二氫楊梅素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖及纖維連接蛋白堆積的影響Δ

李加林，郭小華，吳艷嬌，黃志偉，劉思齊，吳素珍（.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西贛州34000；2.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州34000）

二氫楊梅素對(duì)高糖誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞增殖及纖維連接蛋白堆積的影響Δ

李加林1＊，郭小華1，吳艷嬌1，黃志偉1，劉思齊1，吳素珍2#（1.贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西贛州341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，江西贛州341000）

目的：研究二氫楊梅素（DMY）對(duì)高糖（HG）誘導(dǎo)的腎小球系膜細(xì)胞（MCs）的增殖及纖維連接蛋白（FN）堆積的影響，探討其對(duì)糖尿病腎病腎小球硬化的作用機(jī)制。方法：將細(xì)胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）和DMY低、中、高濃度組（30 mmol/L葡萄糖+22.5、45、90 μmol/L DMY），培養(yǎng)48 h后采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞的增殖活性[以光密度（OD）值反映]；采用分子對(duì)接法對(duì)DMY與Smad2的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行模擬分析；將細(xì)胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），培養(yǎng)5 h后采用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中磷酸化Smad2（p-Smad2）及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)水平。結(jié)果：MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，HG組細(xì)胞的OD值顯著升高（P＜0.05）；與HG組比較，DMY各濃度組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P＜0.05）。DMY與Smad2蛋白分子結(jié)合的吉布斯自由能（ΔG）為－5.64 kJ/mol，抑制常數(shù)Ki為73.53 μmol/L，在第465、464、461、458這4個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)有氫鍵供體與受體的結(jié)合。Western blot結(jié)果顯示，與正常組比較，HG組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；與HG組比較，DMY組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：DMY可抑制HG誘導(dǎo)的MCs增殖，并通過(guò)與Smad2結(jié)合，抑制Smad2的磷酸化，繼而降低細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)，從而改善糖尿病腎病腎小球硬化。

二氫楊梅素；腎小球系膜細(xì)胞；增殖；纖維連接蛋白；分子對(duì)接

糖尿病伴有的長(zhǎng)期高血糖常會(huì)使糖尿病患者發(fā)生全身性臟器組織損害，形成慢性并發(fā)癥，其中糖尿病腎?。―iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病發(fā)展過(guò)程中出現(xiàn)的常見(jiàn)而難治的微血管并發(fā)癥。DKD主要病理特征是系膜細(xì)胞增生，系膜區(qū)細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellu-lar matrix，ECM），特別是纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）過(guò)度堆積，是導(dǎo)致終末期腎疾病的主要因素[1-4]。目前臨床治療也只能延緩DKD的發(fā)生和減慢其發(fā)展進(jìn)程，并不能達(dá)到拮抗或逆轉(zhuǎn)腎病變的目的，因此迫切需要尋找新的治療DKD的藥物。

藤茶來(lái)源于葡萄科蛇葡萄屬顯齒蛇葡萄[Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz.）WT.Wang]，多生長(zhǎng)在我國(guó)南方，主要分布在湖北、湖南、江西、福建等地，在民間作為藥食兩用的植物，已經(jīng)有數(shù)百年的歷史[5]。葡萄科蛇葡萄屬的植物中一個(gè)比較有特征性的成分就是二氫楊梅素（Dihydromyricetin，DMY），其中藤茶的DMY含量高達(dá)29%[6]。文獻(xiàn)報(bào)道DMY能夠降血糖[7-8]、調(diào)節(jié)機(jī)體的糖耐受量。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)DMY可以減輕DKD大鼠腎小球硬化[9]，但到目前為止，尚無(wú)人報(bào)道其抗DKD腎小球硬化的機(jī)制。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（Transforming growth factor beta signaling，TGF-β）/Smads信號(hào)通路在DKD動(dòng)物模型和細(xì)胞模型中均被激活，其中Smad2磷酸化水平升高是TGF-β/Smads信號(hào)通路激活的一個(gè)重要節(jié)點(diǎn)[10-11]。抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路激活可以延緩DKD的進(jìn)程，Smad2是TGF-β/Smads信號(hào)通路下游一個(gè)重要的信號(hào)分子，筆者推測(cè)DMY可能是通過(guò)抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路對(duì)DKD起保護(hù)作用的。因此，筆者首先采用分子對(duì)接法從理論水平分析DMY與Smad2有結(jié)合位點(diǎn)，從而推測(cè)DMY能夠抑制Smad2的活化。然后采用細(xì)胞試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證DMY能夠抑制高糖（HG）環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞（MCs）中Smad2磷酸化，進(jìn)而抑制FN的表達(dá)，為將DMY開(kāi)發(fā)成治療DKD藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

