增強(qiáng)型胸苷激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其殺傷性的研究進(jìn)展

宋秋靈

（山東省菏澤市立醫(yī)院 耳鼻喉科，山東 菏澤 274000）

增強(qiáng)型胸苷激酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其殺傷性的研究進(jìn)展

宋秋靈

（山東省菏澤市立醫(yī)院 耳鼻喉科，山東 菏澤 274000）

目的探討人端粒酶催化亞單位（hTERT）啟動(dòng)子及巨細(xì)胞病毒原核（CMV）增強(qiáng)子聯(lián)合調(diào)控胸苷激酶基因增強(qiáng)型表達(dá)載體的改良構(gòu)建及其在殺傷鼻咽癌細(xì)胞中的效應(yīng)與安全性評(píng)價(jià)。方法對(duì)鏈接hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子、胸苷激酶基因進(jìn)行酶切（模板為pGL3空載體），以構(gòu)建增強(qiáng)型表達(dá)載體；選取hTERT啟動(dòng)子單調(diào)控胸苷激酶基因的表達(dá)載體作為對(duì)照組。另選用人鼻咽癌細(xì)胞（端粒酶陽(yáng)性，實(shí)驗(yàn)組）、人乳腺癌細(xì)胞（對(duì)照組）及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（端粒酶陰性）為標(biāo)本，分別對(duì)其采用熒光顯微鏡觀察熒光蛋白表達(dá)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)胸苷激酶基因mRNA的表達(dá)、Telochaser法檢測(cè)細(xì)胞端粒酶活性，同時(shí)分析鼻咽癌細(xì)胞增殖及抑制受增強(qiáng)型載體的影響作用。結(jié)果hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子對(duì)胸苷激酶基因的增強(qiáng)型表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控，可以成功改良構(gòu)建；通過(guò)熒光顯微鏡下觀察顯示人鼻咽癌細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞均有熒光表達(dá)，但后者較前者在表達(dá)數(shù)量及強(qiáng)度方面有所加強(qiáng)，且對(duì)照組的人乳腺癌細(xì)胞亦有熒光表達(dá)存在，但ECV-304細(xì)胞無(wú)熒光表達(dá)。在PCR定量檢測(cè)方面，結(jié)果顯示增強(qiáng)型載體組（實(shí)驗(yàn)組）的胸苷激酶基因mRNA的表達(dá)量顯著強(qiáng)于對(duì)照組的單啟動(dòng)載體（P ＜0.05）。在細(xì)胞端粒酶活性方面，ECV-304細(xì)胞為陰性，腫瘤細(xì)胞端粒酶活性均為陽(yáng)性。四甲基偶氮唑藍(lán)（MMT）檢測(cè)結(jié)果顯示，增強(qiáng)型載體組可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖，其細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低（P ＜0.05）。動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示改良重建的增強(qiáng)型載體對(duì)裸鼠鼻咽癌移植瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用（抑瘤率為56.5%），顯著高于單啟動(dòng)子載體組（抑瘤率為43.3%）（P ＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與其他對(duì)照組抑瘤率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝腎病理檢查顯示，肝、腎組織結(jié)構(gòu)正常，均無(wú)明顯損害。結(jié)論以hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子對(duì)胸苷激酶基因的增強(qiáng)型表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控，成功改良構(gòu)建后能夠靶向及高效地殺傷鼻咽癌細(xì)胞及體外移植瘤，且應(yīng)用后在動(dòng)物模型體內(nèi)未見明顯的毒副反應(yīng)。

