土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

曹淑貞， 沈媛媛， 王風(fēng)芹， 宋安東， 桑玉強(qiáng)

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 鄭州 450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 鄭州 450002)

土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究進(jìn)展

曹淑貞1， 沈媛媛2， 王風(fēng)芹1， 宋安東1， 桑玉強(qiáng)2

(1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 鄭州 450002； 2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院， 鄭州 450002)

CH4氣體具有極強(qiáng)的紅外線吸收能力，單分子CH4造成的增溫效應(yīng)可以達(dá)到單分子CO2的15～30倍，更是遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他溫室氣體。地表甲烷氧化和釋放對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和動(dòng)態(tài)平衡意義重大，近年來(lái)科學(xué)家圍繞土壤甲烷氧化細(xì)菌做了大量研究工作，取得進(jìn)展的同時(shí)也存在諸多問題。以甲烷氧化菌為出發(fā)點(diǎn)，總結(jié)目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于土壤甲烷氧化的研究進(jìn)展，重點(diǎn)介紹了甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)研究的各種分子生物學(xué)方法，旨在推進(jìn)對(duì)土壤氧化甲烷菌作用機(jī)制的研究，完善引起溫室效應(yīng)的生物學(xué)因素，為進(jìn)一步對(duì)地表土壤甲烷通量的分析和研究提供理論依據(jù)。

甲烷氧化細(xì)菌；菌落結(jié)構(gòu)；土壤

CH4作為重要的溫室氣體，對(duì)全球變暖效應(yīng)的貢獻(xiàn)率為20%，僅比第一大溫室氣體CO2低了35%[1]。工業(yè)革命使得煤、石油等化石能源的消耗劇增，與此同時(shí)大氣中的CH4濃度也在日益升高。據(jù)調(diào)查顯示，大氣甲烷濃度已在過去200年內(nèi)增加了約1.48倍，目前仍以較高的速度逐年增加[2]。甲烷氧化研究已成為研究全球變暖效應(yīng)不可或缺的重要環(huán)節(jié)。

陸地土壤對(duì)CH4的氧化和釋放影響著大氣中的甲烷含量。對(duì)于單一系統(tǒng)，甲烷吸收大于甲烷氧化，稱為甲烷吸收匯，反之則為甲烷排放源。近年來(lái)，大氣中甲烷濃度急劇升高就是吸收匯減少和排放源增加的結(jié)果。土壤中含有大量的甲烷氧化細(xì)菌，研究表明不飽和土壤在大氣甲烷排放源與吸收匯的平衡中起著重要作用，CH4的年平均攝取量可達(dá)到36 Tg±23 Tg[3]。自然因素和人類活動(dòng)都密切影響著土壤中甲烷氧化菌對(duì)甲烷的釋放和吸收，研究不同條件地表土壤中甲烷氧化菌的生態(tài)多樣性對(duì)分析甲烷氧化機(jī)制和凈甲烷排放核算都具有深遠(yuǎn)的意義。

1 森林甲烷氧化菌

1.1 甲烷氧化菌分類

甲烷氧化細(xì)菌(Methanotrophic bacteria)屬于革蘭氏陰性菌，廣泛存在于土壤、水體等各種生態(tài)環(huán)境中，其最大的特點(diǎn)是能夠以甲烷作為唯一的碳源和能量維持生存[4]。甲烷氧化菌分為好氧甲烷氧化菌(Aerobic Methanotrophs)和厭氧甲烷氧化菌(Anaerobic Methanotrophs)兩種，其中厭氧甲烷氧化菌能夠在缺氧或無(wú)氧環(huán)境中氧化甲烷，多為古生菌，大多在極地、熱泉等極端條件下被發(fā)現(xiàn)，本文的主要探討對(duì)象為好氧型甲烷氧化細(xì)菌。

