慢性心力衰竭病人外周Th17細(xì)胞功能檢測的臨床意義

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慢性心力衰竭病人外周Th17細(xì)胞功能檢測的臨床意義

古麗仙·玉素甫

目的探討慢性心力衰竭病人外周血中CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞及白介素-6(IL-6)、白介素-22(IL-23)、白介素-17(IL-17)、RORγt的表達(dá)變化及其與慢性心力衰竭病程進(jìn)展的關(guān)系。方法選取2013年1月—2014年6月在我院心血管內(nèi)科確診的慢性心力衰竭病人60例，同期無心臟疾病的健康人30名為對照。分別抽取不同心功能分級的慢性心力衰竭病人及對照者外周血，以流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞表達(dá)水平，real-time PCR檢測外周血單核細(xì)胞(PBMC)中IL-6、IL-23、IL-17、RORγt基因表達(dá)變化。結(jié)果慢性心力衰竭病人CD4+IL-17+輔助性T細(xì)胞17(Th17)百分率、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和IL-6、IL-23、IL-17基因表達(dá)水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)；與心功能分級為Ⅰ級～Ⅱ級慢性心力衰竭病人相比，心功能分級為Ⅲ級～Ⅳ級慢性心力衰竭病人Th17細(xì)胞百分率以及RORγt、IL-6、IL-23、IL-17基因表達(dá)水平均顯著升高(P<0.01)。結(jié)論慢性心力衰竭病人中Th17細(xì)胞及其功能相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)情況與慢性心力衰竭病人病情的進(jìn)展呈正相關(guān)，心力衰竭越嚴(yán)重，Th17表達(dá)率越高。因此，抑制Th17細(xì)胞及其功能相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)是治療慢性心力衰竭的重要措施。

慢性心力衰竭； 輔助性T細(xì)胞17；白介素-17；RORγt；白介素-6；白介素-23

慢性充血性心力衰竭(chronic congestive heart failure，CHF)是一種復(fù)雜的心室異構(gòu)綜合征[1]。眾多學(xué)者從免疫學(xué)角度研究其發(fā)病機(jī)制發(fā)現(xiàn)，慢性心力衰竭病人處于免疫激活及炎癥持續(xù)反應(yīng)狀態(tài)，炎癥因子水平急劇上升[2]。傳統(tǒng)的治療慢性心力衰竭藥物研究中發(fā)現(xiàn)具有抗炎癥因子作用，例如卡托普利和血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑洛沙坦可以抑制慢性心力衰竭病人腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的水平。輔助性T細(xì)胞17(Th17)是由TH0細(xì)胞在IL-6和白介素-23(IL-23)的刺激下分化而成的輔助性T細(xì)胞，主要分泌白介素-17(IL-17)、白介素-22(IL-22)等促炎癥因子，RORγt是其重要的轉(zhuǎn)錄因子[3]。Th17 細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)是近來免疫學(xué)研究的重大突破，對深入研究炎癥、自身免疫病等免疫學(xué)機(jī)制具有重要意義[4]。本研究擬通過檢測慢性心力衰竭病人外周血中CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞及IL-6、IL-23、IL-17、RORγt的表達(dá)變化，進(jìn)一步闡明Th17細(xì)胞及其作用因子在慢性心力衰竭中發(fā)揮的作用，探討Th17細(xì)胞功能與慢性心力衰竭病程進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2013年1月—2014年6月在我院心血管內(nèi)科確診的慢性心力衰竭病人60例，男42例，女28例；病程1年～8年；年齡48歲～76歲(62.82歲±8.60歲)；其中高血壓性心臟病18例，冠心病20例，擴(kuò)張型心肌病11例，瓣膜性心臟病11例。入選標(biāo)準(zhǔn)：參照中華醫(yī)學(xué)會心血管病學(xué)分會2007年制定的《中國慢性心力衰竭診斷治療指南》確診為CHF至少3個(gè)月；紐約心臟病學(xué)會(NYHA)心功能Ⅰ級～Ⅳ級；左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)<40%。排除標(biāo)準(zhǔn)：自身免疫性疾病病人，靜息狀態(tài)下心率<55次/min、血壓≤90 /50 mmHg，肝腎功能不全病人。60例慢性心力衰竭病人按照心功能狀況分為A、B兩組：A組(心功能Ⅰ級～Ⅱ級)28例，B組(心功能Ⅲ～Ⅳ級)32例，兩組病人的年齡、性別、基礎(chǔ)疾病構(gòu)成、心功能分級等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究方案經(jīng)過醫(yī)院倫理學(xué)委員會審查批準(zhǔn)，所有受試對象均知情同意。病人確診后詳細(xì)觀察心衰的癥狀、心率、心律、血壓、呼吸等變化，記錄心電圖及24 h動態(tài)心電圖。另選擇同期在本院體檢的心功能正常人30名為健康對照組，其中男16名，女14名，年齡(56.24±12.13歲)。

