血管緊張素轉換酶Ⅱ在肺栓塞大鼠肺動脈中的表達及其對肺動脈血管的影響

鄧宜材++++++黃明朝++++++陳麗++++++葉永佺++++++游錦惠++++++蘇標堃++++++陳卓++++++董芳

[摘要] 目的 通過觀察肺栓塞大鼠肺動脈干、外周血中血管緊張素轉化酶Ⅱ（ACE2）在栓塞發(fā)生后不同時間點的表達情況，分析其在肺動脈血管重構中的作用。 方法 將雄性SD清潔級大鼠120只按隨機數(shù)字表法分為對照組、假手術和栓塞組，每組各40只。栓塞組大鼠再隨機分為5個亞組，即栓塞24 h組、栓塞1周組、栓塞2周組、栓塞4周組和栓塞8周組。在相應的時間點進行肺動脈干、外周血中的ACE2含量檢測及肺動脈干的病理檢查。 結果 與對照組比較，假手術組大鼠肺動脈干、外周血中的ACE2的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；栓塞組大鼠在栓塞1、2、4、8周后肺動脈干、外周血中的ACE2的表達均顯著降低（P < 0.05）。病理切片結果顯示，栓塞組大鼠的肺動脈干出現(xiàn)明顯的炎癥細胞浸潤、肺纖維化現(xiàn)象，并發(fā)生以肉芽組織增生為表現(xiàn)的血管重構現(xiàn)象。 結論 肺栓塞大鼠ACE2的表達明顯降低；ACE2表達水平降低可能加重肺動脈血管重構。

[關鍵詞] 肺栓塞；血管緊張素轉化酶Ⅱ；血管重構；大鼠

[中圖分類號] R563 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）11（b）-0004-04

[Abstract] Objective To measure angiotensin-converting enzyme 2 （ACE2） concentrations in peripheral blood and pulmonary artery trunk at different time points during the pulmonary embolism in rats， in order to investigate the effects of ACE2 on pulmonary vascular remodeling. Methods 120 male rats were randomly divided into pulmonary embolism group， control group and sham surgury group by random number table， with 40 rats in each group. Then， according to the different time points after embolization， the rats in pulmonary embolism group were further divided into 5 subgroups： embolization 24 h group， embolization 1 week group， embolization 2 weeks group， embolization 4 weeks group and embolization 8 weeks group. Concentrations of ACE2 both in pulmonary artery trunk and peripheral blood were measured at the corresponding time point， as well as the pathological examinations of pulmonary artery trunks. Results Compared with control group， the concentrations of ACE2 in the pulmonary trunk and peripheral blood of the sham operation group were not statistically significant （P > 0.05）. While the concentrations of ACE2 in pulmonary embolism group were significantly lower than those in control group at 1 week， 2 weeks， 4 weeks and 8 weeks after embolization （P < 0.01）. Meanwhile， pathological examination results showed clearly the infiltration of inflammatory cells around pulmonary artery trunk， pulmonary fibrosis and vascular remodeling with a hyperplasia of granulation tissue. Conclusion The expression of ACE2 reduced significantly in pulmonary embolism rat model， and the low concentrations of ACE2 may aggravate pulmonary vascular remodeling.

[Key words] Pulmonary embolism； Angiotensin converting enzyme 2； Vascular remodeling； Rat

肺血栓栓塞癥（pulmonary thromboembolism，PTE）是來自靜脈系統(tǒng)或右心的血栓阻塞肺動脈或其分支所致疾病，其以肺循環(huán)（含右心）和呼吸功能障礙為主要臨床表現(xiàn)和病理生理特征，也是最常見的肺栓塞類型[1]。全球流行病學資料顯示其發(fā)病率在千分之一以上，每年患病人數(shù)約60萬[2]。在我國，PTE也是常見的心血管系統(tǒng)疾病之一[3]。

PTE的病理生理學變化復雜多變，栓塞發(fā)生后，由于肺血管內皮受損，釋放出內皮素、血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）、二磷酸腺苷、組織胺、5-羥色胺、多種前列腺素等血管收縮性物質，使肺血管收縮，呼吸循環(huán)功能障礙，從而產生一系列心肺功能異常。急性PTE即使進行抗凝治療1年后，仍有半數(shù)患者存在殘留血栓。據(jù)報道，PTE發(fā)生1～4周內未溶、殘留的栓子與肺動脈壁黏為一體，產生血管組織炎性反應，并逐漸轉化為含有內皮細胞、平滑肌細胞的結締組織，遷移到動脈內膜，可引起以肺動脈內膜纖維化為主要表現(xiàn)的血管重構[4-5]。這種血管重構造成血管腔狹窄、堵塞，導致栓塞部位通氣、血流灌注障礙，引起以右心衰竭、低氧血癥及低碳酸血癥等為主的機體一系列病理生理變化，嚴重的可危及生命。針對這種血管重構的機制，已有研究表明神經(jīng)-體液因素和循環(huán)內分泌激素起了十分重要的作用，其中腎素-血管緊張素系統(tǒng)（RAS）這一經(jīng)典的循環(huán)酶通路是體內重要的體液調節(jié)系統(tǒng)之一。endprint