好氧型甲烷氧化菌于19世紀(jì)初被荷蘭微生物學(xué)家Sohngen分離出來(lái)[5]，直到1970年才開始被科學(xué)家進(jìn)行分類，奠定了現(xiàn)代甲烷氧化菌分類學(xué)的基礎(chǔ)[6]。甲烷氧化菌分為3個(gè)菌門，分別為變形菌門(Proteobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)[7]和NC10門[8]。疣微菌門只在極端嗜酸嗜熱環(huán)境下發(fā)現(xiàn)過，NC10門細(xì)菌可以在厭氧條件下進(jìn)行甲烷和亞硝酸鹽耦合反應(yīng)，又叫反硝化厭氧甲烷氧化菌，傳統(tǒng)的甲烷氧化菌都?xì)w類為變形菌門。傳統(tǒng)好氧甲烷氧化細(xì)菌氧化甲烷的代謝途徑也存在差異，其中TypeⅠ型菌利用單磷酸核酮糖途徑氧化代謝甲烷，Type II型菌則利用絲氨酸途徑。Ⅰ型甲烷氧化菌被劃分為γ-變形菌綱，又可以細(xì)分為Ⅰa型和Ⅰb型，其中Ⅰb型菌又名X型甲烷氧化菌[4]。X型甲烷氧化菌代謝甲烷的途徑與TypeⅠ型菌相同，但其和I型甲烷氧化菌還是存在一定差異：X型菌含有少量的絲氨酸代謝途徑酶，最適生長(zhǎng)溫度高于其他類型的甲烷氧化細(xì)菌,并且具有大多數(shù)Ⅰ型菌缺乏的固氮能力[9]。Ⅱ型甲烷氧化菌屬于α-變形菌綱，包括Methylocystaceae和Beijerinckiaceae兩個(gè)科，前者有Methylocystis和Methylosinus屬，后者包括Methylocapsa、Methylocella和Methyloferula屬。

不同類型的甲烷氧化細(xì)菌具有不同的環(huán)境耐受能力。TypeⅠ甲烷氧化菌偏向于高氧濃度低含量甲烷以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富的環(huán)境，而Type II型菌則完全相反。關(guān)于Ⅰ型和Ⅱ型的具體分類參見表1。

表1 甲烷氧化菌分類

1.2 甲烷氧化機(jī)理

土壤中的甲烷氧化菌首先利用細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶甲烷單加氧酶(MMO)將大氣中的CH4氧化為甲醇。不同類型的甲烷氧化菌所利用的甲烷單加氧酶也存在一定的差別：Ⅰ型菌只能利用可溶性甲烷單加氧酶(sMMO)，而TypeⅡ甲烷氧化菌既可同時(shí)利用可溶性甲烷單加氧酶(sMMO)和顆粒性甲烷單加氧酶(pMMO)。兩種酶的作用機(jī)理都是破壞甲烷分子C-H鍵，最終生成甲醇(CH3OH)和水。后續(xù)反應(yīng)中，產(chǎn)生的甲醇被蘋果酸脫氫酶(MDH)氧化成甲醛，甲醛的代謝過程是TypeⅠ菌和TypeⅡ菌的最重要區(qū)別，前者利用磷酸核酮糖途徑氧化甲醛，后者則利用的是絲氨酸途徑。該過程反應(yīng)見圖1。

2 甲烷氧化菌標(biāo)記基因

傳統(tǒng)的檢測(cè)甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的方法都是依靠培養(yǎng)法實(shí)現(xiàn)，操作復(fù)雜、工作量大、不能一次性實(shí)現(xiàn)大批樣品的快速檢測(cè)等使得該方法存在許多缺點(diǎn)[10]。1995年，Amann等研究人員通過相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法可能會(huì)錯(cuò)失99%以上的微生物種類，這使得人們開始開拓創(chuàng)立更為前沿的生物多樣性研究技術(shù)[11]。

圖1 甲烷氧化途徑[4]

