]、大麥[15]、小麥[16]、豆類[17]等植物中大量存在。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過識(shí)別靶基因啟動(dòng)子區(qū)的W-box序列，特異性地調(diào)控下游基因的表達(dá)，并積極參與到植物對(duì)病原物的抗性反應(yīng)中[9]。

目前，對(duì)番茄Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9基因與葉霉菌非親和互作過程的研究較為成熟，但對(duì)于其他抗葉霉病基因的WRKY等轉(zhuǎn)錄因子的研究則剛剛起步。本研究對(duì)Cf-12基因與葉霉菌非親和互作的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中的WRKY數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，以期發(fā)現(xiàn)在非親和互作過程中特異性表達(dá)的WRKY基因，同時(shí)采用病毒介導(dǎo)的基因沉默方法(virus-induced gene silencing，VIGS)對(duì)WRKY基因進(jìn)行沉默驗(yàn)證，從而對(duì)Cf與葉霉菌的非親和互作認(rèn)知奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)數(shù)據(jù)來源

用于生物信息學(xué)分析的WRKY數(shù)據(jù)來源于2016年東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組測(cè)定的Cf-12基因與葉霉菌非親和互作的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，其NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫的RUN注冊(cè)號(hào)為SRR4041970、SRR4041973、SRR4041974、SRR4041975、SRR4042017、SRR4042029、SRR4042030、SRR4042031、SRR4042032。通過iTAK軟件在PlantTFDB[18](plant transcription factor database，http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中將被定義在番茄轉(zhuǎn)錄因子家族中的WRKY基因進(jìn)行比對(duì)鑒定，并通過ClusterW進(jìn)行WRKY基因CDS序列的多序列比對(duì)，利用MEGA的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)通過1 000次校驗(yàn)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹。同時(shí)根據(jù)這些WRKY基因在接種葉霉菌后轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的4 d和8 d差異表達(dá)量，采用HemI (Heatmap Illustrator，version 1.0)軟件構(gòu)建熱圖，進(jìn)一步分析WRKY基因在非親和互作中扮演的角色。

1.2 WRKY基因的VIGS驗(yàn)證

1.2.1 試驗(yàn)材料 含Cf-12基因的CGN7495番茄種子和葉霉菌由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院番茄課題組提供；分別含pTRV2-PDS質(zhì)粒、pTRV1質(zhì)粒、pTRV2質(zhì)粒的農(nóng)桿菌GV3101由清華大學(xué)的劉玉樂教授饋贈(zèng)；BamHⅠ、XbaⅠ等購(gòu)于MBI公司，DNA膠回收和純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于北京康為試劑公司；用于VIGS的引物由Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)，序列為上游5′-GCTCTAGACCCTAGTACCTGGAAAG-3′，下游5′-CGCGGATCCTGTCTGGTCGTCTCGT-3′(下劃線為酶切位點(diǎn))，由華大基因公司合成。

1.2.2 VIGS載體構(gòu)建 含Cf-12基因的CGN7495番茄材料總RNA提取參照Trizol法，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA，利用WRKY(Solyc07g047960.2)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，其反應(yīng)體系和反應(yīng)參數(shù)見表1和表2。將PCR擴(kuò)增和純化得到的WRKY保守序列及pTRV2質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ和XbaⅠ的雙酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系為：PCR回收產(chǎn)物(或pTRV2質(zhì)粒)3 μg，BamHⅠ(10 U/μL)1 μL，XbaⅠ(10 U/μL)2 μL，10×Buffer 3.5 μL，加ddH2O至35 μL；37 ℃酶切4 h，65 ℃滅活20 min。立即采用DNA Clean-up Kit回收酶切后的pTRV2質(zhì)粒和目標(biāo)片段，并用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取成功連接并轉(zhuǎn)化的DH5α質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。

表1 PCR反應(yīng)體系

表2 PCR反應(yīng)參數(shù)