AngⅡ是RAS的重要代謝產物。Ang Ⅱ作為極強的縮血管物質，能被血管緊張素轉化酶Ⅱ（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）水解生成血管緊張素-（1-7）[angiotensin-（1-7），ANG-（1-7）]，而ANG-（1-7）對腎素-血管緊張素系統(tǒng)具有負調控的作用。本研究借助肺栓塞動物模型，通過觀察肺栓塞后不同時間點大鼠肺動脈干、外周血中的ACE2的表達情況，分析其對大鼠肺動脈血管重構的影響，為PTE的預防及臨床診療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取3～4周齡雄性SD清潔級大鼠120只，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產許可證號為SCXK（閩）2016-0002，合格證號為0002678），體重（230±20）g。實驗大鼠飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的SPF級環(huán)境中，自由攝食和飲水，動物適應1周后進行實驗。

1.2 試劑

兔ACE2多克隆抗體由Abcam公司提供；免疫組化檢測試劑：DAB染色液由珠海市泉輝企業(yè)有限公司提供，抗體稀釋液由基因科技（上海）股份有限公司提供；大鼠ACE2檢測的ELISA試劑盒由上海美旋生物技術有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 大鼠肺栓塞模型的建立 將120只大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組、假手術和栓塞組，每組各40只。栓塞組又根據(jù)栓塞時間不同分為24 h、1周、2周、4周和8周5組，每組8只動物。用2%的戊巴比妥鈉按照0.5 mL/100 g體重的劑量進行腹腔注射，麻醉大鼠后在無菌條件下分離左側頸外靜脈，并按1 mL/kg體重靜脈推注無菌生理鹽水條件下制成的2.5 g/L的明膠海綿溶液，建立肺栓塞模型[6]。假手術組大鼠頸靜脈注入同等體積的生理鹽水后也同樣結扎頸外靜脈近端，縫合皮下組織、皮膚后，放回飼養(yǎng)籠內飼養(yǎng)。

1.3.2 動物標本采集 分別在造模后24 h、1 周、2周、4周、8周取動物外周血，離心獲血清進行ACE2含量檢測。同時，在上述不同時間點獲取大鼠的左肺動脈干，經(jīng)4%多聚甲醛固定，進行HE染色及相關免疫組化檢測。

1.3.3 血清ACE2含量檢測 利用ELISA法測定清ACE2含量。向預先已包被大鼠血清ACE2捕獲抗體的微孔中，依次加入待測血清標本、標準品、HRP標記的檢測抗體，經(jīng)過適當?shù)臏卦〖跋礈欤玫孜颰MB（TMB在過氧化物酶的催化下轉為藍色，在酸的作用下轉成最終黃色）在450 nm的吸光度值，進行ACE2濃度的測定。

1.3.4 大鼠肺動脈干ACE2免疫組化檢測 首先將標本石蠟切片在68℃條件下烘烤脫蠟至水化后，將玻片放置裝有已沸騰檸檬酸抗原修復液的壓力鍋中25 min；自然冷卻后用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次；3%過氧化氫孵育5 min以滅活內源性過氧化物酶，再用PBS清洗2次；加入ACE2兔多克隆抗體（1∶100），4℃過夜孵育，然后PBS清洗2次；滴加二抗，室溫孵育30 min后，PBS清洗2次；最后進行DAB顯色；純化水充分沖洗，蘇木精復染，酒精分色，PBS復色，酒精梯度脫水，二甲苯透明，樹膠封片。與此同時，用PBS分別代替一抗、二抗作為陰性對照。

采用Bresalier等[7]的半定量公式判斷染色結果。每張切片在400倍視野下隨機選取10個視野，根據(jù)細胞染色強度分為4級，并分別計分如下：細胞無著色（0）；細胞著色為淺黃色（1）；細胞著色為棕黃色（2）；細胞著色為棕褐色（3）。同一視野根據(jù)染色為淺黃色以上細胞的面積占視野面積的比例計分：0%～<30%為0分；30%～<50%為1分；50%～<80%為2分，≥80%為3分；將同一視野兩項計分相加為該視野的積分。將10個視野的積分代入下列計算公式計算每張切片的平均染色強度：IS=∑{（0×F0）+（1×F1）+（2×F2）+（3×F3）+（4×F4）+（5×F4）+（6×F6）}，F(xiàn)=n/l0（n=0、1、2、3、4、5、6各分值的視野數(shù)）。采用雙人雙盲閱片方式，重復2次，分別計算IS值，取其平均值作為最終結果。

