黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響Δ

胡雪原，李杏英，楊勤，黃立中（.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系，重慶4040；.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科，長沙4000）

黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響Δ

胡雪原1＊，李杏英1，楊勤1，黃立中2（1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)系，重慶404120；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)科，長沙410002）

目的：研究黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙型肝炎模型小鼠血清炎癥因子及肝功能的影響。方法：將60只小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、黃芪注射液組（0.5 mL/10 g）、恩替卡韋組（45 μg/kg）和聯(lián)用組（0.5 mL/10 g黃芪注射液+45 μg/kg恩替卡韋），各12只。除正常對(duì)照組外，其余4組小鼠均建立乙型肝炎模型。成模后，各組小鼠ig給藥，每天1次，連續(xù)4周。給藥結(jié)束后，檢測(cè)小鼠血清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）水平，觀察各組小鼠肝組織的病理學(xué)變化。結(jié)果：與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8、AST、ALT和TBIL水平均顯著升高（P＜0.05），肝細(xì)胞呈彌散性重度脂肪變性。與模型組比較，各給藥組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8、AST、ALT和TBIL水平均顯著降低（P＜0.05），肝組織病理學(xué)變化得到不同程度改善，且聯(lián)用組小鼠指標(biāo)改善程度優(yōu)于黃芪注射液組和恩替卡韋組（P＜0.05）。結(jié)論：黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋有助于下調(diào)乙型肝炎模型小鼠血清中炎癥因子表達(dá)、改善肝功能水平，且兩藥聯(lián)用效果優(yōu)于兩藥單用。

黃芪注射液；恩替卡韋；乙型肝炎；炎癥因子；肝功能；小鼠

慢性乙型肝炎（簡稱乙肝）是指由乙肝病毒（HBV）感染導(dǎo)致的以肝損傷為主的全身性傳染疾病，可發(fā)展為肝硬化，且隨著病情的繼續(xù)發(fā)展和HBV的進(jìn)一步復(fù)制，則可能發(fā)展為肝細(xì)胞癌[1]。恩替卡韋為新一代抗HBV藥，能有效抑制HBV的DNA復(fù)制[2-3]，在病毒性肝炎的臨床治療中具有重要作用。但恩替卡韋臨床應(yīng)用時(shí)需要考慮患者的耐受程度以及不良反應(yīng)發(fā)生情況，在應(yīng)用時(shí)較為受限，導(dǎo)致患者的臨床預(yù)后結(jié)局差異性較大。因此，恩替卡韋治療乙肝的安全性與有效性一直是臨床研究熱點(diǎn)。近年來的相關(guān)研究表明，黃芪注射液有助于改善乙肝患者臨床癥狀，遏制、逆轉(zhuǎn)患者肝纖維化病程，有學(xué)者提出采用恩替卡韋聯(lián)合黃芪注射液的方案治療乙肝，其目的是為了在保證乙肝治療效果的同時(shí)，降低恩替卡韋的應(yīng)用劑量與治療時(shí)間，提升乙肝治療效果以及安全性。本研究通過復(fù)制乙肝小鼠模型，探討黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對(duì)模型小鼠血清中炎性因子及肝功能的影響，為兩藥聯(lián)用治療乙肝提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

JA1203型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；TGL-16型高速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；6500型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；SHH-W21型電熱恒溫水浴鍋（北京市長風(fēng)儀器有限公司）；EVOS智能顯微成像系統(tǒng)及配套顯微鏡（美國Invitrogen公司）。

1.2 藥品與試劑

恩替卡韋片（中美上海施貴寶制藥有限公司，批號(hào)：20151025，規(guī)格：每片0.5 mg）；黃芪注射液（成都地奧九泓制藥有限公司，批號(hào)：20151210，規(guī)格：10 mL/支）；腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（TBIL）試劑盒均購自深圳晶美生物工程有限公司北京分公司。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)C57BL/6小鼠60只，♀♂各半，4～6周齡，體質(zhì)量20～25 g，購于華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物使用合格證號(hào)：SYXK（鄂）2010-0057]。小鼠購入后于室溫為（22.12±0.35）℃、相對(duì)濕度為（55.45±1.21）%的條件下飼養(yǎng)。

2 方法

2.1 分組與給藥

將60只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，根據(jù)編號(hào)隨機(jī)分為5組，分別為正常對(duì)照組、模型組、黃芪注射液組、恩替卡韋組和聯(lián)用組，各12只。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠均參考文獻(xiàn)[4]方法建立HBV感染模型，注射24 h后檢測(cè)小鼠血清中乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg），HBsAg＞1.0 PEIU/mL提示建模成功[5]。造模成功當(dāng)天開始給藥，正常對(duì)照組和模型組小鼠ig 1.5 mL/kg生理鹽水；黃芪注射液組小鼠ig 0.5 mL/10 g黃芪注射液；恩替卡韋組小鼠ig 45 μg/kg恩替卡韋；聯(lián)用組小鼠ig 0.5 mL/10 g黃芪注射液+45 μg/kg恩替卡韋[6]。每天上午9：00－11：00給藥，每天給藥1次，連續(xù)4周。