1.2.3 農(nóng)桿菌侵染 農(nóng)桿菌GV3101注射侵染參照史艷梅等[19]的方法，其中以pTRV1 & pTRV2(TRV)為陰性對(duì)照，pTRV1 & pTRV2-PDS(TRV-PDS)為陽性對(duì)照，pTRV1 & pTRV2-WRKY(TRV-WRKY)為試驗(yàn)組。將注射接種后的2～3葉期番茄植株置于16 h/8 h(光/暗)、60%濕度、20～22 ℃下進(jìn)行正常管理。當(dāng)陽性對(duì)照植株新葉出現(xiàn)光漂白癥狀時(shí)，采用引物(上游5′-CTGAAACGAGACGACCAGACA-3′，下游5′-CGACCACCATTATTATCACCC-3′)對(duì)WRKY(Solyc07g047960.2)基因進(jìn)行熒光定量(qRT-PCR)檢測(cè)，以測(cè)定WRKY(Solyc07g047960.2)基因的沉默效率。

1.2.4 葉霉菌的接種處理和鑒定分級(jí) 對(duì)于沉默處理的植株，采用噴霧接種法于葉背面接種孢子濃度為1×107個(gè)/mL的葉霉菌，接種前保持99%濕度24 h，接種后保持95%濕度，晝/夜溫度25 ℃/22 ℃，每天光照時(shí)間14 h，以TRV沉默處理后接種葉霉菌的番茄植株為對(duì)照。對(duì)接種后各基因沉默植株的癥狀調(diào)查和抗感性鑒定采用孟凡娟等[20]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 WRKY基因的差異表達(dá)分析

根據(jù)Cf-12基因與葉霉菌非親和互作的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，共顯著富集到60個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中WRKY基因家族含有22個(gè)WRKY基因，其表達(dá)量見表3，非親和互作的過程中，表達(dá)量最高的Solyc07g047960.2在接菌后8 d表達(dá)量達(dá)到近20倍，共有8個(gè)WRKY基因表達(dá)量在3倍以上。根據(jù)WRKY基因在4 d和8 d時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量構(gòu)建熱圖(圖1)，這22個(gè)WRKY基因的表達(dá)情況總體呈現(xiàn)出2種趨勢(shì)，即8 d大于4 d的表達(dá)量，以及部分WRKY基因的表達(dá)量在兩時(shí)間點(diǎn)的差異不明顯(如Solyc05g007110.2、Solyc07g056280.2、Solyc09g066010.2和Solyc10g084380.1)。對(duì)22個(gè)WRKY基因的CDS序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果如圖2所示，這22個(gè)WRKY基因按照進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近可以分為3個(gè)Cluster，其中上調(diào)表達(dá)量最大的Solyc07g047960.2基因位于Cluster Ⅲ。從Cluster Ⅲ中能夠看到，該類群的8個(gè)WRKY基因除Solyc02g072190.2在兩時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異不大外，其余7個(gè)WRKY基因均呈現(xiàn)8 d的表達(dá)量明顯高于4 d的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；而ClusterⅠ中的8個(gè)WRKY基因，除Solyc05g050340.2、Solyc04g072070.2和Solyc02g093050.2在8 d的表達(dá)量明顯高于4 d外，其余5個(gè)WRKY基因在兩時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異不大。說明在Cf-12基因與葉霉菌非親和互作過程中，這些明顯上調(diào)表達(dá)的WRKY基因可能發(fā)揮著重要的作用。

表3 非親和互作過程中差異表達(dá)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子

2.2 WRKY(Solyc07g047960.2)部分序列的克隆和TRV2載體的構(gòu)建

以番茄cDNA為模板，用WRKY(Solyc07g047960.2)特異性引物擴(kuò)增473 bp的cDNA片段，PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖3所示。對(duì)擴(kuò)增得到的片段進(jìn)行切膠回收，并送至華大基因公司測(cè)序，比對(duì)結(jié)果顯示，其為WRKY(Solyc07g047960.2)基因的特異性片段。將切膠回收產(chǎn)物以及pTRV2質(zhì)粒進(jìn)行BamH Ⅰ、XbaⅠ雙酶切和純化回收，經(jīng)T4 DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化DH5α，將菌液PCR和質(zhì)粒酶切檢測(cè)均正確的重組質(zhì)粒命名為pTRV2-WRKY，并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101，用于VIGS驗(yàn)證試驗(yàn)，其中pTRV2-WRKY質(zhì)粒的BamHⅠ、XbaⅠ雙酶切電泳結(jié)果見圖3。