1.3.5 肺動脈干形態(tài)學分析 采用常規(guī)蘇木精-伊紅染色，通過電子顯微鏡觀察血栓、內皮細胞、水腫、炎癥細胞、纖維蛋白、纖維母細胞、肉芽組織等情況。圖像分析是采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件進行分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用GB-STAT統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血ACE2濃度比較

在整個實驗觀察期間，對照組和假手術組同一時間點的外周血ACE2濃度比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。相比之下，栓塞組1、2、4周外周血ACE2濃度極顯著低于對照組（P < 0.01）；與栓塞24 h比較，栓塞組8周外周血ACE2濃度略有回升（P < 0.05），但仍顯著低于同時間點的對照組外周血ACE2濃度（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組肺動脈干ACE2表達免疫組化結果

在整個實驗觀察期間，對照組和假手術組栓塞后同一時間點肺動脈干ACE2表達比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；栓塞組栓塞后各時間點肺動脈干ACE2的表達均顯著低于同期對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。栓塞24 h后，栓塞組ACE2表達開始下降，第2周最低，從第4周后開始逐漸升高（P < 0.05）。見表2、圖1，封四。

2.3 各組大鼠肺動脈干血管病理切片結果

病理切片結果顯示：對照組、假手術組大鼠的肺動脈干的血管內膜光滑，內皮細胞未見水腫變性及脫落（圖2A、2B，封四）。栓塞組大鼠在各時間點均出現(xiàn)不同程度的肺動脈干血管的重構現(xiàn)象：急性栓塞期內出現(xiàn)肺動脈干血管內皮細胞水腫變性、纖維蛋白滲出、炎癥細胞浸潤、附壁血栓形成等（圖2C、2D、2E，封四）。慢性期逐漸出現(xiàn)肉芽組織形成、纖維母細胞增生、血管壁黏液及玻璃樣變性、血栓表面上皮細胞再生伴有機化等（圖2F、2G，封四）。endprint

3 討論

PTE是一種多因素參與、多個功能系統(tǒng)間平衡失調所致的疾病，其發(fā)生不僅與血液中凝血、抗凝、纖維蛋白溶解系統(tǒng)，以及以血管、血細胞構成的凝血、抗凝血平衡異常相關，甚至與炎性因子相關。已有研究表明：在PTE的血管重構中，Ang Ⅱ是一個重要介質[8-9]。Ang Ⅱ通過與Ang Ⅱ 1型受體（angiotensin 1 receptor，AT1R）結合，發(fā)揮血管收縮、纖維化、血管內皮細胞凋亡、氧化應激和炎性反應等一系列病理生理效應[10-12]。

ACE2是血管緊張素轉化酶（angiotensin convertion enzyme，ACE）的同系化合物[13-14]，主要功能是水解Ang Ⅱ，生成Ang-（1-7）[15]，而Ang-（1-7）是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的血管保護肽[16-18]，與G蛋白偶聯(lián)受體Mas原癌基因受體結合，發(fā)揮與Ang Ⅱ相反的生物學效應，包括擴張血管、抗肥大、抑制凋亡、抗炎性反應等，從而起到減輕肺損傷、改善病理性血管重構的作用[19-20]。ACE2-Ang-（1-7）-Mas 受體軸對肺臟的這種保護作用，一方面是通過ACE2 降解Ang Ⅱ，減少縮血管作用，另一方面Ang-（1-7）本身具有促進Ang Ⅱ2 型受體的激活及血管Ang Ⅱ1 型受體的部分抑制作用，對改善血管內皮功能，釋放舒張血管物質如緩激肽、前列腺素和NO，以及對炎性細胞的趨化募集、炎性因子的釋放起負向調節(jié)作用等有關[21]。

本實驗研究中，在大鼠肺栓塞發(fā)生后，其外周血、肺動脈中的ACE2表達量均明顯降低。由于栓塞時間的不同，ACE2表達水平較高的大鼠，其肺動脈血管重構程度、進展均明顯低于ACE2表達水平較低的肺栓塞大鼠。本研究結果提示，ACE2參與了大鼠血管重構調節(jié)的過程，并對血管重構起抑制作用。同時，該調節(jié)作用可能通過ACE2-Ang-（1-7）-Mas軸抑制了AngⅡ誘導的病理生理效應[22]，從而達到保護血管內皮功能、改善血管重塑現(xiàn)象。

[參考文獻]

[1] 中華醫(yī)學會心血管病學分會肺血管病學組，中國醫(yī)師協(xié)會心血管內科醫(yī)師分會.急性肺栓塞栓塞癥診斷治療中國專家共識[J].中華內科雜志，2010，49（1）：74-81.