隨著分子生態(tài)學(xué)的發(fā)展，分子檢測(cè)法逐漸取代了傳統(tǒng)的甲烷氧化細(xì)菌檢測(cè)方法，采用標(biāo)記基因法測(cè)定微生物群落結(jié)構(gòu)的方法已得到廣泛應(yīng)用。標(biāo)記基因是細(xì)菌內(nèi)能夠起特異性標(biāo)記作用的一種基因，通常具有已知的功能和序列。16s rRNA基因作為最常用的標(biāo)記基因，負(fù)責(zé)編碼細(xì)菌內(nèi)特定的DNA序列，是微生物多樣性研究的重要工具[12]。特殊情況下，需要對(duì)具有特定功能的微生物進(jìn)行研究，此時(shí)需要更為專一負(fù)責(zé)編碼關(guān)鍵酶的功能基因作為研究對(duì)象[13]。

pmoA是甲烷氧化細(xì)菌的功能基因，在關(guān)鍵酶甲烷單加氧酶(MMO)的編碼中發(fā)揮著不可替代的作用。因此，環(huán)境中甲烷氧化菌的多樣性研究常選pmoA作為標(biāo)記基因[14]。繼寡核苷酸引物A189f/A682r之后[15]，人們又設(shè)計(jì)出更多pmoA的特異性引物來(lái)實(shí)現(xiàn)該功能基因的PCR擴(kuò)增。除了pmoA，其他能編碼甲烷單加氧酶的功能基因也相繼被發(fā)現(xiàn)，共同組成甲烷氧化菌生態(tài)學(xué)研究的強(qiáng)有力工具[16]。

3 甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)測(cè)定方法

近年來(lái)分子生物學(xué)分析群落結(jié)構(gòu)的技術(shù)被廣泛應(yīng)用,包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)分析(Terminal restriction fragment length polymorphism, T-RFLP)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real-time PCR, RT-PCR)、高通量基因芯片(GeoChip)、磷酸脂肪酸分析(Phospholipid fatty acid, PLFA)、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)以及高通量測(cè)序技術(shù)(High throughput sequencing， HTS)。這些技術(shù)的應(yīng)用拓展了土壤甲烷氧化菌等微生物多樣性的研究手段，以下對(duì)目前已應(yīng)用的土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的分子生物學(xué)研究方法做相應(yīng)總結(jié)。

3.1 限制性片段多態(tài)性分析

限制性片段多態(tài)性分析(T-RFLP)是研究微生物多樣性的一種高效便捷的手段。該技術(shù)以分子系統(tǒng)學(xué)為基礎(chǔ)，克服了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法造成的物種缺失弊端，不但應(yīng)用快速，而且具有較高的靈敏度，如今已被廣泛應(yīng)用到微生物種群多樣性的研究分析領(lǐng)域[17]。該技術(shù)測(cè)定甲烷氧化菌菌落結(jié)構(gòu)的原理是用熒光標(biāo)記土壤樣品中的甲烷氧化菌功能基因片段，通過DNA測(cè)序儀進(jìn)行電泳和熒光檢測(cè)，分析帶有熒光標(biāo)記基因片段的長(zhǎng)度和含量，從而揭示土壤氧化菌的豐度和菌落結(jié)構(gòu)等特征。Singh等[18]以T-RFLP技術(shù)研究了新西蘭的原始山毛櫸林，發(fā)現(xiàn)該林區(qū)土壤中typeⅡ型甲烷氧化菌是最主要的活躍種群；Lüke等[19]運(yùn)用該技術(shù)研究了意大利某地多種水稻根際甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果證明typeⅡ和typeⅠb甲烷氧化菌比其他甲烷氧化菌在水稻根際土壤中更占優(yōu)勢(shì)；Ho等[20]采用T-RFLP與qPCR結(jié)合的技術(shù)研究了反復(fù)性的干旱和洪澇干擾對(duì)水稻田土壤中甲烷氧化菌活性、豐度以及菌落結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果證明甲烷氧化菌對(duì)抗外界干擾有一定的自我恢復(fù)能力，但不同類型的甲烷氧化菌的抗受能力不同，typeⅠ型菌在不利干擾條件下相比typeⅡ型菌有更強(qiáng)的自我恢復(fù)能力，這同時(shí)表明不同的甲烷氧化菌采用不同的策略來(lái)應(yīng)對(duì)外界干擾作用。