圖1 22個(gè)WRKY基因熱圖

圖2 22個(gè)WRKY基因CDS序列的進(jìn)化樹

M．Marker；1.PCR產(chǎn)物；2.酶切產(chǎn)物

2.3 WRKY(Solyc07g047960.2)基因的VIGS沉默效率

當(dāng)陽性對(duì)照(TRV-PDS)植株新生葉片出現(xiàn)明顯的白化癥狀時(shí)，對(duì)部分pTRV1 & pTRV2-WRKY處理植株進(jìn)行總RNA提取，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過qRT-PCR方法檢測(cè)WRKY(Solyc07g047960.2)基因的VIGS沉默效率，如圖4所示，TRV-WRKY(1)和TRV-WRKY(2)的沉默效率分別為94.69%和88.49%，說明本試驗(yàn)所構(gòu)建的WRKY沉默載體獲得了較好的沉默效果。

圖4 WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默的qRT-PCR分析

2.4 VIGS植株的癥狀觀察和葉霉菌接種鑒定

試驗(yàn)中，將TRV-PDS沉默處理的番茄植株作為陽性對(duì)照，待陽性對(duì)照植株新生葉片出現(xiàn)明顯的白化癥狀時(shí)，表明VIGS體系已經(jīng)有效建立，WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默植株的癥狀如圖5所示，在形態(tài)上與陰性對(duì)照(TRV)植株并無明顯的區(qū)別。對(duì)試驗(yàn)組(TRV-WRKY)和對(duì)照組(TRV)分別噴施葉霉菌孢子懸液，15 d后植株的發(fā)病情況如圖6所示，WRKY(Solyc07g047960.2)沉默植株接種葉霉菌后的基因表達(dá)量測(cè)定結(jié)果如圖7所示，與圖4中接菌前的基因表達(dá)量相比，接菌后WRKY(Solyc07g047960.2)基因的表達(dá)量有所提高，2個(gè)沉默植株分別達(dá)到對(duì)照的35%和40%，呈現(xiàn)在植株上的癥狀是，部分WRKY(Solyc07g047960.2)沉默植株喪失了對(duì)葉霉菌的抗性，但仍有一定的過敏性壞死癥狀產(chǎn)生(圖6)，這可能是由于VIGS的基因沉默效率并不能達(dá)到100%的緣故，縱使是低表達(dá)的WRKY(Solyc07g047960.2)也能夠使植株維持一定的抗病性，但其抗病性卻遠(yuǎn)低于對(duì)照組，也說明該WRKY基因在番茄抵御葉霉菌侵染過程中發(fā)揮著重要作用。

圖5 VIGS番茄植株的癥狀觀察

圖6 WRKY(Solyc07g047960.2)沉默番茄植株的葉霉病抗性

圖7 接菌后WRKY(Solyc07g047960.2)基因的qRT-PCR測(cè)定

3 結(jié)論與討論

隨著植物對(duì)病原菌抗性機(jī)制研究的深入，轉(zhuǎn)錄因子的研究逐漸成為植物基因功能研究的重點(diǎn)之一。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠參與多種生物和非生物脅迫反應(yīng)過程，能夠調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育等一系列生理生化過程。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族成員的數(shù)量在不同物種間存在著較大的差異，在植物中分布較廣。擬南芥的WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族有72個(gè)成員，水稻中有96個(gè)成員，而在黃瓜中有55個(gè)WRKY基因[12，21-22]。本研究中，在番茄與葉霉菌發(fā)生非親和互作時(shí)，有22個(gè)WRKY基因被顯著富集到。對(duì)這22個(gè)WRKY基因的CDS序列進(jìn)行進(jìn)化分析顯示，其可分為3個(gè)類群，在Cluster Ⅲ中的8個(gè)WRKY基因除Solyc02g072190.2在兩時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量差異不大外，其余7個(gè)WRKY基因均呈現(xiàn)8 d的表達(dá)量明顯高于4 d的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)；在其他2個(gè)類群的14個(gè)WRKY基因，大部分的表達(dá)量上調(diào)并不是很顯著，但由于WRKY轉(zhuǎn)錄因子也積極調(diào)控植物的損傷、衰老、發(fā)育及代謝等生物過程，因此它們可能在番茄與葉霉菌的非親和互作過程中也發(fā)揮著一定的作用，這有待進(jìn)一步研究。