[2] Goldhaber SZ. Venous thromboembolism：epidemiology and magnitude of the problem [J]. Best Pract Res Clin Haematol，2012，25（3）：235-242.

[3] 程顯聲.進一步提高肺動脈栓寒診斷與處理水平[J].中華結核和呼吸雜志，2000，23（9）：517-518.

[4] 張敬霞，陳永利，王佩顯，等.實驗性急性肺血栓栓塞癥肺動脈血管重構及意義[J].天津醫(yī)藥，2007，35（6）：423-433.

[5] Jaff MR，McMurtry MS，Archer SL，et al. Management of massive and submassive pulmonary embolism， iliofemoral deep vein thrombosis， and chronic thromboembolic pulmonary hypertension：a scientific statement from the American Heart Association [J]. Circulation，2011，123（16）：1788-1830.

[6] 劉春萍，張運劍，陸慰萱，等.急性肺栓塞大鼠肺表面活性物質的變化[J].中華結核和呼吸雜志，2005，28（9）：600-603.

[7] Bresalier RS，Ho SB，Schoeppner HL，et a1. Enhanced sialylation of mucin-associated carbohydrate structures in human colon cancer metastasi[J].Gastroenterolgy，1996， 110（5）：1354-1367.

[8] Orte C，Polak JM，Haworth SG，et al. Expression of pulmonary vascular angiotensin-converting enzyme in primary and secondary plexiform pulmonary hypertension [J]. J Pathol，2000，192（3）：379-384.

[9] Zhu Z，Ma B，Zheng T，et al. IL-13-induced chemokine responses in the lung：role of CCR2 in the pathogenesis of IL-13-induced inflammation and remodeling [J]. J Immunol，2002，168（6）：2953-2962.

[10] Mehta PK，Griendling KK. Angiotensin Ⅱ cell signaling：physiological and pathological effects in the cardiovascular system [J]. Am J Physiol Cell Physiol，2007，292（1）：C82-C97.

[11] 文海若，李波，付研.血管緊張素Ⅱ在心血管疾病中的氧化應激調節(jié)機制[J].中國醫(yī)刊，2014，49（2）：12-14.

[12] Montezano AC，Nguyen Dinh Cat A，Rios FJ，et al. Angiotensin Ⅱand vascular injury [J]. Curr Hypertens Rep，2014，16（6）：1-11.endprint

[13] Donoghue M，Hsieh F，Baronas E，et al. A novel angiotensin-converting enzyme-related carboxypeptidase （ACE2） converts angiotensin I to angiotensin 1-9 [J]. Circ Res，2000， 87（5）：E1-E9.

[14] Tipnis SR，Hooper NM，Hyde R，et al.A human homolog of angiotensin-converting enzyme.Cloning and functional expression as a captopril-insensitive carboxypeptidase [J]. J Biol Chem，2000，275（43）：33 238-33 243.

[15] Boehm M，Nabel EG.Angiotens-inconverting enzyme 2-a new cardiac regulator [J]. N Engl J Med，2002，347（22）：1795-1797.

[16] Osei SY，Ahima RS，Minkes RK，et al.Differential responses to angiotensin-（1-7） in the feline mesenteric and hindquarters vascular beds [J]. Eur J Pharmacol，1993，234（1）：35-42.

[17] Ferrario CM. Angiotensin-（1-7） and antihypertention mechanisms [J]. Nephrol，1998，11（6）：278-283.

[18] Bernstein KE，Ong FS，Blackwell WL，et al. A modern understanding of the traditional and nontraditional biological functions of angiotensin-converting enzyme [J]. Pharmacol Rev，2013，65（1）：544.

[19] Chen LN，Yang XH，Nissen DH，et al. Dysregulated rennin-angiotensin system contributes to acute lung injury caused by hind-limb ischemia-reperfusion in mice [J]. Shock，2013，40（5）：420-429.

[20] Patel VB，Zhong JC，F(xiàn)an D，et al. Angiotensin converting-enzyme 2 is a critical determinant of angiotensin Ⅱ-induced loss of vascular smooth muscle cells and adverse vascular remodeling [J]. Hypertension，2014，64（1）：157-164.

[21] Nie W，Yan H，Li S，et al. Angiotensin-（1-7） enhances angiotensin Ⅱ induced phosphorylation of ERK1/2 in mouse bonemarrow-derived dendritic cells [J]. Mol Immunol，2009，46：355-361.

[22] Ferrario CM，Varagic J. The ANG-（1-7）/ACE2/mas axis in the regulation of nephron function [J]. Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（6）：F1297-F1305.endprint