3.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR作為一種高靈敏度、強(qiáng)特異性、高自動(dòng)化的新興分子生物學(xué)研究技術(shù)[10]，可以結(jié)合16s rRNA 基因或功能基因作為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)環(huán)境樣品中微生物多樣性[21]。該技術(shù)的原理是將過量的具有熒光作用的染料(如SYBR Green I)加入到傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)體系，熒光染料可以特異性結(jié)合DNA雙鏈從而對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，PCR的整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程就可以通過熒光累積實(shí)時(shí)進(jìn)行監(jiān)測(cè)控制，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定量計(jì)算分析。楊銘德等[10]利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，研究探討了不同鹽堿程度下土壤甲烷氧化菌活性與甲烷氧化速率的關(guān)系；劉雅慈等[21]在傳統(tǒng)熒光定量PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合甲烷氧化細(xì)菌功能基因pmoA，探索建立了快速、靈敏和特異性的油氣田土壤甲烷氧化菌定量 PCR 檢測(cè)技術(shù)；Yun等[22]運(yùn)用該技術(shù)研究了青藏高原若爾蓋濕地3種典型植被條件下甲烷氧化菌豐度、活性以及群落結(jié)構(gòu)的差異，其中甲烷氧化菌的16s rRNA以及pomA基因拷貝量均顯示出濕地環(huán)境中typeⅠ型菌在數(shù)量上占有優(yōu)勢(shì)，而mRNA/DNA的結(jié)果又表明typeⅡ型菌在該地區(qū)雖然豐度較低，但在所有樣品中活性最高。

3.3 高通量基因芯片

高通量基因芯片技術(shù)(GeoChip)研究物種多樣性的原理是將高密度的DNA 探針通過原位合成或微印刷的方法固化于載體的表面，探針進(jìn)一步與樣品DNA進(jìn)行雜交，雜交點(diǎn)信號(hào)可用激光掃描儀進(jìn)行采集，最后通過軟件分析處理對(duì)生物樣品進(jìn)行快速有效地檢測(cè)和醫(yī)療診斷。Martineau等[23]通過基因芯片與克隆文庫(kù)結(jié)合的方法研究了加拿大高緯度北極圈土壤甲烷氧化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在極地土壤中有許多未被研究報(bào)道的甲烷氧化細(xì)菌。Wang等[24]為探討低水位及氮沉降對(duì)青藏高原高寒濕地的影響，運(yùn)用基因芯片技術(shù)(Geochip 5.0)對(duì)土壤中溫室氣體相關(guān)微生物(甲烷氧化菌、產(chǎn)甲烷菌等)進(jìn)行研究，結(jié)果表明溫室氣體的排放影響著土壤中的相關(guān)微生物結(jié)構(gòu)，在探求溫室氣體釋放對(duì)環(huán)境影響的同時(shí)不能忽視對(duì)微生物機(jī)制的研究。如今，微陣列芯片技術(shù)已作為甲烷氧化菌多樣性研究的一個(gè)重要手段被廣泛應(yīng)用[19]。

3.4 基因組高通量測(cè)序

基因組高通量測(cè)序(HTS)，也稱下一代測(cè)序技術(shù)(Next generation sequencing, NGS)，其原理是將待測(cè)樣品基因長(zhǎng)鏈打斷成短片段并在兩端加上接頭，然后使這些單個(gè)的小片段DNA分子結(jié)合在固相表面實(shí)現(xiàn)單分子的獨(dú)立擴(kuò)增，最后通過高分辨率的成像系統(tǒng)檢測(cè)分析熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)基因組測(cè)序的目的[25]?？蒲腥藛T以16s rRNA為標(biāo)記基因研究了新西蘭部分草地和森林土壤，分析比較高通量測(cè)序和 DGGE 技術(shù)兩種方法在土壤微生物豐度、菌落結(jié)構(gòu)以及多樣性檢測(cè)方面的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)前者能夠更全面和準(zhǔn)確地反映土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性，DGGE僅能夠反應(yīng)有限的微生物類群，在極大程度上會(huì)低估物種組成結(jié)構(gòu)[26]。Duan等[27]用基因組高通量測(cè)序法研究了畜牧業(yè)表層土壤中甲烷氧化菌多樣性，表明該環(huán)境中Ⅰ型甲烷氧化細(xì)菌在物種多樣性和豐度方面更具優(yōu)勢(shì)。