2.2 標(biāo)本采集、觀察與指標(biāo)檢測(cè)

末次給藥8 h后，摘小鼠眼球取血2 mL，以離心半徑為3 cm、3 000 r/min離心10 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清中炎性因子（TNF-α、IFN-γ、IL-8）水平，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清中肝功能指標(biāo)（AST、ALT、TBIL）水平，具體操作按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。處死小鼠，取肝組織，常規(guī)石蠟切片后，行蘇木精-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察小鼠肝病理學(xué)變化。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 小鼠血清中炎癥因子水平的變化

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平顯著降低，且聯(lián)用組顯著低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12，μg/L）Tab 1Determination results of TNF-α，IFN-γ，IL-8 levels in serum of mice in each group（±s，n＝12，μg/L）

表1 各組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12，μg/L）Tab 1Determination results of TNF-α，IFN-γ，IL-8 levels in serum of mice in each group（±s，n＝12，μg/L）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪注射液組、恩替卡韋組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blankcontrolgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.Astragali radix injection group and entecavir group，ΔP＜0.05

IL-8 32.82±5.35 353.47±42.63＊174.12±22.36#168.29±17.35#105.38±14.52#Δ組別正常對(duì)照組模型組黃芪注射液組恩替卡韋組聯(lián)用組TNF-α 41.02±6.37 212.34±25.61＊110.05±14.25#103.16±12.48#66.29±7.52#Δ IFN-γ 0.26±0.16 2.17±0.48＊1.65±0.42#1.54±0.34#1.06±0.25#Δ

3.2 小鼠血清中肝功能指標(biāo)變化

與正常對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平顯著降低，且聯(lián)用組低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2Determination results of ALT，AST，TBIL levels in serum of mice in each group（±s，n＝12）

表2 各組小鼠血清中ALT、AST、TBIL水平測(cè)定結(jié)果（±s，n＝12）Tab 2Determination results of ALT，AST，TBIL levels in serum of mice in each group（±s，n＝12）

注：與正常對(duì)照組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05；與黃芪注射液組、恩替卡韋組比較，ΔP＜0.05Note：vs.blankcontrolgroup，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05；vs.Astragali radix injection group and entecavir group，ΔP＜0.05

TBIL，μmol/L 4.74±0.68 22.82±3.35＊15.85±2.32#14.62±2.17#5.88±0.79#Δ組別正常對(duì)照組模型組黃芪注射液組恩替卡韋組聯(lián)用組ALT，U/L 40.48±6.36 146.02±15.95＊81.05±10.14#78.93±9.24#47.56±6.78#Δ AST，U/L 46.63±6.51 178.45±16.28＊74.12±9.36#72.54±8.16#51.63±6.09#Δ

3.3 小鼠肝組織病理學(xué)變化

正常對(duì)照組小鼠可見肝細(xì)胞正常，結(jié)構(gòu)完整；模型組小鼠可見肝細(xì)胞呈彌漫性重度脂肪變性，出現(xiàn)壞死或間質(zhì)性炎癥病變；黃芪注射液組和恩替卡韋組小鼠可見輕度肝細(xì)胞彌漫性脂肪變性；聯(lián)用組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)基本完整，與正常對(duì)照組基本相似，結(jié)果見圖1。

4 討論

HBV感染后會(huì)在患者肝組織中不斷復(fù)制，引起肝組織發(fā)生慢性炎癥損傷，此時(shí)機(jī)體會(huì)防御性地對(duì)這種慢性炎癥損傷進(jìn)行主動(dòng)性反復(fù)修復(fù)，引起肝竇內(nèi)肝星狀細(xì)胞活化，膠原在肝內(nèi)不斷沉積，肝內(nèi)纖維組織異常增生，最終導(dǎo)致乙肝、肝硬化的形成[7]。有研究顯示，血清中IL-8水平的變化與乙肝、肝硬化、肝癌等的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，病情越嚴(yán)重，血清中IL-8水平越高[8]。細(xì)胞因子不平衡現(xiàn)象是導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的主要原因，TNF-α、IFN-γ和IL-8均是重要的促炎因子，三者共同作用下可引起組織器官的損壞[9-10]。本研究中，模型組小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平均顯著高于正常對(duì)照組，說明小鼠乙肝模型建立成功，且HBV感染后機(jī)體產(chǎn)生了明顯的炎癥反應(yīng)。

圖1 各組小鼠肝組織切片圖（HE染色，×200）Fig 1Slice of liver tissue of mice in each group（HE staining，×200）

