正交試驗優(yōu)化天舒膠囊超聲波提取工藝Δ

伏東寧，李祥永，王振中，吳建雄，倪彩莉（.連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港004；.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司研究院，江蘇連云港004；.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，南昌0045）

正交試驗優(yōu)化天舒膠囊超聲波提取工藝Δ

伏東寧1＊，李祥永1，王振中2，吳建雄2，倪彩莉3（1.連云港市中醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇連云港222004；2.江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司研究院，江蘇連云港222004；3.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，南昌330045）

目的：優(yōu)化天舒膠囊超聲波提取工藝。方法：以天舒膠囊中川芎有效成分阿魏酸、天麻有效成分天麻素的轉(zhuǎn)移率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計試驗，考察乙醇體積分數(shù)、乙醇用量、提取時間、超聲功率等因素對轉(zhuǎn)移率的影響，優(yōu)化天舒膠囊超聲波提取工藝并進行驗證試驗。結(jié)果：優(yōu)化的天舒膠囊的超聲波提取工藝為8倍量的70%乙醇，在超聲功率350 W下提取2次，每次提取1.5 h。驗證試驗中，阿魏酸和天麻素轉(zhuǎn)移率平均值分別為94.06%、95.02%（RSD分別為0.18%、0.47%，n＝3）。結(jié)論：優(yōu)化后的提取工藝方法快速、簡單，結(jié)果穩(wěn)定、可行，可用于天舒膠囊中有效成分的提取。

超聲波提?。惶焓婺z囊；正交試驗；川芎；天麻；阿魏酸；天麻素；工藝優(yōu)化；含量測定

天舒膠囊源自金代劉完素《宣明論方》卷二的大川芎方，系由川芎、天麻2味中藥加工精制而成的中藥制劑。該制劑具有活血化瘀、平肝息風(fēng)、鎮(zhèn)定止痛的功效，用于治療瘀血阻絡(luò)或肝陽上亢所致的頭痛日久、痛有定處，或頭暈脅痛、失眠煩躁等，還可治療血管神經(jīng)性頭痛等病癥[1-6]。

超聲波提取法是利用超聲波輻射壓強產(chǎn)生的強烈空化作用、熱作用、機械作用、攪拌作用等[7-8]多級作用，增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進入溶劑，促進藥材有效成分被提取出的一種提取方法。與常規(guī)回流提取法、水蒸氣蒸餾法、煎煮法比較，超聲波提取法具有提取效率高、操作溫度低、提取時間短、生產(chǎn)成本低等優(yōu)點，目前應(yīng)用于單味中藥材的提取研究較廣泛，適用于多種常用中藥材中活性成分的提取[9]。本試驗在參考文獻[10-11]的基礎(chǔ)上，采用超聲波提取法對簡單的復(fù)方制劑進行提取，設(shè)計正交試驗法，考察溶劑乙醇用量及其體積分數(shù)、提取時間、超聲功率4個因素對天舒膠囊有效成分提取效果的影響，確定其最優(yōu)超聲波提取工藝，旨在為天舒膠囊制劑生產(chǎn)提供可靠的參考數(shù)據(jù)，且為其他復(fù)方制劑的超聲波提取工藝提供借鑒。

1 材料

1.1 儀器

WCSJ-10型粗粉碎機（江陰市蘇新干燥設(shè)備有限公司）；DST-50L型聚能式超聲波提取機組（上海矩源機械設(shè)備有限公司）；1200型高效液相色譜（HPLC）儀（美國Agilent公司）；BP211D型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS26型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑

川芎藥材經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部鑒定為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖（產(chǎn)地：安徽，亳州市國一堂中藥飲片有限公司，批號：Y1402007，阿魏酸含量：0.20%）；天麻藥材經(jīng)江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司質(zhì)量部鑒定為蘭科植物天麻（Gastrodia elata Bl.）的干燥塊莖（產(chǎn)地：安徽，亳州市弘惠藥業(yè)有限公司，批號：Y1308012，天麻素含量：1.21%）；阿魏酸對照品（批號：0773-9910，純度：100%）、天麻素對照品（批號：110807-200205，純度：100%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗方案設(shè)計

經(jīng)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)，天舒處方藥材在提取過程中，以溶劑（乙醇）體積分數(shù)（A，%）、提取時間（B，h）、超聲功率（C，W）、溶劑（乙醇）用量（D，倍）對阿魏酸及天麻素的轉(zhuǎn)移率有較大影響。因此，以這4個因素為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗，因素與水平見表1。