3.5 磷酸脂肪酸分析技術(shù)

磷酸脂肪酸分析(PLFA)技術(shù)可以通過檢測(cè)微生物中獨(dú)特的磷酸脂肪酸類型和含量來(lái)評(píng)估不同種類微生物活細(xì)胞生物量。不同類型的甲烷氧化菌內(nèi)磷酸脂肪酸組成比例也有差異，Ⅰ型和X 型甲烷氧化菌活細(xì)胞內(nèi)占優(yōu)勢(shì)的為16-C脂肪酸,而18-C脂肪酸在Ⅱ型菌中含量更為豐富，C18:1ω8c和C18:1ω7c常作為標(biāo)志性脂肪酸來(lái)檢測(cè)環(huán)境中TypeⅡ甲烷氧化菌的特異性存在[28]。實(shí)際應(yīng)用中，PLFA常與同位素13C標(biāo)記相結(jié)合，13C-PLFA技術(shù)已成為目前研究土壤甲烷氧化菌的有力工具[29]。Boschker等[30]在對(duì)淡水湖泊底層沉積物甲烷氧化菌多樣性的研究中首次使用了13C-PLFA 技術(shù)，研究表明在該環(huán)境下氧化CH4的主導(dǎo)菌群為Ⅰ型甲烷氧化菌。Bodelier等[31]利用該技術(shù)標(biāo)記研究22種TypeⅡ甲烷氧化菌并構(gòu)建其磷酸脂肪酸數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合多變量方差分析的方法，極大地提高了甲烷氧化菌系統(tǒng)發(fā)育分析的分辨率。但目前甲烷氧化菌的特征性脂肪酸數(shù)據(jù)信息不是很全面，并且該分析所用儀器較為昂貴，使得13C-PLFA技術(shù)的研究還存在一定的困難和挑戰(zhàn)[25]。

3.6 熒光原位雜交

熒光原位雜交技術(shù)(FISH)由Pardue和John兩個(gè)工作小組于1969年合作研究發(fā)明，該技術(shù)以細(xì)胞遺傳學(xué)為基礎(chǔ)，用熒光替代傳統(tǒng)的同位素標(biāo)記，可以使樣品DNA進(jìn)行原位雜交，不僅可以鑒定環(huán)境中特定種類的微生物，還能對(duì)其進(jìn)行種群多樣性分析和動(dòng)態(tài)追蹤監(jiān)測(cè)[32]。目前，F(xiàn)ISH 技術(shù)在甲烷氧化菌種群鑒定和種群密度定量描述等方面已取得重大進(jìn)展，精確程度甚至可以達(dá)到物種水平[33]。Dekus等[34]利用該技術(shù)對(duì)海底甲烷滲漏區(qū)沉積物中的厭氧甲烷氧化菌與硫酸鹽還原菌展開研究，證實(shí)了兩者之間的互養(yǎng)共棲關(guān)系。Elizabeth研究課題組將FISH技術(shù)與標(biāo)簽測(cè)序和細(xì)胞捕獲技術(shù)結(jié)合起來(lái)，研究某甲烷滲漏區(qū)沉淀物中甲烷氧化菌與其他微生物之間的關(guān)系，推測(cè)出甲烷氧化菌的氧化作用與沉積物中的其他微生物功能間存在著復(fù)雜的內(nèi)部聯(lián)系[35]。然而，由于熒光標(biāo)記的探針與細(xì)胞 rRNA 的拷貝數(shù)直接相關(guān),同時(shí)也影響著細(xì)胞生長(zhǎng)速率，而環(huán)境中細(xì)胞生長(zhǎng)率過低會(huì)導(dǎo)致對(duì)靶細(xì)胞的檢出率降低,再加上強(qiáng)熒光背景的環(huán)境對(duì)特定細(xì)胞的檢測(cè)的干擾作用等[36]，這些因素都會(huì)影響到FISH 技術(shù)的準(zhǔn)確性。

