半乳糖基轉移酶β4GalT1對膀胱上皮細胞遷移行為的影響

李鴻姣， 郭 佳， 楊剛龍， 劉昌梅， 李 想， 關 鋒

(江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

半乳糖基轉移酶β4GalT1對膀胱上皮細胞遷移行為的影響

李鴻姣， 郭 佳， 楊剛龍， 劉昌梅， 李 想， 關 鋒

(江南大學 生物工程學院 糖化學與生物技術教育部重點實驗室， 無錫 214122)

在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中常伴隨著糖基化的異常，而糖類結構是糖基轉移酶的催化所形成，所以以膀胱癌細胞株為模型研究β1，4-半乳糖基轉移酶1(β1，4-galactosyltransferase 1，β4GalT1)對細胞行為的影響。以人源正常膀胱上皮細胞HCV29和人源浸潤性膀胱癌細胞YTS1為研究對象，通過凝集素熒光染色技術檢測發(fā)現(xiàn)YTS1中末端乳糖胺結構含量升高，蛋白免疫印跡和實時熒光定量PCR技術檢測發(fā)現(xiàn)YTS1中β4GalT1的表達顯著高于HCV29。利用轉化生長因子(transforming growth factor beta，TGF-β)誘導HCV29發(fā)生上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程，經檢測發(fā)現(xiàn)，末端乳糖胺結構與β4GalT1的表達顯著升高。HCV29過表達β4GalT1后，細胞遷移速度明顯變快，而干擾YTS1細胞中的β4GalT1后，細胞遷移速度明顯變慢。由此表明，β4GalT1能促進膀胱細胞的遷移能力，但其對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響有待深入研究。

β4GalT1；膀胱癌；糖鏈；細胞遷移

糖基化修飾是蛋白翻譯后修飾最普遍的形式，是在糖基轉移酶作用下將糖類轉移至蛋白質上并和蛋白質上特殊的氨基酸殘基形成糖苷鍵的過程，對很多蛋白質的結構和功能起著重要作用。蛋白質糖基化根據糖類物質與蛋白質結合方式的不同分為N-糖基化和O-糖基化，其中N-糖基化是糖鏈與蛋白質上的天冬氨酸共價連接而形成，而O-糖基化是糖鏈與蛋白質上的蘇氨酸或絲氨酸共價連接形成。異常糖基化是癌細胞的普遍特征，并且某些特征性糖類結構被公認為腫瘤發(fā)展的標志物。

β4GalT1是研究最廣泛的糖基轉移酶之一，在哺乳動物的糖基轉移酶中，β4GalT1是最早被克隆出來的糖基轉移酶。β4GalT1屬于β-1，4-半乳糖基轉移酶家族，是合成糖蛋白上N-糖和O-糖核心結構2的Galβ1-4GlcNAc的關鍵糖基轉移酶(圖1)。β4GalT1是一種II型跨膜蛋白，它以兩種形式——長型和短型廣泛存在于細胞中。長型的β4GalT1和短型的β4GalT1具有相同的催化區(qū)和跨膜區(qū)，但是由于有著不同的轉錄起始位點，使長型的β4GalT1比短型的β4GalT1在胞漿區(qū)多了13個氨基酸，正是由于這種差異，造成了β4GalT1定位以及功能的不同[1-3]。β4GalT1的表達與很多生物過程有關，如細胞周期[4]、細胞凋亡[5]及癌細胞的轉移[6]。Pratt等[7]發(fā)現(xiàn)β4GalT1與卵子透明帶糖蛋白ZP3的結合介導精卵的識別，沈愛國等[8]發(fā)現(xiàn)β4GalT1與層黏蛋白(laminin，LN)結合促進神經元軸突生長以及損傷神經的再生，周慧敏等[9]發(fā)現(xiàn)β4GalT1的過表達增強白血病細胞的耐藥性，最近的報道表明肝癌細胞表面表達的β4GalT1可以與表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)相互作用，影響到細胞的生長[10]。

圖1 β4GalT1在糖鏈合成中的作用示意圖

Fig 1 Function of β4GalT1 in glycan synthesis

上皮間質轉化過程(epithelial-mesenchmyal transition，EMT)，是腫瘤細胞轉移的主要機制之一，指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質細胞表型的生物學過程，常通過外源添加TGF-β誘導發(fā)生[11]，用于腫瘤的形成和發(fā)展研究中。