1.2 主要試劑與儀器 RPMI 1640和胎牛血清(美國Thermo公司)；人淋巴細(xì)胞分離液 (天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)；佛波醇乙酯(PMA)、離子霉素(Ion)、莫能菌素(Mon)、破膜劑、CD4-FITC、IL-17A-APC流式抗體；Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Fast Start Universal SYBR Green Master熒光定量RT-PCR試劑盒，德國Roche公司；ABI7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；BD FACSVerseTMSystem流式細(xì)胞儀，美國BD Biosciences公司。

1.3 方法

1.3.1 心功能的測定 于入院24 h 內(nèi)測定心功能，采用GE公司的心臟彩超儀于左心長軸切面健索水平取M 型超聲測得左室射血分?jǐn)?shù)，在胸骨旁左心長軸切面腿索水平測得左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)。

1.3.2 Th17細(xì)胞檢測 采集慢性心力衰竭病人和健康對照者前臂外周抗凝血5 mL，用人淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核細(xì)胞(PBMC，1×106/mL)200 μL，置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入刺激劑PMA及離子霉素、莫能霉素等工作液并混勻，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h～6 h。用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，離心收集細(xì)胞，加人5 μL異硫氰酸熒光素標(biāo)記的CD4(CD4-FITC)、5 μL藻紅蛋白標(biāo)記的IL-17(IL-17A-APC)，操作按試劑盒說明書進(jìn)行，采用流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞。

1.3.3 RORγt、IL-6、IL-23、IL-17 mRNA檢測 采集各實(shí)驗(yàn)組人群外周抗凝血3 mL，用人淋巴細(xì)胞分離液提取外周血單核細(xì)胞(PBMC，1×106/mL)，以TRIzol一步法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，采用Primer5程序設(shè)計(jì)5對引物，經(jīng)BLAST數(shù)據(jù)庫比對后，選擇最佳候選引物，由上海Invitrogen公司合成。引物序列如下： RORγt，F(xiàn)-5’-TCAAGT TTGGCCGAATGTC-3’，R-5’-CATCTGAGAGCCCTAAAGTGTATG-3’，368bp；IL-6，F(xiàn)-5’-GGTACATCCTCGACGGCATCTC-3’，R-5’-GTTGGGTCAGGGGTGGTTATTG-3’，334bp；IL-17A，F(xiàn)-5’AATCTCCACCGCAATGAGGA3’，R-5’ACGTTCCCATCAGCGTTGA3’；IL-23，F(xiàn)- 5’AATCTCCACCGCAATGAGGA3’，R-5’ACGTTCCCATCAGCGTTGA3’，311bp，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)：5’-CTCTC TGCTCCTCCTGTTCGAC- 3’和5’-TGAGCGATGTGGCTCGG CT-3’，256bp；擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，40個(gè)循環(huán)的95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min。PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行產(chǎn)物的熔解曲線分析，系統(tǒng)軟件自動分析在每個(gè)周期中產(chǎn)生的熒光信號，閾循環(huán)值用于確定與甘油醛-3 - 磷酸脫氫酶作為參考基因的基因表達(dá)的相對定量。

2 結(jié) 果

2.1 慢性心力衰竭病人與對照者心功能指標(biāo)變化 兩組治療后心功能指標(biāo)與正健康對照組相比，LVEF顯著增加(P<0.05)，LVEDd顯著縮小(P<0.05)；同時(shí)，A組病人LVEF明顯低于B組(P<0.05)，LVEDd較B組明顯增大(P<0.05)。詳見表1。