3.7 變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳技術(shù)(DGGE)創(chuàng)立于19世紀(jì)80年代，最初的目的是用以分析基因突變，隨后Myuzer等在1993年利用該技術(shù)進(jìn)行了微生物菌落結(jié)構(gòu)的研究并取得良好的效果，開啟了DGGE技術(shù)研究微生物生態(tài)多樣性的先河。DGGE技術(shù)可以將微生物基因組的長(zhǎng)鏈DNA打斷成小片段進(jìn)行研究，該過程可以通過加入了變性劑(甲酰胺和尿素)的凝膠電泳來(lái)實(shí)現(xiàn)。最近研究中，相關(guān)學(xué)者采用PCR-DGGE技術(shù)對(duì)某地污泥干化蘆葦床中的甲烷氧化菌進(jìn)行了研究，過程中以pmoA作為分子標(biāo)記，分析比較了不同生長(zhǎng)時(shí)期以及不同位置存積淤泥中甲烷氧化菌的群落結(jié)構(gòu)和豐度變化[37]。此外，Chi等[38]利用PCR-DGGE和熒光定量PCR技術(shù)分析了中國(guó)南方地區(qū)垃圾填埋表層土壤甲烷氧化菌豐度和群落結(jié)構(gòu)，更進(jìn)一步拓寬了PCR-DGGE技術(shù)在甲烷氧化細(xì)菌生態(tài)多樣性研究領(lǐng)域的應(yīng)用。但DGGE檢測(cè)技術(shù)也存在很多缺點(diǎn)：一方面，DGGE只能分析較短的(﹤500 bp)基因片段，這就造成了得到的系統(tǒng)發(fā)育信息不完善；另一方面，對(duì)一些進(jìn)化關(guān)系相近的微生物類群來(lái)說，其基因PCR產(chǎn)物的分離不徹底也是造成分析微生物群落結(jié)構(gòu)組成偏差的重要原因[36]。

4 展望

土壤甲烷氧化菌影響著大氣甲烷的氧化與吸收，在全球的溫室氣體平衡中起重要作用，并且甲烷氧化菌能夠降解鹵化烴類化合物，具有潛在的商業(yè)價(jià)值。目前為止，對(duì)甲烷氧化菌的研究還處于不斷探索的階段，土壤甲烷氧化菌多樣性是研究的重要環(huán)節(jié)，其中包括不同地域、不同植被類型的土壤等。分子生物學(xué)方法的興起為土壤甲烷氧化菌群落結(jié)構(gòu)的研究提供了強(qiáng)有力的工具，為揭示甲烷氧化菌的生態(tài)功能及生物多樣性提供了大量的信息。鑒于這些方法有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中，通常是多種技術(shù)相互補(bǔ)充印證，并且與傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法相結(jié)合，以期得到的信息更加全面準(zhǔn)確地反映出甲烷氧化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)等生物學(xué)特征。

[1]RODHE H. A Comparison of the contribution of various gases to the greenhouse Effect[J]. Science, 1990, 248(4960): 1217-1219.

[2]王明星, 張仁健, 鄭循華. 溫室氣體的源與匯[J]. 氣候與環(huán)境研究, 2000, 5(1):75-79.

[3]BORKEN W, BRUMME R. Methane uptake by temperate forest soils[J]. Functioning and Management of European Beech Ecosystems, 2009, 208: 369-385.

[4]HANSON R S, HANSON T E. Methanotrophic bacteria[J]. Microbiological Reviews, 1996, 60(2): 439-471.

[5]SOHNGEN N L. Uber Bakterien, welche methan ab kohlenstoffnahrung and energiequelle gebrauchen[J]. Parasitenkd Infectionsker Abt, 1906, 15: 513-517.

[6]WHITTENBURY R, PHILLIPS K C, WILKINSON J F. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria[J]. J Gen Microbiol, 1970, 61(2): 205-218.

[7]DUNFIELD P F, YURYEV A, SENIN P, et al. Methane oxidation by an extremely acidophilic bacterium of the phylumVerrucomicrobia[J]. Nature, 2007, 450( 7171): 879-882.

[8]ETTWIG K F, BUTLER M K, LE P D, et al. Nitrite-driven anaerobic methane oxidation by oxygenic bacteria[J]. Nature, 2010, 464(7288): 543-548.