本文以人正常膀胱上皮細胞HCV29和惡性膀胱癌細胞YTS1為研究對象，分析兩者中末端乳糖胺結構含量的差異以β4GalT1在轉錄水平和蛋白水平上的表達差異，建立過表達β4GalT1和干擾β4GalT1細胞模型，比較轉染前后細胞遷移能力的變化，證實β4GalT1對膀胱細胞的遷移具有促進作用，為進一步探究β4GalT1對膀胱癌發(fā)生發(fā)展的影響奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

人正常膀胱上皮細胞株HCV29和人浸潤性膀胱癌細胞株YTS1為美國華盛頓大學Hakomori教授饋贈。大腸桿菌JM109及質粒pLVX，psPAX2，pMD2.G由本實驗室保存。

抑肽酶，苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF)，RIPA裂解液和Hoechst染色液購自美國Thermo Fisher公司；BCA蛋白檢測試劑盒和辣根過氧化酶標記山羊抗兔IgG抗體購自碧云天生物技術研究所；β4GalT1抗體購于英國Abcam公司；GAPDH抗體購于美國BD公司；Pro-Light HRP化學發(fā)光檢測試劑購于天根生化科技有限公司；細胞RNA提取試劑盒、UltraSYBR Mixture試劑盒和質粒提取試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；雞冠刺桐凝集素(Erythrinacristagallilectin，ECL)，麥胚素(Wheat germ agglutinin，WGA)購于美國Vector公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購于Thermo Fisher 公司；嘌呤霉素(Puromycin，puro)購于美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

細胞株均使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(HyClone，USA)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2。

1.2.2 細胞穩(wěn)定轉染

在T25培養(yǎng)瓶接種293T細胞，細胞融合度達到70%～80%時轉染，吸去原有的培養(yǎng)基，加入新鮮完全培養(yǎng)基，放置于37℃，待轉染。取兩個離心管，分別加入250 μL DMEM空白培養(yǎng)基。其中一管中加入25 μL Lipofectamine 2000，混合均勻。在另一管中加入質粒(重組質粒，psPAX2，pMD2.G)，混合均勻。將兩管混合均勻，在室溫下孵育5 min后，轉移至293T細胞的培養(yǎng)液中，搖勻。轉染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉染效果。收集293T細胞上清液，以0.22 μm濾膜過濾上清液，分裝成1 mL/管，保存于-80℃。

將待轉染的細胞接種于12孔板中，生長至細胞融合度10%～20%進行細胞轉染。吸去原有的培養(yǎng)基，加入1 mL病毒液。4 h后再加入1 mL完全培養(yǎng)基。24 h后，吸去含病毒的培養(yǎng)液，換新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換相應濃度的puro抗生素篩選72 h，挑選細胞單克隆，再添加篩選濃度一半的puro抗生素濃度的培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)，提取總蛋白，利用蛋白質印跡法進行驗證，得到穩(wěn)定轉染細胞株。

1.2.3 實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，Realtime-PCR)

用RNA提取試劑盒從HCV29、YTS-1細胞中提取RNA，并反轉錄為cDNA。根據GenBank序列，按照Realtime-PCR的引物要求設計引物序列。使用UltraSYBR Mixture試劑盒進行PCR，條件為95℃預變性10 min；95℃變性15 s，60℃退火、延伸1 min，共40個循環(huán)。熒光定量PCR檢測系統(tǒng)進行熒光擴增，測定溶解曲線。根據Ct值，使用2-ΔΔCt法計算目的基因相對內參GAPDH表達的倍性關系。

1.2.4 蛋白質印記與凝集素印跡

收集細胞，用預冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗細胞3次，加入蛋白裂解液(1 mL RIPA、1%PMSF、0.1%抑肽酶)，在冰上裂解細胞30 min，12 000 r/min 離心細胞裂解液15 min，取上清，用BCA法測蛋白濃度。樣品加入5×Loading buffer，煮沸5 min，取30 μg蛋白，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳后，將蛋白轉移至0.22 μm PVDF膜，用5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，一抗或生物素標記的凝集素ECL和WGA 4℃孵育過夜，TBST漂洗5次，每次5 min，再將膜與辣根過氧化物酶HRP標記的二抗或VECTOR的ABC KIT，室溫孵育1 h；TBST漂洗5次，每次5 min，采用Pro-Light HRP化學發(fā)光檢測試劑顯色，用ChemiDocTMXRS+成像系統(tǒng)進行圖像采集及定量分析。