組別nLVEF(%)LVEDd(mm)A組 2851．6±4．21)56．5±4．11)B組 32 31．0±5．21)2) 65．1±5．21)2)健康對照組3064．2±5．546．1±5．7 與健康對照組相比，1)P<0．05；與A組相比，2)P<0．05。

2.2 慢性心力衰竭病人與對照者外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)比較 健康對照組CD4+IL-17+T細(xì)胞百分率為顯著低于A組[(0.495±0.309)% vs(1.556±0.491)%，t=-21.07，P<0.001]及B組[(0.495±0.309)% vs(2.862±0.247)%，t=-13.676，P<0.01]，與A組相比，B組Th17細(xì)胞百分率顯著升高[(0.895±0.309)%vs (0.557±0.163)%，t=2.396，P<0.05]。詳見圖1。

圖1 慢性心力衰竭病人與對照者外周血中Th17細(xì)胞的表達(dá)比較

2.3 各組外周血單核細(xì)胞中RORt、IL-6、IL-17、IL-23基因表達(dá)(見表2)

組別nRORγtIL?6IL?17IL?23健康對照組300．774±0．1081．021±0．3040．285±0．0680．385±0．068A組 280．974±0．2121)1．706±0．5071)0．728±0．1141)0．563±0．0591)B組 32 1．190±0．2031)2)2．937±0．6041)2)1．390±0．2031)2)0．801±0．0141)2) 與健康對照組比較，1)P<0．05；與A組比較，2)P<0．05。

3 討 論

慢性充血性心力衰竭是由于鈉、水潴留和血容量增加引起的充血性心力衰竭過程，CHF同時(shí)也是一個(gè)免疫激活的過程，與機(jī)體的炎癥反應(yīng)過程密切相關(guān)[5]。機(jī)體免疫病理損傷在慢性心力衰竭發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[6]，新近的流行病學(xué)研究顯示，CHF病人體內(nèi)的炎癥水平升高，免疫系統(tǒng)紊亂及細(xì)胞因子紊亂失衡是慢性心力衰竭重要的致命因素之一。近來研究表明Th17細(xì)胞是Th細(xì)胞中作用最強(qiáng)的促炎細(xì)胞。因此，Th17細(xì)胞在CHF的發(fā)生和發(fā)展中所扮演的角色是值得研究者關(guān)注的[7]。

Th17細(xì)胞是近年發(fā)現(xiàn)的一種新的不同于Th1、Th2的CD4+T細(xì)胞亞群，研究發(fā)現(xiàn)[8]，Th17可能是重要的自身免疫性和炎性疾病發(fā)病過程的主要調(diào)節(jié)者，絕大多數(shù)病人發(fā)生慢性心力衰竭時(shí)表現(xiàn)為免疫抑制及炎癥反應(yīng)。IL-6和轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)的存在下，幼稚的CD4+T細(xì)胞分化為Th17細(xì)胞，并產(chǎn)生其主要效應(yīng)因子IL-17(主要是指IL-17A)[9]。IL-17是1995年發(fā)現(xiàn)的一類來源于T細(xì)胞的促炎細(xì)胞因子。IL-17與受體結(jié)合后，可以作用于多種細(xì)胞類型來誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞因子[包括TNF-α、IL-6、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-23]，發(fā)揮著促進(jìn)炎癥發(fā)展、免疫應(yīng)答等多種功能[10]。TNF-α、IL-6與CHF有著密切的關(guān)系。心衰病人血液循環(huán)中TNF-α、IL-6濃度顯著高于正常人，且與CHF嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。TNF-α不僅可以通過阻止細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的增高誘導(dǎo)心肌收縮功能異常，而且可以誘導(dǎo)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡[11]；而正常的心臟中無IL-6表達(dá)，當(dāng)CHF發(fā)生時(shí)，心肌細(xì)胞可以產(chǎn)生IL-6，直接損傷心肌細(xì)胞并通過IL-6-GP130-STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大，同時(shí)慢性心力衰竭病人體內(nèi)IL-6的升高刺激機(jī)體中性粒細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)，中性粒細(xì)胞的黏附及內(nèi)皮遷移造成對心肌的浸潤及損傷[12]。因此，Th17細(xì)胞分化和免疫功能的調(diào)控研究具有重要的基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究觀察不同心功能分級的慢性心力衰竭病人及對照者外周血CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞的表達(dá)頻率及表達(dá)水平，real-time PCR檢測外周血單核細(xì)胞中IL-6、IL-23、IL-17、RORγt基因表達(dá)變化，推斷出Th17、IL-17等在慢性心力衰竭中可能起到的作用。慢性心力衰竭病人CD4+IL-17+ Th17細(xì)胞百分率、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt和IL-6、IL-23、IL-17基因表達(dá)水平均明顯高于健康對照組(P<0.05)；慢性心力衰竭心功能Ⅲ級～Ⅳ級病人Th17細(xì)胞百分率以及RORγt、IL-6、IL-23、IL-17基因表達(dá)水平均較心功能分級為Ⅰ級～Ⅱ級病人顯著升高(P<0.01)。提示，慢性心力衰竭病人大量Th17細(xì)胞被活化，通過分泌IL-6、IL-17、IL-23來招募中性粒細(xì)胞等參與心臟炎癥過程，進(jìn)一步加重心力衰竭，提示Th17可能是導(dǎo)致慢性心力衰竭的一個(gè)因素。Lichtman[10]在慢性心力衰竭病人外周血中的Treg/Th17表達(dá)不平衡研究中發(fā)現(xiàn)，病人外周血的Th17細(xì)胞明顯增加，與本研究結(jié)果一致，CHF的疾病進(jìn)程與機(jī)體的炎癥過程密切相關(guān)，這提示糾正Th17細(xì)胞的功能失調(diào)可能會對CHF的防治起到積極作用。

