酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)乙型肝炎表面抗原陰性獻(xiàn)血者核酸篩查及降低輸血傳播乙型肝炎病毒效果分析

馬艷華

（河南省周口市中心血站，河南 周口 466000）

·經(jīng)驗(yàn)交流·

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)對(duì)乙型肝炎表面抗原陰性獻(xiàn)血者核酸篩查及降低輸血傳播乙型肝炎病毒效果分析

馬艷華

（河南省周口市中心血站，河南 周口 466000）

目的了解本地區(qū)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測(cè)乙肝表面抗原（HBsAg）結(jié)果呈陰性獻(xiàn)血者經(jīng)核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT）復(fù)檢情況及對(duì)降低輸血傳播乙型肝炎病毒（HBV）的效果。方法應(yīng)用兩種不同廠家ELISA檢測(cè)試劑對(duì)36 459 例獻(xiàn)血者標(biāo)本進(jìn)行HBsAg篩查，ELISA檢測(cè)結(jié)果呈陰性標(biāo)本應(yīng)用上海浩源血液篩查系統(tǒng)行核酸檢測(cè)，對(duì)NAT結(jié)果為陽性的標(biāo)本行乙肝兩對(duì)半檢測(cè)。結(jié)果采用ELISA法檢測(cè)36 459例標(biāo)本中，HBsAg陽性112例；36 347例陰性樣本經(jīng)NAT檢測(cè)，檢出陽性39例，陽性檢出率為0.11%；39例陽性患者中成功隨訪9例，其中乙型肝炎窗口期感染2例，隱匿性感染7例。結(jié)論血站應(yīng)用ELISA聯(lián)合NAT開展血液篩查檢測(cè),能有效降低HBV經(jīng)輸血傳播的風(fēng)險(xiǎn)，提高血液安全性。

無償獻(xiàn)血者；NAT檢測(cè)；HBV-DNA；血液篩查

乙型肝炎及乙肝病毒攜帶者在我國(guó)廣泛流行，嚴(yán)重危害人民健康，且感染率較高，我國(guó)屬于乙肝高發(fā)區(qū)。90年代初我國(guó)已將新生兒乙肝疫苗接種納入計(jì)劃免疫及無償獻(xiàn)血制度等綜合措施中，人群中乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBsAg）的流行率大幅下降[1]，但輸血感染乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）也不容忽視。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzymelinked immunosorbent assay,ELISA）檢測(cè)存在一定局限性，核酸檢測(cè)技術(shù)（nucleic acid testing,NAT）具有高度的敏感性和特異性，可明顯縮短病毒檢測(cè)窗口期，提高血液安全性[2]。本文對(duì)36 347例ELISA篩查結(jié)果呈陰性標(biāo)本再進(jìn)行NAT檢測(cè)，具體內(nèi)容報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

選取河南省周口市中心血站2016年1月1 日‐2017年2月30日采集的無償獻(xiàn)血者標(biāo)本36 459例為研究對(duì)象，其中，男17 995例，女18 464例；年齡18～55歲，中位年齡31.46歲。所有獻(xiàn)血者符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》，檢查項(xiàng)目均經(jīng)本站倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，獻(xiàn)血者均簽署自愿獻(xiàn)血協(xié)議。

1.2 試劑與儀器

HBsAg ELISA初檢、復(fù)檢試劑分別由珠海麗珠生物科技有限公司、上海科華生物技術(shù)有限公司提供，HBV/HCV/HIV三聯(lián)合核酸提取試劑和檢測(cè)試劑由上海浩源診斷公司提供。HBsAg ELISA陽性質(zhì)控物、NAT檢測(cè)均由康徹思坦生物技術(shù)有限公司提供提供，HBsAg濃度為0.5 IU/ml，乙肝病毒的脫氧核糖核酸（HBV-DNA）靶值為2.3 IU/ ml，質(zhì)控物和檢測(cè)試劑均批檢合格并在有效期內(nèi)使用；費(fèi)米（FAMA）全自動(dòng)酶免分析檢測(cè)系統(tǒng)，由瑞士哈密爾頓公司生產(chǎn)；ChiTas 1200核酸血液篩查系統(tǒng)由上海浩源生物科技有限公司提供。所有檢測(cè)設(shè)備均能良好運(yùn)行，并且廠家校驗(yàn)均合格。