對(duì)于WRKY基因Solyc07g047960.2的功能分析，本研究采用的是VIGS方法，該方法較常規(guī)的轉(zhuǎn)基因方法具有省時(shí)省力和效率高的特點(diǎn)，能夠快速對(duì)基因功能進(jìn)行初步鑒定。試驗(yàn)中以PDS基因?yàn)殛栃詫?duì)照，能夠明顯地指示基因沉默的發(fā)生過程，對(duì)Solyc07g047960.2基因在番茄中進(jìn)行沉默處理后可以看到，沉默效率在88.49%～94.69%，不能達(dá)到100%，可能是由于所采用的番茄植株苗齡較大造成的[23]。用葉霉菌孢子噴施處理后15 d檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，WRKY(Solyc07g047960.2)基因的表達(dá)量達(dá)到對(duì)照的35%～40%，說明該基因的VIGS沉默植株在葉霉菌噴施處理后表達(dá)量有了一定程度的上升。但也能夠觀察到部分WRKY(Solyc07g047960.2)沉默番茄植株葉片上出現(xiàn)過敏性壞死斑點(diǎn)，且葉片的壞死斑點(diǎn)數(shù)量明顯低于對(duì)照，說明該WRKY基因在番茄對(duì)葉霉菌的抗性過程中發(fā)揮著一定作用。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果可知，WRKY(Solyc07g047960.2)基因在含Cf-12基因的番茄與葉霉菌的非親和互作過程中呈現(xiàn)顯著的上調(diào)表達(dá)趨勢(shì)，其積極地參與到對(duì)葉霉菌的抗性反應(yīng)過程中。

[1] Abramovitch R B,Anderson J C,Martin G B.Bacterial elicitation and evasion of plant innate immunity[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2006,7(8):601-611.

[2] Jones J D G,Dang J L.The plant immune system[J].Nature,2006,444(7117):323-329.

[3] Wulff B B H,Thomas C M,Parniske M,etal.Genetic variation at the tomatoCf-4/Cf-9 locus induced by EMS mutagenesis and intralocus recombination[J].Genetics,2004,767: 459-470.

[4] Van der Hoorn R A L,Roth R,De Wit P G.Identification of distinct specificity determinants in resistance proteinCf-4 allows construction of aCf-9 mutant that confers recognition of avirulence protein AVR4[J].Plant Cell,2001,13:273-285.

[5] Rivas S,Thomas C M.Molecular interactions between tomato and the leaf mold pathogenCladosporiumfulvum[J].Annual Review Phytopathol,2005,43:395-436.

[6] Seear P J,Dixon M S.Variable leucine-rich repeats of tomato disease resistance genesCf-2 andCf-5 determine specificity[J].Molecular Plant Pathology,2003,4:199-202.

[7] Flor H H.Current status of the gene-for-gene concept[J].Annual Review of Phytopathology,1971,9(1):275-296.

[8] Singh K B,Foley R C,Onate-Sanchez L.Transcription factors in plant defense and stress responses[J].Current Opinion in Plant Biology,2002,5(5):430-436.

[9] Eulgem T,Rushton P J,Robatzek S,etal.The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].Trends in Plant Science,2000,5:199-206.

[10] Wu X,Shiroto Y,Kishitani S,etal.Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressingOsWRKY11 under the control ofHSP101 promoter[J].Plant Cell Reports,2009,28(1):21-30.

[11] Dong J,Chen C,Chen Z.Expression profiles of theArabidopsisWRKY gene superfamily during plant defense response[J].Plant Molecular Biology,2003,51:21-37.

[12] Devaiah B N,Karthikeyan A S,Raghothama K G.WRKY75 transcription factor is a modulator of phosphate acquisition and root development inArabidopsis[J].Plant Physiology,2007,143(4):1789-1801.

[13] Xu Y H,Wang J W,Wang S,etal.Characterization of GaWRKY1,a cotton transcription factor that regulates the sesquiterpene synthase gene(+)-δ-cadinene synthase-A[J].Plant Physiology,2004,135(1):507-515.

[14] Hui D Q,Iqbal J,Lehmann K,etal.Molecular interactions between the specialist herbivoreManducasexta(Lepidoptera，Sphingidae) and its natural hostNicotianaattenuata：V.Microarray analysis and further characterization of large-scale changes in herbivore-induced mRNAs[J].Plant Physiology,2003,131(4):1877-1893.