鼻咽癌；胸苷激酶基因；端粒酶；巨細(xì)胞病毒原核

腫瘤的靶向基因治療是當(dāng)今腫瘤治療研究的熱點(diǎn)與難點(diǎn)，也是日后腫瘤治療研究尤其是基因治療研究的主導(dǎo)方向。從當(dāng)前的腫瘤基因靶向治療原則出發(fā)，治療時(shí)采用理想型的腫瘤靶向治療載體應(yīng)當(dāng)具備殺瘤細(xì)胞作用強(qiáng)及靶向性高的特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)外的實(shí)驗(yàn)研究及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道指出[1-2]，以人端粒酶催化亞單位（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）作為單啟動(dòng)子來(lái)調(diào)控胸苷激酶基因（thymidine kinase,TK）的腫瘤特異表達(dá)系統(tǒng)，能夠在體外特異性殺傷鼻咽癌細(xì)胞及體內(nèi)抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)，且對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物無(wú)明顯毒副作用。這一結(jié)果顯示出了hTERT/TK/pGL3載體系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)，但是筆者在實(shí)驗(yàn)中及文獻(xiàn)報(bào)道中發(fā)現(xiàn)，hTERT啟動(dòng)子調(diào)控TK基因的靶向載體雖然具有較好的靶向性，但其殺傷腫瘤細(xì)胞的效應(yīng)要比巨細(xì)胞病毒原核（cytomegalovirus,CMV）增強(qiáng)子調(diào)控TK基因的非靶向性載體明顯偏弱，即hTERT/TK/pGL3載體系統(tǒng)存在對(duì)腫瘤細(xì)胞殺傷力不強(qiáng)的缺點(diǎn)。為此，筆者在實(shí)驗(yàn)中嘗試對(duì)原有載體系統(tǒng)（hTERT/TK/pGL3）進(jìn)行改良重建，在保證載體具有良好靶向性的前提下，引入一個(gè)CMV增強(qiáng)子，即hTERT/CMV雙調(diào)控TK基因的增強(qiáng)型靶向表達(dá)載體，以從理論上彌補(bǔ)原有靶向載體系統(tǒng)的不足。因此，為進(jìn)一步探討這種改良后的增強(qiáng)型載體系統(tǒng)的腫瘤系統(tǒng)殺傷效應(yīng)，開展本研究。本研究中為能方便地檢測(cè)胸苷激酶基因的載體轉(zhuǎn)染率及蛋白表達(dá)率，將綠色熒光報(bào)告基因EGFP連接入改良重建后的增強(qiáng)型表達(dá)載體中，即胸苷激酶基因與EGFP基因融合表達(dá)（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）?，F(xiàn)將本研究綜合報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般材料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：人鼻咽癌5-8F細(xì)胞、人血管內(nèi)皮細(xì)胞ECV-304和乳腺癌BT474細(xì)胞（均由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）。

實(shí)驗(yàn)質(zhì)粒：pGL3.Basic.EGFP-TK-hTERTp-CMV、pGL3-basic-EGFP-TK-hTERTp和 pGL3.basic（均由深圳大學(xué)醫(yī)學(xué)院納米磁實(shí)驗(yàn)室提供）。

實(shí)驗(yàn)試劑：RNA提取試劑Trizol（Invitrogen）、更昔洛韋（GCV,ROCH）；Boyden小室（Chemicon）；四甲基偶氮唑藍(lán)（Sigma 美國(guó)）；端粒酶活性檢測(cè)試劑盒（上海賢綿生物科技有限公司）；脂質(zhì)體Lipofectamine 2000（上海素爾生物科技有限公司）；胸苷激酶基因、hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) （polymerase chain reaction,PCR）引物（由上海英駿公司合成）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：5～6周齡的健康SPF級(jí)裸鼠（BALB/cnu/nu），雌雄不限，體重16～25 g（來(lái)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）。

實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備廠）、熒光顯微鏡（NIKON ECLIPSE E2000，日本尼康）、電子分析天平（湖南湘儀天平廠）、恒溫箱（GRANT，德國(guó)）和培養(yǎng)板（Corning，美國(guó)）。

