DEAB促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)其對(duì)ADM敏感性的機(jī)制研究

張 俊 薛新波 申 銘 鄭建偉 肖朝文

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院肝膽胰外科，湖北 武漢 430014)

DEAB促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)其對(duì)ADM敏感性的機(jī)制研究

張 俊1，2薛新波1申 銘1鄭建偉1肖朝文2

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院膽胰外科，湖北 武漢 430030；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院肝膽胰外科，湖北 武漢 430014)

目的 探討ALDH抑制劑DEAB致肝癌細(xì)胞凋亡及增強(qiáng)其對(duì)ADM化療敏感性的具體機(jī)制。方法 通過(guò)DEAB干預(yù)肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系L02以及與經(jīng)ADM處理的HepG2和L02細(xì)胞。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中活性氧(ROS)的表達(dá)變化及Annexin-V和PI雙染后細(xì)胞凋亡量的變化。通過(guò)Realtime PCR及western blot方法檢測(cè)各組細(xì)胞中Bcl-2、Bax、ALDH1以及MDR1基因和蛋白的變化。結(jié)果 DEAB干預(yù)HepG2細(xì)胞后，致使其ROS表達(dá)增強(qiáng)、凋亡量增加，ALDH1基因和蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，Bcl-2、MDR1基因和蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax基因和蛋白表達(dá)上調(diào)。正常肝細(xì)胞系L02無(wú)以上變化。結(jié)論 抑制ALDH可致肝癌細(xì)胞系HepG2凋亡，并增強(qiáng)其對(duì)ADM的化療敏感性。而對(duì)正常肝細(xì)胞系L02無(wú)此作用。

DEAB；ROS；線(xiàn)粒體凋亡；肝癌；化療；ALDH

原發(fā)性肝癌治療效果不理想,其容易發(fā)生化療耐藥、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，為臨床診治造成許多困難。本課題組圍繞肝癌的基因治療已經(jīng)進(jìn)行了許多研究。ALDH是線(xiàn)粒體中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，可以有效清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)及其副產(chǎn)物，抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡。并且能惰性化化療藥物，使得腫瘤細(xì)胞對(duì)于其耐藥。因此，將ALDH作為治療靶點(diǎn)，有希望誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療耐藥，提高患者生存率。

本研究通過(guò)ALDH特異性抑制劑DEAB轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞后，研究其致肝癌細(xì)胞凋亡和增強(qiáng)肝癌細(xì)胞對(duì)ADM的敏感性的機(jī)制，以及ALDH作為治療靶點(diǎn)在其中的作用，為肝癌的基因治療提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞 肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系L02由本課題組保存。

1.1.2主要試劑 OS檢測(cè)試劑盒，Annexin-V和PI凋亡檢測(cè)試劑盒， Realtime PCR Master Mix(日本TOYOBO公司)，β-actin、Bcl-2、Bax、ALDH1、 MDR1一抗(美國(guó)santa cruz公司)，ECL試劑盒。

1.2方法

通過(guò)ROS檢測(cè)確定DEAB濃度：將DEAB分別按10-6mol/l ，5×10-6mol/l，10-5mol/l，5×10-5mol/l，10-4mol/l五個(gè)濃度加入培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞中，檢測(cè)其ROS的產(chǎn)量，挑選最合適的濃度。

將肝癌細(xì)胞系HepG2和正常肝細(xì)胞系L02分別分為四組：對(duì)照組，DEAB組，ADM組，DEAB+ADM組。各組藥物和病毒用量如下：對(duì)照組加入PBS，ADM組和DEAB+ADM組中阿霉素濃度為1.5 mg/L，DEAB組和DEAB+ADM組中DEAB濃度為5×10-6mol/l，處理時(shí)間為48 h。進(jìn)行ROS檢測(cè)、凋亡檢測(cè)、realtime PCR檢測(cè)、Western blot 實(shí)驗(yàn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1五組不同濃度的DEAB作用于HepG2細(xì)胞，流式檢測(cè)其ROS產(chǎn)量，三次重復(fù)，5×10-6mol/l處為活性氧產(chǎn)量拐點(diǎn)，因此是最適的濃度。

各組細(xì)胞ROS檢測(cè)表明：ADM，DEAB，以及聯(lián)用ADM+DEAB均能刺激細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增加，給予細(xì)胞線(xiàn)粒體凋亡途徑的啟動(dòng)刺激，其中聯(lián)用ADM+DEAB組效果最明顯，各組結(jié)果的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表 1。

2.2各組的凋亡檢測(cè)結(jié)果表明ADM，DEAB，以及聯(lián)用ADM+DEAB均能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡量依次增加，ADM+DEAB組效果最明顯，見(jiàn)表2。

表1 各組細(xì)胞ROS檢測(cè)

表2 各組的凋亡檢測(cè)結(jié)果

Realtime PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，DEAB對(duì)ALDH1基因表達(dá)無(wú)明顯影響，作用于肝癌細(xì)胞后，使得Bcl-2和MDR1基因表達(dá)下調(diào)，Bax基因表達(dá)上調(diào)。而聯(lián)合用藥組效果最明顯。L02組則無(wú)此效果。

Western blot 結(jié)果表明：DEAB對(duì)ALDH1蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，抑制ALDH功能后，使得Bcl-2和MDR1蛋白表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)。而聯(lián)合用藥組效果最明顯。