1.3 方法

1.3.1 ELISA檢測(cè) 所有無償獻(xiàn)血者的標(biāo)本均使用兩種不同廠家的ELISA試劑檢測(cè)，每批實(shí)驗(yàn)需有空白對(duì)照孔、陰性對(duì)照孔、陽性對(duì)照孔和室內(nèi)質(zhì)控孔完成HBsAg檢測(cè)；ELISA法檢測(cè)以樣本孔吸光度值/臨界值（S/CO）比值判定檢測(cè)結(jié)果，S/ CO≥1.0為陽性，0.7≤S/CO＜1.0為灰區(qū)，S/ CO＜0.7為陰性。

1.3.2 核酸檢測(cè)技術(shù)（NAT）每8個(gè)標(biāo)本混為一個(gè)混樣池，且均設(shè)定內(nèi)標(biāo)對(duì)照，將混樣所測(cè)定陰性為陰性結(jié)果，將混樣所測(cè)定陽性予以拆分檢測(cè)，拆分后陰性者判為陰性結(jié)果，拆分后陽性者判為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 兩種檢測(cè)方法對(duì)研究對(duì)象檢測(cè)結(jié)果顯示

36 459例無償獻(xiàn)血者經(jīng)過ELISA篩查，HBsAg陽性樣本112例，陽性率為0.31%；ELISA篩查HBsAg呈陰性的36 347例樣本中，經(jīng)NAT檢測(cè)，39例呈陽性，陽性率為0.11%。見表1。

2.2 HBV-DNA陽性標(biāo)本乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果

39例HBV-DNA陽性的標(biāo)本進(jìn)行乙型肝炎病毒兩對(duì)半的ELISA檢測(cè)，結(jié)果顯示，抗-HBc（+）27例（69.23%）；抗-HBe（+）12例（30.77%）；抗-HBc和抗-Hbe同時(shí)陽性9例（23.08%）；全陰性5例（12.82%）。見表2。

2.3 隨訪結(jié)果

39例HBV核酸陽性的無償獻(xiàn)血者中，9位獻(xiàn)血者在獻(xiàn)血3個(gè)月后進(jìn)行隨訪，9例全為HBVDNA陽性，其中5例ELISA乙肝兩對(duì)半全陰性標(biāo)本中檢測(cè)出HBV-DNA陽性2例，證明9例NAT檢測(cè)HBV-DNA陽性標(biāo)本中2例為窗口期感染，7 例為隱匿性感染。

表1 兩種檢測(cè)方法對(duì)研究對(duì)象檢測(cè)結(jié)果顯示

表2 HBsAg陽性HBV-DNA陽性乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果

3 討論

乙型肝炎是一種嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，由于影響因素居多，目前尚未發(fā)現(xiàn)有效的治愈方法。血液及血液制品感染是乙肝病毒感染的主要途徑之一，雖然HBsAg ELISA試劑盒檢測(cè)技術(shù)不斷改進(jìn)，且血站對(duì)HBsAg采用不同廠家兩種試劑進(jìn)行檢測(cè)，可將輸血感染乙肝的風(fēng)險(xiǎn)降到較低水平，但乙肝病毒感染窗口期血樣因ELISA無法檢出而造成漏檢，NAT具有較高的靈敏度和特異性，可檢出血液中較低水平的HBV感染，采用NAT可將窗口期縮短至20天[3]，因此，血站開展血液HBV NAT檢測(cè)尤為必要。NAT和ELISA檢測(cè)在方法學(xué)和臨床血液安全上各具特色，兩種技術(shù)存在良好的互補(bǔ)性[4]。NAT的主要原理是使用物理、化學(xué)和生物學(xué)方法，通過靶核酸直接擴(kuò)增或其附帶信號(hào)擴(kuò)增的方法，讓極微量的核酸變成直觀的光電或可視信號(hào)，從而判斷標(biāo)本中是否存在相應(yīng)的病原體，包括核酸提取、擴(kuò)增和檢測(cè)。