增強(qiáng)型靶向載體的改良構(gòu)建：①分析pEGFP-N1質(zhì)粒信息后發(fā)現(xiàn)，在EGFP基因編碼序列中，pGL3載體上的luc基因(熒光素酶)可通過(guò)Hind III和Xba I置換掉；而CMV增強(qiáng)子序列則可以通過(guò)BamH I和Sal I酶切位點(diǎn)將其連接入pGL3-basic中。②分析NCB I上已經(jīng)提交的胸苷激酶基因序列，發(fā)現(xiàn)胸苷激酶基因可以通過(guò)XhoI和Hind III酶切位點(diǎn)插入，同時(shí)對(duì)NCB I上的hTERT基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，hTERT基因啟動(dòng)子序列（hTERTp）可通過(guò)KpnI和XhoI酶切位點(diǎn)插入。這樣就可以使胸苷激酶基因與EGFP基因完全融合。③以pEGFP-N1質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出CMV及EGFP基因序列，分別構(gòu)建出pGL3-CMV載體及pGL3-GFP載體。以pMDl8-T-hTERTp質(zhì)粒為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增出胸苷激酶基因及hTERT基因啟動(dòng)子序列，分別構(gòu)建出pGL3-TK載體及pGL3-hTERTp載體。④分別對(duì)新構(gòu)建出的載體進(jìn)行酶切，分別酶切下CMV增強(qiáng)子基因片段及胸苷激酶基因、hTERTp基因，分別連接入pGL3-EGFP載體中從而得到單啟動(dòng)子載體（pGL3-EGFP-TK-hTERTp）及增強(qiáng)型載體（pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV）。

1.2 方法

1.2.1 熒光蛋白表達(dá)分析及熒光定量PCR檢測(cè)基因mRNA的表達(dá)水平 常規(guī)培養(yǎng)人鼻咽癌細(xì)胞、人乳腺癌細(xì)胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，用Lipo2000轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGL3-EGFP-TK-hTERTp、pGL3-EGFP及 pGL3-EGFP-TK-hTERTp-CMV，每孔DNA用量、細(xì)胞數(shù)均保持一致。轉(zhuǎn)染24 h后，在熒光顯微鏡下直接觀察EGFP的表達(dá)差異；48 h后用熒光定量PCR檢測(cè)胸苷激酶基因mRNA的表達(dá)水平。檢測(cè)結(jié)束后，計(jì)算各組A值，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)。

1.2.2 端粒酶的活性檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人鼻咽癌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞及正常人臍靜脈內(nèi)皮ECV-304細(xì)胞接種到6孔培養(yǎng)板中，每種細(xì)胞1孔（1、2、3），采用TeloChaser法對(duì)3孔細(xì)胞進(jìn)行端粒酶活性檢測(cè)。

1.2.3 Boyden小室試驗(yàn) ①將Matrigel用4℃的無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋（終濃度為0.8 g/L），使得每個(gè)Boyden小室含有100 μl溶液含量，分3次涂在Transwell的聚碳酸酯膜上，在4℃環(huán)境下風(fēng)干。②取實(shí)驗(yàn)組轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型載體加GCV預(yù)處理48 h后的人鼻咽癌細(xì)胞和對(duì)照組(未做任何處理)人鼻咽癌細(xì)胞加入上室（依據(jù)細(xì)胞數(shù)1×105/200 μl的比例），另取含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基500 μl加入下室，孵育24 h。③用棉簽將膜上未侵襲的細(xì)胞以及人工基底膜膠擦凈，進(jìn)行下室面固定，而后進(jìn)行結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下觀察每張膜的任意5個(gè)視野，每組設(shè)3個(gè)平行樣本。④觀察400倍顯微鏡視野下的穿膜細(xì)胞數(shù)，取其平均值，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium,MTT）實(shí)驗(yàn)分析 ①將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)的人鼻咽癌細(xì)胞接種到細(xì)胞培養(yǎng)板中（96孔，1×105/孔），設(shè)置6個(gè)復(fù)孔；②接種12 h后對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)板中的人鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)共設(shè)立5組（分別為對(duì)照組A：細(xì)胞無(wú)處理；對(duì)照組B：空載體+GCV；對(duì)照組C：?jiǎn)螁?dòng)子載體+GCV；對(duì)照組D：增強(qiáng)型載體無(wú)GCV；實(shí)驗(yàn)組：增強(qiáng)型載體+GCV）；③轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)72 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)；④計(jì)算分析相關(guān)數(shù)據(jù)：首先計(jì)算細(xì)胞存活率，而后計(jì)算相對(duì)細(xì)胞存活率，最終結(jié)果以相對(duì)細(xì)胞存活率表示。