恩替卡韋作為一種新型的核苷類抗病毒藥，也是目前推薦的一線抗病毒治療用藥，能快速、選擇性地抑制HBV的DNA復(fù)制，減輕患者肝細(xì)胞炎癥，修復(fù)損傷的肝細(xì)胞[11-12]。國內(nèi)外研究報(bào)道均證實(shí)了其治療乙肝患者的有效性[13-14]，但由于其易導(dǎo)致上呼吸道感染、咽喉炎等不良反應(yīng)，也易造成ALT水平升高，這在一定程度上制約了其臨床應(yīng)用。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，乙肝多因濕熱瘀毒侵襲所致，病在肝，累及脾、腎。濕熱之毒損傷肝絡(luò)，肝失疏泄則氣滯，氣滯至血液運(yùn)行不暢而致瘀血，本為濕熱之毒，貫穿慢性乙肝病程之始終，治則當(dāng)標(biāo)本兼治。黃芪注射液的主要成分為黃芪，黃芪具有固表斂汗、利水消腫、通調(diào)水道的功效，可增強(qiáng)機(jī)體抵抗力、抑制HBV病毒、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功效[6，15-16]。本文研究中，給藥后小鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-8水平均顯著降低，且聯(lián)用組顯著低于黃芪注射液組和恩替卡韋組，提示黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋能有效減輕乙肝模型小鼠的炎癥反應(yīng)。

長期肝細(xì)胞功能損害是乙肝患者發(fā)生肝硬化的病理基礎(chǔ)。恩替卡韋治療后可有效改善HBeAg陽性患者肝功能[17]。保肝降酶中藥在乙肝的治療中取得了較好的效果[18]。黃芪為多年生草本植物，具有補(bǔ)氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫及免疫調(diào)劑作用。劉淑艷等[19]超聲導(dǎo)入黃芪注射液后發(fā)現(xiàn)，乙肝患者肝功能及血清中肝纖維化指標(biāo)均有改善；王迎霞等[20]采用黃芪注射液聯(lián)合甘利欣注射液治療后，乙肝肝纖維化患者的肝纖維化指標(biāo)和肝功能均有明顯改善。本研究結(jié)果顯示，乙肝模型小鼠血清中肝功能指標(biāo)ALT、AST、TBIL的水平較正常對(duì)照組均顯著升高，給藥后各給藥組小鼠血清中上述肝功能指標(biāo)水平均顯著降低，且以黃芪注射液和恩替卡韋聯(lián)用組效果最優(yōu)。

綜上所述，黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋有助于抑制乙肝模型小鼠血清中炎性因子TNF-α、IFN-γ、IL-8的表達(dá)，改善肝功能。但黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對(duì)乙肝的更多治療作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究，而且由于人體與動(dòng)物對(duì)藥物反應(yīng)能力的差異性，黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋治療乙肝還有待于更多的臨床研究去證實(shí)。

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Effects of Astragali Radix Injection Combined with Entecavir on Serum Inflammatory Cytokines and Liver Function of Model Mice with Hepatitis B

HU Xueyuan1，LI Xingying1，YANG Qin1，HUANG Lizhong2（1.College of TCM，Chongqing Three Gorges Medical College，Chongqing 404120，China；2.Dept.of Internal Medicine，the First Affiliated Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410002，China）

OBJECTIVE：To study the effects of Astragali radix injection combined with entecavir on serum inflammatory cytokines and liver function of model mice with hepatitis B.METHODS：60 mice were randomly divided into normal control group（normal saline），model group（normal saline），Astragali radix injection group（0.5 mL/10 g），entecavir group（45 μg/kg）and combination group（0.5 mL/10 g Astragali radix injection+45 μg/kg entecavir），12 in each group.Except for normal control group，mice in other 4 groups were induced for hepatitis B models.After mod-eling，all mice were intragastrically administrated once a day，for 4 weeks.After administration，tumor necrosis factor α（TNF-α），interferon γ（IFN-γ），interleukin 8（IL-8），aspartate aminotransferase（AST），alanine aminotransferase（ALT），total bilirubin（TBIL）levels in serum were detected，and the pathological changes in liver tissue in each group were observed.RESULTS：Compared with normal control group，TNF-α，IFN-γ，IL-8，AST，ALT，TBIL levels in serum of mice in model group were significantly increased（P＜0.05）；and liver cells were diffuse and severe steatosis.Compared with model group，TNF-α，IFN-γ，IL-8，AST，ALT，TBIL levels in serum of mice in each administration group were significantly decreased（P＜0.05），pathological changes in liver tissue were improved to varying degrees，and the index improvement degree in combination group was superior to Astragali radix injection group and entecavir group（P＜0.05）.CONCLUSIONS：Astragali radix injection combined with entecavir helps to downregulate the expressions of inflammatory cytokines of model mice with hepatitis B，and improve the liver function.The combination use has better effect than single use.

Astragali radix injection；Entecavir；Hepatitis B；Inflammatory cytokines；Liver function；Mice

R512.62

A

1001-0408（2017）34-4800-04 DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.12

重慶市教委科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（No.KJ121802）

＊講師，碩士。研究方向：中西醫(yī)結(jié)合臨床。電話：023-58567969。E-mail：851225755@qq.com

2017-02-22

2017-09-30）

（編輯：林靜）