[9]MURRELL J C, DALTON H. Nitrogen fixation in obligate methanotrophs[J]. Microbiology, 1983, 129(11): 3481-3486.

[10]楊銘德, 焦 燕, 李 新, 等. 基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同鹽堿程度土壤甲烷氧化菌比活性的研究[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào), 2015(5):797-803.

[11]AMANN R I, LUDWING W, SCHLEIFER K H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation[J]. Microbiological Reviews, 1995, 59(1): 143-169.

[12]HEAD I M, SAUNDERS J R, PICKUP R W. Microbial evolution, diversity, and ecology: a decade of ribosomal RNA analysis of uncultivated microorganisms[J]. Microbial Ecology, 1998, 35(1): 1-21.

[13]鄧永翠，車榮曉，吳伊波，等．好氧甲烷氧化菌生理生態(tài)特征及其在自然濕地中的群落多樣性研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2015, 35(14): 4579-4591.

[14]WEN X, YANG S, LIEBNER S. Evaluation and update of cutoff values for methanotrophic pmoA gene sequences[J]. Archives of Microbiology, 2016, 198(7):629-636.

[15]HOLMES A J, COSTELLO A, LIDSTROM M E, et al. Evidence that particulate methane monooxygenase and ammonia monooxygenase may be evolutionarily related.[J]. FEMS Microbiology Letters, 1995, 132(3):203-208.

[16]BODROSSY L, STRALIS-PAVESE N, MURRELL J C, et al. Development and validation of a diagnostic microbial microarray for methanotrophs [J]. Environ Microbiol, 2003, 5(7): 566-582.

[17]王洪媛，江曉路，管華詩(shī)，等. 微生物生態(tài)學(xué)一種新研究方法-T-RFLP 技術(shù)[J].微生物學(xué)通報(bào)，2004, 31(6): 90-94.

[18]SINGH B K, TATE K. Biochemical and molecular characterization of methanotrophs in soil from a pristine New Zealand beech forest[J]. FEMS Microbiology Letters, 2007, 275(1): 89-97.

[19]LüKE C, BODROSSY L, LUPOTTO E, et al. Methanotrophic bacteria associated to rice roots: the cultivar effect assessed by T-RFLP and microarray analysis[J]. Environmental Microbiology Reports, 2011, 3(5):518-525.

[20]HO A, VAN D B E, REIMA, et al. Recurrence and frequency of disturbance have cumulative effect on methanotrophic activity, Abundance, and community structure[J]. Frontiers in Microbiology, 2015, 6:1493.

[21]劉雅慈,何 澤,張 勝,等.油氣田土壤甲烷氧化菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)的建立與應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2014, 41(6):1071-1081.

[22]YUN J L, ZHUANG G Q, MA A Z, et al. Community structure, abundance, and activity of methanotrophs in the zoige wetland of the Tibetan Plateau[J]. Microbial Ecology, 2012, 63(4): 835-843.

[23]MARTINEAU C, PAN Y, BODROSSY L, et al. Atmospheric methane oxidizers are present and active in Canadian high Arctic soils[J]. FEMS Microbiology Ecology, 2014, 89(2):257-69.

[24]WANG H, YU L, ZHANG Z, et al. Molecular mechanisms of water table lowering and nitrogen deposition in affecting greenhouse gas emissions from a Tibetan alpine wetland[J]. Global Change Biology, 2017, 23(2):815-829.

[25]湯華陽(yáng), 杜衛(wèi)東, 張學(xué)軍. 焦磷酸測(cè)序技術(shù)及應(yīng)用[J]. 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志, 2007, 4(3):272-275.

[26]夏圍圍, 賈仲君. 高通量測(cè)序和DGGE分析土壤微生物群落的技術(shù)評(píng)價(jià)[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2014, 54(12):1489-1499.

[27]DUAN Y F, AL-SOUD W A, BREJNROD A. Methanotrophs, methanogens and microbial community structure in livestock slurry surface crusts[J]. Journal of Applied Microbiology, 2014, 117(4): 1066-1078.