1.2.5 體內(nèi)實(shí)驗(yàn) 取裸鼠30只，飼養(yǎng)于SPF級(jí)無(wú)菌飼養(yǎng)室，自由攝取食物和水，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期鼻咽癌細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液，裸鼠左側(cè)腋部皮下注入鼻咽癌細(xì)胞進(jìn)行接種。接種后第10天，當(dāng)絕大多數(shù)腫瘤直徑達(dá)1.2～1.5 cm時(shí)，依據(jù)不同的處理方法將荷瘤裸鼠分成6組：不作干預(yù)（空白對(duì)照組）；腹腔注射GCV（陰性對(duì)照組A）；瘤內(nèi)注射脂質(zhì)體，腹腔注射GCV（陰性對(duì)照組B）；瘤內(nèi)注射增強(qiáng)型載體+脂質(zhì)體（陰性對(duì)照組C）；瘤內(nèi)注射單啟動(dòng)子載體+脂質(zhì)體，腹腔注射GCV（陽(yáng)性對(duì)照組）；瘤內(nèi)注射增強(qiáng)型載體+脂質(zhì)體，腹腔注射GCV（實(shí)驗(yàn)組）。觀察6組移植瘤的生長(zhǎng)情況，待空白組的腫瘤體積達(dá)到約6 cm3時(shí)，停止實(shí)驗(yàn)，斷頸處死裸鼠，完整剝離腫瘤，稱重，計(jì)算抑瘤率（%）=（空白組瘤塊質(zhì)量-治療組瘤塊質(zhì)量）/空白組瘤塊質(zhì)量×100%。同時(shí)，取實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝臟、腎臟組織，經(jīng)10%的甲醛固定，送病理檢查。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布及方差齊性，兩組計(jì)量資料組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組計(jì)量資料組間比較采用方差分析，其中兩組計(jì)量資料比較采用Dunnet-t法；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光顯微鏡下觀察胸苷激酶基因綠色熒光蛋白表達(dá)

通過(guò)熒光顯微鏡下觀察顯示人鼻咽癌細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞均有熒光表達(dá)，但后者較前者在表達(dá)數(shù)量及強(qiáng)度方面有所加強(qiáng)，且對(duì)照組的人乳腺癌細(xì)胞亦有熒光表達(dá)存在，但正常對(duì)照的ECV-304細(xì)胞無(wú)熒光表達(dá)。

2.2 熒光定量PCR檢測(cè)胸苷激酶基因mRNA表達(dá)

在PCR定量檢測(cè)方面，結(jié)果顯示增強(qiáng)型載體組（實(shí)驗(yàn)組）的胸苷激酶基因mRNA的表達(dá)量顯著強(qiáng)于對(duì)照組的單啟動(dòng)載體，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.3 端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果

在細(xì)胞端粒酶活性方面，ECV-304細(xì)胞為陰性，腫瘤細(xì)胞端粒酶活性均為陽(yáng)性。

2.4 MTT檢測(cè)結(jié)果

轉(zhuǎn)染增強(qiáng)型載體后的鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)被抑制，相對(duì)細(xì)胞存活率為（36.8±2.1）%，與啟動(dòng)子對(duì)照組相比較，增強(qiáng)型載體組可明顯抑制鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖，其細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組Hep-G2細(xì)胞存活率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。見表1。

表1 MTT法對(duì)雙調(diào)控增強(qiáng)型載體聯(lián)合前體藥物殺傷鼻咽癌細(xì)胞存活率情況

2.5 Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

增強(qiáng)型載體對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的侵襲力有明顯抑制作用；經(jīng)增強(qiáng)型載體處理的鼻咽癌細(xì)胞的樣本高倍鏡視野下平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（20.2±2.3）個(gè)，而未處理的鼻咽癌細(xì)胞的樣本高倍鏡視野下平均穿膜細(xì)胞數(shù)為（63.6±1.3）個(gè)，兩組平均穿模細(xì)胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。