1510酶標(biāo)儀[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；GBOX Chemi XRQ熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（英國(guó)Syngene公司）；二氧化碳（CO2）細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 藥品與試劑

DMY（贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制，批號(hào)：20160706，經(jīng)高效液相色譜法測(cè)定其純度＞95%）；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、MTT（美國(guó)Sigma公司）；兔抗大鼠磷酸化Smad2（p-Smad2）一抗（美國(guó)CST公司）；小鼠抗大鼠FN抗體（美國(guó)BD Biosciences公司）；小鼠抗大鼠β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗、辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗鼠二抗（美國(guó)Santa Cruz公司）；電化學(xué)發(fā)光（ECL）液（美國(guó)Thermo公司）；二辛可寧酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 動(dòng)物

清潔級(jí)SD大鼠，♂，體質(zhì)量200～220 g，購(gòu)于贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（贛）2014-0001。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

取正常成年SD大鼠，在無(wú)菌條件下取出腎組織，去除腎包膜，采用分樣篩法分離出腎小球，通過(guò)優(yōu)生選擇法進(jìn)行MCs分離，經(jīng)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)鑒定，原代系膜細(xì)胞平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）抗體免疫熒光染色呈陽(yáng)性，去氧腎上腺素（Nephrin）抗體間接免疫熒光呈陰性[12-13]。將原代培養(yǎng)的MCs置于含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于飽和濕度、37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)基。本研究采用6～16代MCs進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2 MTT法檢測(cè)DMY對(duì)HG刺激的MCs增殖的影響

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCs，制成密度為1.0×105mL－1的細(xì)胞懸液，以每孔180 μL接種于96孔培養(yǎng)板中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h。然后將細(xì)胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY低濃度組（30 mmol/L葡萄糖+22.5 μmol/L DMY）、DMY中濃度組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）、DMY高濃度組（30 mmol/L葡萄糖+90 μmol/L DMY）。培養(yǎng)48 h后，向96孔板內(nèi)加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后去掉培養(yǎng)液，向各孔中加入150 μL的DMSO，待藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)量各孔的光密度（OD）值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm。細(xì)胞存活率（%）＝試驗(yàn)組OD值/正常組OD值×100%。

2.3 分子對(duì)接法分析DMY與Smad2的結(jié)合情況

首先采用ISIS Draw軟件來(lái)繪制DMY配體的2D結(jié)構(gòu)，再運(yùn)用Online Demos VIEWDD軟件轉(zhuǎn)化成3D結(jié)構(gòu)，保存為配體PDB文件。然后下載PDB受體文件，通過(guò)應(yīng)用Chimera軟件來(lái)刪除非核心區(qū)肽鏈和原有配體及水分子，從而得到簡(jiǎn)化后的PDB受體文件。然后準(zhǔn)備對(duì)接文件，首先打開(kāi)AutoDock Tools軟件生成配體PDBQT文件及受體PDBQT文件，再運(yùn)用Python來(lái)修改受體PDBQT文件中錯(cuò)誤的電荷參數(shù)，接著運(yùn)用AutoDock Tools軟件對(duì)上述2個(gè)文件設(shè)定對(duì)接模式參數(shù)和對(duì)接網(wǎng)格，獲得DPF文件及GPF文件。用AutoGrid 4軟件使GPF文件生成相應(yīng)的Map對(duì)接文件，再用AutoGrid 4軟件將其中的DPF文件與由GPF文件生成Map文件進(jìn)行對(duì)接計(jì)算得到DLG數(shù)據(jù)文件，用AutoDock Tools軟件分析DLG數(shù)據(jù)文件，得到吉布斯自由能（ΔG）及抑制常數(shù)Ki等相關(guān)分子對(duì)接數(shù)據(jù)。當(dāng)ΔG≤0，說(shuō)明配體與受體容易結(jié)合，且ΔG越小分子間的結(jié)合越穩(wěn)定；Ki值越小說(shuō)明配體與受體結(jié)合能力越強(qiáng)。