表1 因素與水平Tab 1Factors and levels

2.2 超聲提取工藝試驗

每組稱取川芎、天麻藥材分別為1 568、392 g，浸泡2 h，按照L9（34）正交試驗表各條件進行超聲提取2次，合并提取液，過濾，取樣，備用。

2.3 含量測定及正交試驗

2.3.1 對照品溶液的制備（1）阿魏酸對照品溶液。精密稱取阿魏酸對照品26.90 mg，置于250 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液（質(zhì)量濃度為107.60 μg/mL）。精密吸取貯備液10 mL，置于50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液（質(zhì)量濃度為21.52 μg/mL）。（2）天麻素對照品溶液。精密稱取60℃下減壓干燥至恒質(zhì)量的天麻素對照品43.95 mg，置于250 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品貯備液（質(zhì)量濃度為175.80 μg/mL）。精密吸取貯備液10 mL，置于25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液（質(zhì)量濃度為70.32 μg/mL）。

2.3.2 供試品溶液的制備（1）檢測阿魏酸含量供試品溶液的制備。精密吸取“2.2”項下各樣品溶液15 mL，分別置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。（2）檢測天麻素含量供試品溶液的制備。精密吸取“2.2”項下各樣品溶液15 mL，分別置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，殘渣用甲醇-0.1%磷酸（5∶95，V/V）混合液溶解并定容至50 mL量瓶中，搖勻，用0.45 μm的濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件（1）阿魏酸。色譜柱：Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸（20∶80，V/V）；檢測波長：322 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。（2）天麻素。色譜柱：Symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.1%磷酸（3∶97，V/V）；檢測波長：221 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL。

取“2.3.1”項下對照品溶液及“2.3.2”項下供試品溶液（正交試驗1號的樣品）進樣分析，色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1HPLC chromatograms

2.3.4 線性關(guān)系考察（1）阿魏酸。取“2.3.1”項下阿魏酸對照品貯備液，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得質(zhì)量濃度為10.76、21.52、43.04、64.56、86.08、107.60 μg/mL的對照品溶液，進樣，測定峰面積。以對照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝51.633x+1.107 1（R2＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果，阿魏酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍為10.76～107.60 μg/mL。（2）天麻素。取“2.3.1”項下天麻素對照品貯備液，分別精密吸取1、2、4、6、8、10 mL至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別得質(zhì)量濃度為17.58、35.16、70.32、105.48、140.64、175.80 μg/mL的對照品溶液，進樣，測定峰面積。以對照品質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y＝8.845x+2.189 3（R2＝0.999 9，n＝6）。結(jié)果，天麻素檢測質(zhì)量濃度線性范圍為17.58～175.80 μg/mL。

2.3.5 精密度考察取阿魏酸對照品溶液（質(zhì)量濃度為43.04 μg/mL）、天麻素對照品溶液（質(zhì)量濃度為70.32μg/mL）連續(xù)進樣6次，計算峰面積的RSD。結(jié)果，阿魏酸、天麻素的峰面積的RSD分別為0.47%、0.87%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性考察取正交試驗1號樣品制備成供試品溶液，分別于放置0、2、4、8、12 h后進樣測定，計算各時間點峰面積的RSD。結(jié)果，阿魏酸、天麻素峰面積的RSD分別為1.04%、0.92%（n＝5），表明供試品溶液放置12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性考察取正交試驗1號樣品制備成供試品溶液，平行制備6份，進樣測定，計算6份樣品中阿魏酸、天麻素的含量及RSD。結(jié)果，阿魏酸、天麻素平均含量分別為66.71、96.12 μg/mL，RSD分別為0.64%、0.85%（n＝6），表明試驗重復(fù)性良好。

2.3.8 準(zhǔn)確度考察取正交試驗1號樣品（阿魏酸、天麻素的含量分別為66.71、96.12 μg/mL）7.5 mL，分別加入阿魏酸和天麻素對照品貯備液（質(zhì)量濃度分別為107.60、175.80 μg/mL）5、4 mL，制備成供試品溶液，平行制備6份，測定峰面積。結(jié)果，阿魏酸、天麻素的平均加樣回收率分別為99.72%、98.21%（RSD分別為1.82%、1.14%，n＝6），表明本法準(zhǔn)確度符合要求。

2.3.9 有效成分含量測定及正交試驗結(jié)果分別精密吸取各供試品和對照品溶液10 μL進樣，測定峰面積，計算各供試品中阿魏酸、天麻素的轉(zhuǎn)移率（阿魏酸轉(zhuǎn)移率＝提取液中阿魏酸總量/川芎藥材中阿魏酸總量×100%；天麻素轉(zhuǎn)移率＝提取液中天麻素總量/天麻藥材中天麻素總量×100%），并計算總轉(zhuǎn)移率評分（阿魏酸的轉(zhuǎn)移率/阿魏酸最大轉(zhuǎn)移率×100×0.5+天麻素的轉(zhuǎn)移率/天麻素最大轉(zhuǎn)移率×100×0.5）。正交試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Tab 2Orthogonal test design and results