1.2.5 凝集素細胞染色

以2×104個/孔接種細胞于24孔板中并制作細胞爬片，培養(yǎng)12～24 h至細胞融合度到60%～70%，用PBS洗滌3次，用新配制的2%的多聚甲醛固定細胞15 min；用PBS洗滌3次，每次5 min；用0.2%～0.3%的TritonX-100室溫通透15 min；再用PBS洗滌3次，3%的牛血清蛋白(Bovine serum albumin，BSA)溶液4℃封閉過夜，然后用Cy3標記濃度為0.7 mg/L ECL和WGA室溫避光孵育3 h，PBS洗滌3次，每次5 min，5 mg/L 4，6-二脒基-2-苯基吲哚(2-(4-amidinophenyl)-6-indolecarbamidine dihydrochloride，DAPI)染色10 min，最后將爬片倒扣在滴有Glycergel固封劑的載玻片上，晾干后于4℃下避光保存。用Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡在10×40倍下觀察拍照。

1.2.6 細胞免疫組化

將滅菌圓形蓋玻片置于24孔細胞培養(yǎng)板中，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，接種適量細胞。PBS沖洗3次，加入2%的多聚甲醛置于室溫固定15 min，吸去固定液，加入PBS洗滌3次，每次5 min；用0.2%～0.3%的Triton X-100室溫通透15 min；再用PBS洗滌3次，3%的BSA溶液37℃封閉2 h。吸去封閉液，一抗4℃孵育過夜，PBST漂洗5次，每次5 min，Cy3標記的二抗，室溫孵育1 h；PBST漂洗5次，每次5 min。最后將爬片倒扣在滴有Glycergel固封劑的載玻片上，晾干后于4℃條件下避光保存。用Leica TCS SP8共聚焦顯微鏡在10×40倍下觀察拍照。

1.2.7 細胞劃痕實驗

將適量的6株細胞分別接入6孔板中，在完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，吸取培養(yǎng)基，分別用加樣器槍頭在每個孔中劃線，用PBS沖洗3次，加入不含血清的培養(yǎng)基，分別在培養(yǎng)0、12 h時進行拍照。

2 結果與分析

2.1 膀胱細胞中β4GalT1表達的檢測

利用凝集素染色技術檢測了HCV29、YTS1細胞中的Galβ1→4GlcNAc糖鏈水平的差異。實驗所選取的凝集素為ECL，其為一種可以特異性識別末端Galβ1→4GlcNAc糖鏈結構。為了防止過多的唾液酸連接在糖鏈末端，阻礙凝集素對Galβ1→4GlcNAc糖鏈的識別，在細胞ECL凝集素染色之前，用唾液酸酶(Neuramidinase，Neu)處理細胞，切掉糖鏈末端的唾液酸，使Galβ1→4GlcNAc糖鏈結構暴露在外面，有利于凝集素的結合。實驗結果表明與YTS1細胞相比，HCV29中Galβ1→4GlcNAc糖鏈結構含量降低(圖2-A和2-B)。Real time-PCR檢測了半乳糖基轉移酶家族7個基因在2個細胞株中的表達差異，發(fā)現(xiàn)在半乳糖基轉移酶家族中，β4GalT2、β4GalT4、β4GalT5、β4GalT6及β4GalT7在YTS1中表達量低于在HCV29中，而β4GalT1和β4GalT3在YTS1中表達量高于在HCV29中(圖2-C)。之后利用蛋白印跡技術檢測兩株細胞中β4GalT1蛋白水平表達的差異。蛋白印跡結果表明β4GalT1在HCV29中表達量低，在YTS1細胞中表達量高(圖2-D)。結果與凝集素細胞染色和Real time-PCR結果一致。

圖2 β4GalT1在膀胱癌細胞中的表達

A：細胞中Galβ1→4GlcNAc糖鏈結構的檢測，細胞核用DAPI染色(藍色)，Galβ1→4GlcNAc用連有Cy3的ECL染色(紅色)，標尺為50 μm；B：凝集素細胞染色量化圖；C：β4GalT1轉錄水平檢測；D：β4GalT1蛋白水平檢測

2.2 人正常膀胱上皮細胞發(fā)生EMT前后β4GalT1的表達變化

用不同濃度的TGF-β處理HCV29細胞48 h，建立EMT細胞模型。利用蛋白印跡和Real time-PCR檢測HCV29細胞經TGF-β處理前后β4GalT1表達的變化。實驗結果發(fā)現(xiàn)HCV29細胞經TGF-β處理后，β4GalT1在蛋白水平和轉錄水平的表達均上調，且隨著TGF-β濃度的增大，β4GalT1的表達量也增多(圖3-A、3-B)。而細胞凝集素熒光染色證明EMT過程中，HCV29細胞表面Galβ1→4GlcNAc糖鏈結構增多(圖3-C和3-D)。