慢性心力衰竭的發(fā)病機(jī)制與Th17細(xì)胞功能失調(diào)密切相關(guān)。盡管對CHF的Th17細(xì)胞研究已經(jīng)引起了廣泛的關(guān)注，并取得了一定進(jìn)展，但Th17細(xì)胞與CHF之間的相互關(guān)系及其具體機(jī)制，將有待于增加樣本量，進(jìn)一步擴(kuò)大研究，為指導(dǎo)臨床治療提供參考。

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Significance of Peripheral Th17 Cells Function in Patients with Chronic Heart Failure

Gulixian·Yusufu

Hospital of Xinjiang Traditional Uyghur Medicine，Urumqi 811601，Xinjiang，China

Objective To investigate the expression of the peripheral blood CD4+interleukin (IL)-17+ T helper cell 17 (Th17) cells and IL-6，IL-23，IL-17，ROR gamma t (RORγt)，and its relationship with the progression of chronic heart failure (CHF).Methods Sixty patients with CHF were selected in our hospital from January 2013 to June 2013.Thirty healthy individuals were as controls in the same period.The levels of CD4+IL-17+Th17 cells in peripheral blood were detected by flow cytometry. The levels of IL-6，IL-23，IL-17，RORγt gene expression in peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were detected by real-time PCR. Results The percentage of CD4+IL-17 +Th17 cells，Th17 cell-specific transcription factors RORγt and IL-6，IL-23 and IL-17 in patients with CHF were significantly higher than those in healthy controls.The percentage of CD4+IL-17 +Th17 cells，Th17 cell-specific transcription factors RORγt and IL-6，IL-23 and IL-17 in CHF patients with New York Heart Association (NYHA) functional classification Ⅲ-Ⅳ were significantly higher than those in CHF patients with NYHA Ⅰ-Ⅱ(all P<0.01). Conclusion The expression of Th17 cells and their function-related cytokines in patients with CHF is positively correlated with the progression of the disease in elderly patients with CHF.The expression of Th17 was the higher in patients with severe heart failure.Therefore，the inhibition of the expression of Th17 cells and their function-related cytokines is an important treatment for patients with CHF.

chronic heart failure；T helper cell 17；interleukin-17；ROR gamma t；interleukin-6；interleukin-23

R541.6 R256.2

B

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.22.023

1672-1349(2017)22-2877-04

新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院(烏魯木齊 811601)，E-mail：gtuirebhdsfgb@163.com

信息：古麗仙·玉素甫.慢性心力衰竭病人外周Th17細(xì)胞功能檢測的臨床意義[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(22)：2877-2880.

2017-05-16)

(本文編輯 郭懷印)