以總轉(zhuǎn)移率評分為評價指標(biāo)進行直觀分析，由表2可見，各因素影響大小順序為A＞D＞B＞C，即乙醇體積分數(shù)＞乙醇用量＞提取時間＞超聲功率；最優(yōu)工藝為A2B2C2D2，即藥材加8倍量70%乙醇浸泡2 h后，在超聲功率350 W下超聲1.5 h，提取2次。以離均差平方和最小的因素項（C）為誤差項進行方差分析，由表3可見，B、D因素對阿魏酸、天麻素兩者的總轉(zhuǎn)移率評分無顯著性影響，而A因素對阿魏酸、天麻素兩者的總轉(zhuǎn)移率評分有顯著性影響。

綜合總轉(zhuǎn)移率評分、生產(chǎn)成本等多方面考慮，確定超聲波提取最優(yōu)工藝為A2B2C2D2，即取天麻、川芎飲片，加8倍量70%乙醇浸泡2 h，以提取功率350 W超聲提取2次，每次1.5 h。

表3 方差分析結(jié)果Tab 3Results of variance analysis

2.4 工藝驗證

稱取同一批川芎、天麻藥材各3份，其中每份川芎藥材1 568 g、天麻藥材392 g，按最優(yōu)提取工藝進行驗證，結(jié)果見表4。

表4 工藝驗證結(jié)果Tab 4Results of verification test

由表4可見，按照正交試驗優(yōu)化的超聲波提取工藝條件進行驗證試驗后，阿魏酸和天麻素轉(zhuǎn)移率平均值分別為94.06%、95.02%（RSD分別為0.18%、0.47%，n＝3），表明該優(yōu)化工藝轉(zhuǎn)移率高，結(jié)果穩(wěn)定、可行。

3 討論

在預(yù)試驗中，筆者曾采用90%乙醇回流提取法進行提取，結(jié)果阿魏酸轉(zhuǎn)移率為81.5%，天麻素轉(zhuǎn)移率為85.6%，故采用乙醇超聲提取以期進一步提高其轉(zhuǎn)移率。

阿魏酸是川芎中具有代表性的活性成分，可溶于熱水、乙醇、乙酸乙酯中，但不耐熱，水回流提取工藝下溫度太高易被破壞，而且水煎提取液中阿魏酸的含量較低、含糖量較高，不利于后續(xù)工藝的處理，所以本試驗選擇乙醇為提取溶劑。

天麻藥材質(zhì)地堅硬，宜用溶劑將藥材浸泡2 h后再進行提取，既可增加有效成分在溶劑中的溶解度，提高提取效果，又可避免長時間提取對有效成分的破壞。

本試驗采用正交試驗，考察了溶劑（乙醇）體積分數(shù)、溶劑（乙醇）用量、提取時間、超聲功率4個因素的影響；至于浸泡時間、提取次數(shù)、超聲頻率3個因素及濃縮、干燥對阿魏酸、天麻素含量的影響，將有待進一步研究。

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Optimization of Ultrasonic Extraction Technology for Tianshu Capsules by Orthogonal Test

FU Dongning1，LI Xiangyong1，WANG Zhenzhong2，WU Jianxiong2，NI Caili3（1.Dept.of Pharmacy，Lianyungang Hospital of TCM，Jiangsu Lianyungang 222004，China；2.Research Institute，Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.Ltd.，Jiangsu Lianyungang 222004，China；3.School of TCM，Jiangxi University of TCM，Nanchang 330045，China）

OBJECTIVE：To optimize the ultrasonic extraction technology for Tianshu capsules.METHODS：Using the transfer rate of active ingredient ferulic acid in Ligusticum chuanxiong and gastrodin in Gastrodia elata of Tianshu capsules as investigation indexes，L9（34）orthogonal design test was adopted to investigate the effects of ethanol volume fraction，ethanol amount，extraction time and ultrasonic power on the extraction rate.Ultrasonic extraction technology for Tianshu capsules was optimized，and verification test was carried out.RESULTS：The optimized extraction technology for Tianshu capsules was as follow as 8-fold 70%ethanol，extracting twice under 350 W，extracting 1.5 h every time.Results of verification test showed the average transfer rate was 94.06%for ferulic acid（RSD＝0.18%，n＝3）and 95.02%for gastrodin（0.47%，n＝3）.CONCLUSIONS：The optimized technology is rapid，simple，stable and feasible，and can be used for extracting the active ingredients in Tianshu capsules.

Ultrasonic extraction；Tianshu capsules；Orthogonal test；Ligusticum chuanxiong；Gastrodia elata；Ferulic acid；Gastrodin；Technology optimization；Content determination

R284.2

A

1001-0408（2017）34-4853-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.26

國家“重大新藥創(chuàng)制”——現(xiàn)代中藥創(chuàng)新集群與數(shù)字制藥技術(shù)平臺基金資助項目（No.2013ZX09402203）

＊主任中藥師。研究方向：中藥制劑研究與開發(fā)。電話：0518-85501719。E-mail：908846266@qq.com

2017-05-09

2017-08-29）

（編輯：劉萍）