圖3 HCV29在EMT過程中β4GalT1的表達

A：β4GalT1蛋白水平檢測；B：β4GalT1轉錄水平檢測；C：HCV29發(fā)生上皮間質轉化前后Galβ1→4GlcNAc表達差異。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

2.3 β4GalT1過表達質粒及干擾質粒的構建及驗證

利用分子克隆手段構建長型β4GalT1和短型β4GalT1過表達質粒，分別命名為pLVX-β4GalT1-L和pLVX-β4GalT1-S。用菌落PCR篩選陽性菌，核酸電泳圖顯示條帶大小為1197 bp和1158 bp說明質粒成功導入(圖4-A)。由于長型β4GalT1和短型β4GalT1僅相差39 bp，核酸電泳上顯示區(qū)別不明顯。后經基因測序，測序結果與GenBank中人源β4GalT1一致，表明pLVX-β4GalT1-L和pLVX-β4GalT1-S質粒構建成功(圖4-C)。

按照上述試驗方法構建pLVX-shβ4GalT1-1，pLVX-shβ4GalT1-2和pLVX-shNC重組質粒。以構建pLVX-shβ4GalT1-1為例，采用菌落PCR的方法篩選陽性轉化子，核酸電泳結果顯示有大小為550 bp的條帶即為陽性轉化子(圖4-B)。后經測序與設計的干擾序列相符，說明pLVX-shβ4GalT1-1，pLVX-shβ4GalT1-2和pLVX-shNC重組質粒構建成功。

2.4 長型β4GalT1和短型β4GalT1過表達HCV29細胞株的篩選

通過蛋白印跡與Realtime-PCR篩選長型β4GalT1和短型β4GalT1過表達HCV29細胞。對比空轉質粒的HCV29細胞，轉染后的細胞在85 ku位置出現(xiàn)GFP-β4GalT1的融合蛋白條帶(圖5-A)，并且β4GalT1的表達增加，而長型β4GalT1和短型β4GalT1僅相差13個氨基酸，故在分子質量上無法區(qū)分。而Real time-PCR的結果，與對照組相比，長型β4GalT1和短型β4GalT1過表達后β4GalT1在轉錄水平也顯著升高(圖5-B)。采用ECL和單一性識別GlcNAc的凝集素WGA，進行凝集素印跡結果顯示過表達長型和短型β4GalT1后，HCV29細胞的Galβ1→4GlcNAc糖鏈均明顯增加，而對細胞內GlcNAc的含量沒有影響(圖5-C)。細胞熒光染色結果也證實這個結論(圖5-D)。

圖4 重組質粒pLVX-β4GalT1和重組干擾質粒pLVX-shβ4GalT1-1菌落PCR驗證圖

A、B為核酸電泳圖，1：DL2000 Marker；2：重組質粒pLVX-β4GalT1-L；3：重組質粒pLVX-β4GalT1-S；4：DL1000 Marker；5：pLVX；6：pLVX-shβ4GalT1-1。C：基因測序圖譜，白色區(qū)域為質粒載體部分序列；深色區(qū)域為長型β4GalT1的5′端特有序列；淺色區(qū)域為長型和短型β4GalT1共有序列

2.5 β4GalT1干擾細胞株的篩選

通過蛋白印跡篩選β4GalT1干擾YTS1細胞株，通過篩選發(fā)現(xiàn)轉染pLVX-shβ4GalT1-1和pLVX-shβ4GalT1-2的YTS1細胞株中β4GalT1的表達明顯低于轉染pLVX-shNC重組質粒的YTS1細胞株，表明成功干擾YTS1細胞株中β4GalT1的表達(圖6-A)。凝集素印跡結果顯示干擾β4GalT1的表達后，YTS1細胞中Galβ1→4GlcNAc糖鏈明顯減少(圖6-B)。

圖5 蛋白免疫印跡、實時熒光定量PCR、凝集素印跡檢驗過表達β4GalT1的HCV29細胞株

A: 蛋白免疫印跡β4GalT1在蛋白表達檢測；B: Realtime-PCR檢測B4GALT1在轉錄水平的表達；C: 凝集素印跡檢測糖鏈變化；D: 細胞免疫組化檢測細胞內β4GalT1的表達變化,細胞核用DAPI染色(藍色)，β4GalT1用相應連有Cy3的二抗染色(紅色)。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