目前，磁珠（免疫磁珠）法是較常用方法，它是一種新型的免疫學(xué)技術(shù)，在免疫學(xué)檢驗(yàn)、細(xì)胞分離以及核酸提取等方面應(yīng)用較為廣泛。該方法操作簡(jiǎn)便、易于自動(dòng)化，對(duì)核酸標(biāo)本的回收率較高及純度較好等優(yōu)勢(shì)[5]。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種靈敏度高并且適用于大批量標(biāo)本篩查的核酸擴(kuò)增技術(shù)，其主要原理為，變性--退火--延伸3步驟，即按照模板DNA序列，在DNA聚合酶的催化下，用4種dNTP來合成與模板DNA完全相同的拷貝，從而在多種DNA分子混合物中特異擴(kuò)增某一特定的DNA片段[6]。

我國(guó)是乙肝高發(fā)區(qū)，研究發(fā)現(xiàn)HBV血清轉(zhuǎn)換前窗口期（window phase,WP）與隱匿性乙肝病毒感染（occult hepatitis B virus infection,OBI）獻(xiàn)血者是導(dǎo)致HBsAg篩查后輸血傳播感染HBV殘余風(fēng)險(xiǎn)的主要原因[7]。HBV WP與OBI感染的獻(xiàn)血者均為血清HBsAg陰性、HBV-DNA陽性；HBV WP獻(xiàn)血者HBsAg會(huì)隨著時(shí)間推移由陰性轉(zhuǎn)換為陽性，而OBI獻(xiàn)血者其HBsAg一般不會(huì)轉(zhuǎn)換為陽性，通常伴隨抗-HBc陽性，有的在低滴度抗-HBs獻(xiàn)血者中也會(huì)存在[8]。

本研究中，對(duì)36 347例兩遍ELISA檢測(cè)HBsAg陰性的標(biāo)本中，使用上海浩源ChiTas 1200核酸檢測(cè)技術(shù)篩查出39例（0.11%）HBV-DNA陽性，即本地區(qū)無償獻(xiàn)血者經(jīng)ELISA初篩HBsAg后HBV的殘余風(fēng)險(xiǎn)為0.11%，高于文獻(xiàn)報(bào)道蘇州地區(qū)的0.058%[9]、廈門地區(qū)的0.09%[10]。提示本地區(qū)經(jīng)過ELISA初篩HBsAg后輸血傳播HBV的風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)引起足夠重視，NAT對(duì)于確保輸血安全，降低經(jīng)血液傳播HBV的殘余風(fēng)險(xiǎn)具有積極意義。

此外，本文表2乙肝兩對(duì)半檢測(cè)結(jié)果顯示，39例HBV-DNA陽性標(biāo)本存在HBsAb、HBeAb、HBcAb單項(xiàng)或合并陽性，其中抗-HBc陽性率最高（69.23%），表明患者輸注這部分獻(xiàn)血者捐獻(xiàn)的血液存在感染HBV風(fēng)險(xiǎn)。本文結(jié)果表明，隱匿性感染是導(dǎo)致獻(xiàn)血者經(jīng)血傳播HBV的重要因素，病毒變異引起的隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）占有大部分，由隱匿性感染獻(xiàn)血者提供血液傳播HBV風(fēng)險(xiǎn)是窗口期的18.5倍（37/2）。OBI與HBV基因變異、病毒復(fù)制、表達(dá)水平過低或宿主免疫力方面等因素有關(guān)[10]。研究顯示，多數(shù)OBI感染者血循環(huán)中HBV-DNA的拷貝數(shù)較低，一般小于105 copies/ml，OBI可有多種臨床形式，可以是肝功能正常、HBsAg陰性的健康人，也可以在慢性HBV感染者自發(fā)或使用抗病毒藥物后出現(xiàn)[9]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在無償獻(xiàn)血者人群中存在HBsAg和HBeAg陰性而抗-HBc陽性的模式，說明其HBV的漏檢不是免疫窗口期所致，可能是HBVS基因變異導(dǎo)致HBV低水平的復(fù)制，也可能是HBsAg陰性的隱匿性乙型肝炎感染[11]，因此，對(duì)乙型肝炎隱匿性感染的獻(xiàn)血者更應(yīng)給予足夠重視。

綜上所述，對(duì)于開展核酸檢測(cè)技術(shù)的血站，在常規(guī)進(jìn)行ELISA以及不斷提高血清學(xué)試劑盒靈敏度的同時(shí)，采用ELISA結(jié)合NAT篩查血液，能有效降低HBV經(jīng)輸血傳播的風(fēng)險(xiǎn)，提高血液安全 性。

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10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.013

2017-07-28

（劉東京 編輯）