圖1 Western blot 結(jié)果

3 討 論

乙醛脫氫酶(Aldehyde dehydrogenase, ALDH)是細(xì)胞內(nèi)一種重要的抗氧化酶，作用主要是將乙醇代謝途徑中產(chǎn)生的乙醛氧化成乙酸，最后分解為二氧化碳和水。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)ALDH活性與腫瘤有關(guān)，如在肝癌及其他許多人類(lèi)腫瘤的致瘤過(guò)程中，ALDH活性被有所改變[1]。ALDH作為線(xiàn)粒體中調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵酶，可以有效清除活性氧(reactive oxygen species, ROS)及其副產(chǎn)物，抑制氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡，其抑制凋亡作用與Bcl-2蛋白家族的表達(dá)密切相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，采用DEAB抑制ALDH的作用后，肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)量增加，ALDH不能起到有效的清除作用，從而啟動(dòng)了肝癌細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡增加，而在正常肝細(xì)胞中效果不明顯。

在本研究中，我們還發(fā)現(xiàn)抑制ALDH后，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax表達(dá)上調(diào)。這表明作為線(xiàn)粒體凋亡途徑中的關(guān)鍵因子，Bcl-2和Bax的表達(dá)與活性氧的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。各種促凋亡信號(hào)引起細(xì)胞內(nèi)源性或外源性活性氧升高產(chǎn)生氧化應(yīng)激而啟動(dòng)凋亡。多項(xiàng)研究表明在腫瘤細(xì)胞中的活性氧基礎(chǔ)水平高于正常細(xì)胞[2]，因而腫瘤細(xì)胞中活性氧誘導(dǎo)劑更容易打破氧化還原的平衡而產(chǎn)生氧化應(yīng)激。

蛋白組研究發(fā)現(xiàn)肺癌細(xì)胞對(duì)阿霉素(adriamycin，ADM)的耐藥性與ALDH表達(dá)水平正相關(guān)[3]。阿霉素(ADM)是肝癌治療中常用的一種化療藥物，肝癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的的耐受性是化療效果不理想的主要原因。細(xì)胞中MDR-1基因的表達(dá)，可使細(xì)胞膜上的P-糖蛋白(P-gP)過(guò)度表達(dá)，通過(guò)其藥物泵的作用將藥物排出細(xì)胞外，使得胞內(nèi)的藥物濃度下降，是導(dǎo)致MDR的主要原因之一[4]。所以降低P-gP的表達(dá)水平，可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性。本研究的結(jié)果運(yùn)用DEAB顯示抑制ALDH的功能可以顯著抑制MDR1基因的及其蛋白表達(dá)，而聯(lián)合應(yīng)用DEAB和ADM其效果顯著提高。

綜上所述，ALDH通過(guò)抗ROS的氧化應(yīng)激而抑制肝癌干細(xì)胞凋亡及導(dǎo)致其化療耐藥。ALDH是肝癌的理想的治療靶點(diǎn)，可以誘導(dǎo)肝癌干細(xì)胞凋亡，逆轉(zhuǎn)化療耐藥，從而獲得更好的療效。

[1] Magni M,Shammah S,Schiro R,et al. Induction of cyclophosphamide-resistance by aldehyde-dehydrogenase gene transfer[J]. Blood, 1996.87:1097-1103.

[2] Morebj S, Schweder M, Suresh A, et al. Overexpression of the human aldehyde dehydrogenase class I results in increased resistance to 4-hydroperoxycyclophosphamide[J]. Cancer Gene Ther, 1996, 3(1): 24-30.

[3] Keenan J, Murphy L, Henry M, et al. Proteomic analysis of multidrug-resistance mechanisms in adriamycin-resistant variants of DLKP, a squamous lung cancer cell line[J]. Proteomics, 2009, 9(6): 1556-1566.

[4] Perugorria MJ，Castillo J，Latasa MU，et al．Wilms'tumor 1 gene expression in hepatocellular carcinoma promotes cell dedifferentiation and resistance to chemotherapy[J]．Cancer Res，2009，69：1358-1367．

Research on the Mechanisms of the DEAB induced Apoptosis and chemotherapy sensitivity enhancement of ADM in hepatoma carcinoma cells

ZHANGJun1,2XUEXin-bo1SHENMing1ZhengJianwei1YuYuan3XIAOChao-wen2

(1.Dept.ofPancreaticSurgery,TongjiHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030China;2.Dept.ofHepatobiliaryandPancreaticSurgery,WuhanCentralHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430014,China)

Objective: To investigate the mechanisms of the DEAB (ALDH inhibitor) induced apoptosis and chemotherapy sensitivity enhancement of ADM in hepatoma carcinoma cells. Methods: We interposed the HepG2 cells、normal liver cell line L02 and HepG2、L02 cells were treated by ADM with DEAB. Changes of expression of reactive oxygen species (ROS) and apoptosis were detected by flow cytometry in the each group. Changes in gene and protein level of ALDH1, Bcl-2 and of Bax and MDR1 were detected by Realtime PCR and western blot. Results: The function of ALDH were inhibited in HepG2 cells, resulting in increased expression of ROS and apoptosis; expression of Bcl-2 and MDR-1 gene and protein were down regulation; expression of Bax gene and protein was up regulation; there were no such changes in the normal liver cell line L02.Conclusion: The apoptosis of HepG2 cells was induced and the ADM sensitivity to chemotherapy was enhanced by the inhibition of ALDH, but there was no effect in the normal liver cell line L02.

DEAB; ROS; mitochondrial apoptosis; liver cancer; chemotherapy; ALDH

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院博士科研基金(YB13B01)；武漢市衛(wèi)生計(jì)生委科研基金(WX14D07)。

張俊(1984—)，男，湖北黃岡人，醫(yī)師，博士，主要研究方向：肝膽胰腫瘤。

R735.7

A

1004-7115(2017)12-1328-03

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.12.003

2017-08-28)