圖6 蛋白免疫印跡、凝集素印跡檢驗干擾β4GalT1的YTS1細胞株

A：YTS1干擾β4GalT1穩(wěn)轉株蛋白水平干擾效果；B：YTS1干擾β4GalT1穩(wěn)轉株糖鏈水平干擾效果

2.6 過表達和干擾β4GalT1對細胞遷移能力的影響

將過表達β4GalT1的HCV29細胞和干擾β4GalT1的YTS1細胞進行劃痕實驗，結果表明12 h后過表達長型和短型β4GalT1的HCV29細胞遷移能力均顯著高于對照組(圖7-A和7-B)，而干擾β4GalT1的YTS1細胞遷移能力顯著低于對照組(圖7-C和7-D)。

3 討論

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，在一些惡性腫瘤細胞中，例如黑色素瘤、星形細胞瘤、肺癌中均發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤遷移和侵襲能力的增加，β4GalT1的表達也增加。Villegas-Comonfort等[12]報道了花生四烯酸能夠增加β4GalT1的表達并且增加了乳腺癌細胞MDA-MB-231的細胞遷移能力。Choi等[13]報道雌激素能夠增加MCF-7細胞中β4GalT1的表達并且增強細胞的遷移能力。

圖7 過表達和干擾β4GalT1對HCV29、YTS1細胞遷移的影響

*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001

本實驗結果證實長型β4GalT1和短型β4GalT1在促進細胞遷移方面具有重要作用。長型β4GalT1可與細胞外基質中的層黏連蛋白1結合，幫助偽足形成，細胞鋪展和遷移[14]。在F9胚胎細胞中，長型β4GalT1與參與細胞黏附的跨膜受體E-鈣黏連蛋白相互作用[15]。這些相互作用可能是長型β4GalT1促進細胞遷移的原因。但是短型β4GalT1促進細胞遷移的原因還有待進一步研究。

本實驗結果證實β4GalT1在惡性浸潤性膀胱癌細胞中表達明顯高于正常膀胱細胞，細胞發(fā)生EMT后，β4GalT1的表達量增加，而過表達長型和短型的β4GalT1均能增加細胞的遷移速度。而且本實驗所構建的HCV29過表達長型β4GalT1和短型β4GalT1穩(wěn)轉細胞株以及YTS1干擾β4GalT1穩(wěn)轉細胞株可為后面研究β4GalT1對細胞增殖、凋亡、細胞周期及細胞耐藥性等方面研究提供良好的細胞模型，也能為進一步探究長型β4GalT1和短型β4GalT1在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過程中的作用做貢獻。

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Effectoncellmigrationinbladderepithelialcellbygalactosyltransferaseβ4GalT1

LI Hong-jiao, GUO Jia, YANG Gang-long, LIU Chang-mei, LI Xiang, GUAN Feng

(Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry & Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Aberrant glycosylation is known to be closely associated with cancer progression, and glycans are synthesized by glycosyltransferases. Therefore, we studied the effect of β4GalT1 on cell behavior in bladder cancer. In this study, human HCV29 non-malignant urothelial cells and YTS1 bladder cancer cells were used as the cell models. The terminal lactosyl epitopes were elevated in YTS1 by lectin staining and the expression of β4GalT1 was found up-regulated in YTS1 compared with HCV29 using western blot and Realtime-PCR test. In TGF-β induced EMT process, the expression of β4GalT1 and terminal lactosyl epitopes significantly increased in TGF-β-treated HCV29. The cell migration increased in β4GalT1 overexpressed HCV29, and the cell migration decreased in β4GalT1 knockdown HCV29, which demonstrated that β4GalT1 could promote the migration of bladder cells. Further research is required to understand the effect of β4GalT1 on the cancer progression.

β4GalT1； bladder cancer； glycan； migration

2016-12-16；

2017-01-03

國家自然科學基金項目(No. 81672537);江蘇省自然科學基金項目(BK20161132)

李鴻姣，碩士研究生，專業(yè)方向為制糖工程，E-mail：hj-lee@foxmail.com

關 鋒，博士，教授，研究方向為糖生物學，E-mail：fengguan@jiangnan.edu.cn

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.007

R737.1

A

2095-1736(2017)06-0007-06