[15] Sun C X,Palmqvist S,Olsson H,etal.A novel WRKY transcription factor，SUSIBA2，participates in sugar signaling in barley by binding to the sugar-responsive elements of the iso1 promoter[J].The Plant Cell,2003,15 (9):2076-2092.

[16] Niu C F,Wei W,Zhou Q Y,etal.WheatWRKYgenesTaWRKY2 andTaWRKY19 regulate abiotic stress tolerance in transgenicArabidopsisplants[J].Plant,Cell & Environment,2012,35(6):1156-1170.

[17] Zhou Q Y,Tian A G,Zou H F,etal.Soybean WRKY-type transcription factor genes，GmWRKY13,GmWRKY21 andGmWRKY54，confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenicArabidopsisplants[J].Plant Biotechnology Journal,2008,6(5):486-503.

[18] Jin J P,Zhang H,Kong L,etal.PlantTFDB 3.0:A portal for the functional and evolutionary study of plant transcription factors[J].Nucleic Acids Research,2014,42(D1):D1182-D1187.

[19] 史艷梅，魏攀，陳媛媛，等．煙草ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因的克隆和功能分析[J]．煙草科技，2015,48(9)：1-8．

[20] 孟凡娟，許向陽，李景富，等．東北三省新的番茄葉霉病菌生理小種分化初報(bào)[J]．中國(guó)蔬菜，2006(1)：21-23．

[21] Ling J,Jiang W J,Zhang Y,etal.Genome-wide analysis of WRKY gene family inCucumissativus[J].BMC Genomics,2011,12:471.

[22] Wang Q S,Wang M H,Zhang X Z,etal.WRKY gene family evolution inArabidopsisthaliana[J].Genetica,2011,139:973-983.

[23] 王長(zhǎng)春．番茄Cf-4和Cf-9基因介導(dǎo)的過敏性反應(yīng)調(diào)控及基因沉默技術(shù)的研究[D]．杭州：浙江大學(xué)，2005．

Bioinformatics and Functional Analysis of WRKY Transcription Factors in Interaction between Tomato and Cladosporium fulvum

WANG Qiuying1，XUE Dongqi2，CHEN Xiuling2，LI Jingfu2，WANG Aoxue1,2*

(1.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To preliminarily define the role of WRKY transcription factors in the incompatible interaction betweenCf-12 tomato andCladosporiumfulvum,we analyzed differential expression of WRKY transcription factors in the transcriptome of 4 d and 8 d time points of incompatible interaction,and then conducted phylogenetic analyses and gene silencing by virus inoculation.The results showed that 22 WRKY genes were enriched in the process of incompatible interaction,and the expression ofSolyc07g047960.2 at 8 days post inoculation increased by nearly 20 times.According to phylogenetic analysis and expression analysis of WRKY CDS,the expression of some WRKY genes was not significantly different at two time points,however,in Cluster Ⅲ,7 WRKY genes showed significant up-regulated expression.After identification ofWRKYgene silenced tomato plants(inoculated by TRV-WRKY),the results ofCladosporiumfulvuminoculation showed that the expression ofWRKYgene was increased compared with that before inoculation,and the number of hypersensitive necrotic spots on leaf was obviously lower than the control(inoculated by TRV).The conclusion was that theWRKY(Solyc07g047960.2) gene showed a significantly up-regulated expression during the incompatible interaction betweenCf-12 tomato andCladosporiumfulvum,and was actively involved in the resistance response to the tomato leaf mold disease.

tomato;Cladosporiumfulvum; WRKY; differential expression; gene silencing; resistance response

S436.412.1

A

1004-3268(2017)11-0074-06

2017-04-19

黑龍江省杰出青年基金項(xiàng)目(JC2015004)

王秋穎(1986-)，女，黑龍江哈爾濱人，在讀博士研究生，研究方向：番茄抗病、抗逆機(jī)理。

E-mail:wangqiuying1986@163.com

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王傲雪(1973-)，男，黑龍江哈爾濱人，教授，主要從事番茄抗病、抗逆機(jī)理研究。E-mail：axwang@neau.edu.cn