[28]BOWMAN J P, SKERRATT J H, NICHOLS P D, et al. Phospholipid fatty acid and lipopolysaccharide fatty acid signature lipids in methane-utilizing bacteria[J]. FEMS Microbiology Ecology, 1991, 85(1): 15-21.

[29]李增強(qiáng), 趙炳梓, 張佳寶.13C 標(biāo)記磷脂脂肪酸分析在土壤微生物生態(tài)研究中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 24(4):470-477.

[30]BOSCHKER H T S, NOLD S C, WELLSBURY P, et al. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by13C-labelling of biomarkers[J]. Nature, 1998, 392(6678): 801-805.

[31]BODELIER P L, GILISEN M J, HORDIJK K, et al. A reanalysis of phospholipid fatty acids as ecological biomarkers for methanotrophic bacteria[J]. International Society for Microbial Ecology, 2009, 3(5): 606-617.

[32]佘晨興, 仝 川. 自然濕地土壤產(chǎn)甲烷菌和甲烷氧化菌多樣性的分子檢測(cè)[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2011, 31(14):4126-4135.

[33]DEDYSH S N, DERAKSHANI M, LIESACK W. Detection and enumeration of methanotrophs in acidicSphagnumpeat by 16S rRNA fluorescence in situ hybridization, including the use of newly developed oligonucleotide probe forMethylocellapalustris[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2001, 67( 10) : 4850-4857.

[34]DEKAS A E, CONNON S A, CHADWICK G L, et al. Activity and interactions of methane seep microorganisms assessed by parallel transcription and FISH-NanoSIMS analyses[J]. Isme Journal, 2015, 10(3):678-692.

[35]TREMBATH-REICHERT E, CASE D H, ORPHAN V J. Characterization of microbial associations with methanotrophic archaea and sulfate-reducing bacteria through statistical comparison of nested Magneto-FISH enrichments[J]. Peerj, 2016, 4: e1913.

[36]梁戰(zhàn)備, 史 奕, 岳 進(jìn). 甲烷氧化菌研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2004, 23(5):198-205.

[37]王世全. 活性污泥中甲烷菌的研究[D]. 大連：大連工業(yè)大學(xué), 2014.

[38]CHI Z F, LU W J, WANG H T. Spatial patterns of methane oxidation and methanotrophic diversity in landfill cover soils of Southern China[J]. Journal of Microbiology & Biotechnology, 2015, 25(4): 423-430.

Researchadvanceinsoilmethanotrophscommunitystructure

CAO Shu-zhen1， SHEN Yuan-yuan2， WANG Feng-qin1， SONG An-dong1， SANG Yu-qiang2

(1. College of Life Science， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002； 2. College of Forestry， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China)

Methane, one of the greenhouse gases, has a strong ability in absorbing infrared radiation and its warming potential of single molecule is 15-30 times higher than CO2. Soil methane absorption plays the significant role in the carbon and nitrogen cycle in ecosystem and carbon balance. In recent years, scientists have done a lot of researches on soil methanotrophic bacterias, and there are also many problems at the same time. This article starts with the methanotrophic microorganisms and summarizes the research advance in soil methane oxidation domestically and internationally. The various molecular biology methods used in methane oxidative bacteria community structure were introduced. It aims to synthesize the research advance in soil methane oxidation and the influence mechanism at home and abroad, which provides theoretical reasons to recognize the role of soil methanotrophic bacterias in global climate change and a theoretical guidance for carrying out the research of surficial methane flux.

methanotrophic bacteria; community structure; soil

2016-10-28；

2016-12-16

國(guó)家科技支撐計(jì)劃子課題(2015BAD07B050601)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201404206-03)；河南省教育廳重點(diǎn)研究項(xiàng)目(16A220003)

曹淑貞，碩士，專業(yè)方向?yàn)槲⑸锷鷳B(tài)學(xué)，E-mail: 13154665225@163.com

桑玉強(qiáng)，副教授，從事林業(yè)生態(tài)學(xué)研究，E-mail: syuqiang@163.com

10.3969/j.issn.2095-1736.2017.06.078

Q938.1+3

A

2095-1736(2017)06-0078-05