2.4 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Smad2的磷酸化水平與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCs，制成密度為1.0×105mL－1的細(xì)胞懸液，按每皿2 mL接種于直徑為6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置入37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，換無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞生長(zhǎng)同步化。然后將細(xì)胞分為正常組（5.5 mmol/L葡萄糖）、HG組（30 mmol/L葡萄糖）、DMY組（30 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY）和DMY對(duì)照組（5.5 mmol/L葡萄糖+45 μmol/L DMY），每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)5 h后，在培養(yǎng)皿中加入細(xì)胞裂解液120 μL，然后置于4℃冰箱中裂解10 min。用細(xì)胞刮刷將細(xì)胞刮下，將其吸入EP管中后置于離心半徑為8 cm的冷凍離心機(jī)中離心（1 2000 r/min）10 min，收集上清。采用十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離樣品中的蛋白成分，各泳道蛋白上樣量為50 μg。再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到0.45 μm硝酸纖維素膜（NC膜）上，5%脫脂奶粉封閉，然后與一抗4℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后再與HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育2 h，TBST再次洗膜。ECL檢測(cè)免疫印跡信號(hào)，用灰度值表示蛋白表達(dá)量。將正常組蛋白表達(dá)量的灰度值看作1，其他組相應(yīng)蛋白灰度值和正常組蛋白灰度值的比值就是該蛋白量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，多個(gè)樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 DMY對(duì)HG環(huán)境下MCs增殖的影響

與正常組比較，HG組細(xì)胞的OD值顯著升高（P＜0.05），說(shuō)明HG能夠誘導(dǎo)MCs增殖。與HG組比較，DMY各濃度組細(xì)胞的OD值均顯著降低（P＜0.05），且呈濃度效應(yīng)關(guān)系，可見(jiàn)DMY可明顯抑制HG誘導(dǎo)的MCs增殖，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 DMY對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

表1 DMY對(duì)系膜細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝6）Tab 1Effect of DMY on the proliferation of glomerular mesangial cells（±s，n＝6）

注：與正常組比較，＊P＜0.05；與HG組比較，#P＜0.05Note：vs.normal group，＊P＜0.05；vs.HG group，#P＜0.05

細(xì)胞存活率，%100.00 128.81 72.03 45.34 39.62組別正常組HG組DMY低濃度組DMY中濃度組DMY高濃度組OD值0.472±0.083 0.608±0.105＊0.340±0.041#0.214±0.037#0.187±0.015#

3.2 DMY與Smad2的分子對(duì)接數(shù)據(jù)

通過(guò)運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行計(jì)算并模擬分析，得到配體DMY與Smad2蛋白分子結(jié)合的ΔG為－5.64 kJ/mol，Ki為73.53 μmol/L。當(dāng)ΔG≤0，配體與受體的結(jié)合會(huì)比較容易，且其數(shù)值與結(jié)合傾向的穩(wěn)定性呈負(fù)相關(guān)。在圖1三維結(jié)合模擬中，筆者也發(fā)現(xiàn)配體化合物DMY與其模擬結(jié)合的蛋白（Smad2）在第465、464、461、458這4個(gè)氨基酸殘基位點(diǎn)有氫鍵供體與受體的結(jié)合。DMY與Smad2蛋白的分子對(duì)接立體空間示意圖見(jiàn)圖1。

圖1 DMY與Smad2蛋白的分子對(duì)接立體空間示意圖Fig1Moleculardockingthree-dimensional space diagram of DMY with Smad2 protein

3.3 DMY對(duì)HG環(huán)境下細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)的影響

與正常組比較，HG組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），DMY對(duì)照組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明HG能夠誘導(dǎo)MCs中Smad2的磷酸化及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)上調(diào)。與HG組比較，DMY組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），說(shuō)明DMY能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的MCs中Smad2的磷酸化及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)上調(diào)。DMY對(duì)照組和正常組比較，細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），說(shuō)明DMY對(duì)正常MCs中Smad2磷酸化及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)沒(méi)有明顯影響，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

圖2 各組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)的電泳圖Fig2Electrophoresischartsofexpressions ofp-Smad2andextracellularmatrix protein FN in each group

4 討論

DKD的主要病理學(xué)表現(xiàn)為腎體積增大，腎小球基底膜增厚，系膜細(xì)胞增生、肥大及系膜區(qū)ECM進(jìn)行性積聚。FN是TGF-β/Smads信號(hào)通路下游的一個(gè)重要靶蛋白，也是ECM的主要組成成分之一，在DKD動(dòng)物模型中表達(dá)會(huì)顯著增加，是DKD腎小球硬化主要指標(biāo)之一[14-16]。本研究通過(guò)MTT試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，低、中、高濃度DMY均能夠顯著抑制HG誘導(dǎo)的MCs增殖。

TGF-β/Smads信號(hào)通路是腎纖維化的一個(gè)經(jīng)典的信號(hào)通路，在糖尿病大鼠和HG刺激的系膜細(xì)胞中該通路是異常激活的，其激活可誘導(dǎo)腎小球和腎小管的細(xì)胞肥大，介導(dǎo)足細(xì)胞損傷，促進(jìn)系膜細(xì)胞增生、基底膜增厚，以及促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化，是發(fā)病機(jī)制的最后共同通路，因而通過(guò)抑制TGF-β/Smads信號(hào)通路可以減緩DKD的進(jìn)程[17-20]。而Smad2是TGF-β/Smads信號(hào)通路下游的一個(gè)重要信號(hào)分子，TGF-β主要是通過(guò)調(diào)節(jié)其下游的Smad2和Smad3的磷酸化來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DMY能夠抑制HG誘導(dǎo)下MCs中Smad2的磷酸化與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN的表達(dá)。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，DMY可能是通過(guò)與Smad2結(jié)合，抑制了Smad2的磷酸化，抑制了DKD大鼠MCs中TGF-β/Smads信號(hào)通路激活，繼而影響MCs中FN的堆積，從而改善DKD的腎小球硬化。

圖3 各組細(xì)胞中p-Smad2及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白FN表達(dá)的測(cè)定結(jié)果Fig 3Determination results of protein expressions of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in each group

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Effect of Dihydromyricetin on High Glucose-induced Glomerular Mesangial Cell Proliferation and Fibronectin Accumulation

LI Jialin1，GUO Xiaohua1，WU Yanjiao1，HUANG Zhiwei1，LIU Siqi1，WU Suzhen2（1.School of Pharmacy，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China；2.School of Basic Medicine，Gannan Medical University，Jiangxi Ganzhou 341000，China）

OBJECTIVE：To study the effect of dihydromyricetin（DMY）on high glucose（HG）-induced glomerular mesangial cell（MCs）proliferation and fibronectin（FN）accumulation，and explore its mechanism for diabetic nephropathy glomerulosclerosis.METHODS：Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY low-concentration，medium-concentration，high-concentration groups（30 mmol/L glucose+22.5，45，90 μmol/L DMY）.After incubating 48 h，MTT was used to detect the proliferative activity[reflected by the optical density（OD）value]of cells；molecular docking method was adopted to conduct simulation analysis for DMY binding state with Smad2.Cells were divided into normal group（5.5 mmol/L glucose），HG group（30 mmol/L glucose），DMY group（30 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）and DMY control group（5.5 mmol/L glucose+45 μmol/L DMY）.After incubating 5 h，Western blot was used to detect the expression levels of phosphorylated Smad2（p-Smad2）and extracellular matrix protein FN.RESULTS：Results of MTT detection showed，compared with normal group，OD values in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，OD values in DMY each concentration group were significantly reduced（P＜0.05）.The Gibbs free energy（ΔG）of DMY and Smad2 protein was－5.64 kJ/mol，Kiwas 73.53 μmol/L，and there were hydrogen bond donor and receptor binding in No.465，464，461，458 amino acid residues.Results of Western blot showed，compared with normal group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in HG group were significantly increased（P＜0.05）；compared with HG group，expression levels of p-Smad2 and extracellular matrix protein FN in DMY group were significantly decreased（P＜0.05）.CONCLUSIONS：DMY inhibits HG-induced MCs proliferation and improves diabetic nephropathy glomerulosclerosis by combining with Smad2 and inhibiting Smad2 phosphorylation to reduce the extracellular matrix protein FN expression.

Dihydromyricetin；Glomerular mesangial cells；Proliferation；Fibronectin；Molecular docking

R587.2

A

1001-0408（2017）34-4784-04

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.34.08

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.31660334）；江西省青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.20161BAB215217）

＊副教授，碩士。研究方向：天然藥物活性成分。電話：0797-8169775。E-mail：jialinli2005@126.com

#通信作者：副教授，博士。研究方向：糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制及藥物防治。電話：0797-8169770。E-mail：wusuzhen2005@126.com

2017-06-12

2017-09-17）

（編輯：林靜）