2.6 動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

改良重建的增強(qiáng)型載體對(duì)裸鼠鼻咽癌移植瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用（抑瘤率為56.5%），顯著高于單啟動(dòng)子載體組（抑瘤率為43.3%）（P ＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組與其他對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組裸鼠肝腎病理檢查顯示，肝、腎組織結(jié)構(gòu)正常，均無(wú)明顯損害。見表2。

表2 各組Hep-G2細(xì)胞接種裸鼠39 d后腫瘤平均質(zhì)量及抑瘤率

3 討論

腫瘤分子靶向治療是當(dāng)前腫瘤治療研究方面最具前景的方向，既往在臨床上廣泛應(yīng)用的自殺基因因其殺傷細(xì)胞作用沒(méi)有選擇性容易引起諸多并發(fā)癥，導(dǎo)致其在臨床上進(jìn)一步應(yīng)用受到明顯限制[3-4]。鑒于此，采用腫瘤特異性啟動(dòng)子調(diào)控自殺基因的分子靶向系統(tǒng)便成為治療腫瘤的一種新方法。但在不影響載體的靶向性的前提下，如何選擇調(diào)控元件，以提高該載體的抑瘤效應(yīng)成為當(dāng)前腫瘤靶向研究的一個(gè)熱點(diǎn)。既往的實(shí)驗(yàn)研究和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，已經(jīng)解決了應(yīng)用單啟動(dòng)子靶向載體的靶向性問(wèn)題，但因其抑瘤效應(yīng)較低，使其應(yīng)用仍然受到一定的限制。故而尋求一種既具有良好靶向性又具有良好抑瘤效應(yīng)的載體系統(tǒng)迫在眉睫。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究通過(guò)構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子控制皰疹病毒胸苷激酶基因腫瘤特異表達(dá)載體（AdhTERT/TK），結(jié)果顯示，該腫瘤的特異性表達(dá)載體不僅對(duì)未分化甲狀腺癌及其移植瘤具有殺傷作用，還能使GCV對(duì)該腫瘤的敏感性增強(qiáng)，從而提升治療效果[7]。同時(shí)有研究還顯示該腫瘤特異表達(dá)系統(tǒng)，在靶向殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)對(duì)正常組織無(wú)影響。此外，hTERTp啟動(dòng)子還可組合一些腫瘤殺傷因子形成新的腫瘤特異性表達(dá)載體，以發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的特異性誘導(dǎo)作用[8-9]。所以針對(duì)這種組合構(gòu)建，相關(guān)研究顯示，分別構(gòu)建TRAIL及Bax等腫瘤特異表達(dá)載體后，除了能增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性，提高治療效果，還能靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞并誘導(dǎo)其進(jìn)一步凋亡，且對(duì)正常組織無(wú)明顯影響[10-13]。諸如上述研究，不僅開拓了腫瘤靶向基因治療的新領(lǐng)域，還為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。但從諸多文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果來(lái)看，單純用hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)各種基因載體的抑瘤效率并不高，這也成為制約腫瘤基因靶向治療研究的難點(diǎn)與瓶頸[14-15]。因此，如何提高靶向載體的殺瘤效率是當(dāng)前研究的關(guān)鍵。

針對(duì)這一研究難點(diǎn)與瓶頸，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)已有采用hTERT啟動(dòng)子介導(dǎo)雙基因等方法來(lái)提高載體抑瘤率的報(bào)道。如徐岷等[16]采用hTERT啟動(dòng)子及SV40增強(qiáng)子對(duì)胸苷激酶基因的SB系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控，能夠?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞進(jìn)行選擇性殺滅。李少一等[17]采用的腺病毒介導(dǎo)的TK/CD雙自殺基因表達(dá)系統(tǒng)能在體外較高效地殺傷乳腺癌細(xì)胞?；谏鲜鰣?bào)道及相關(guān)研究，筆者嘗試對(duì)原有載體系統(tǒng)（hTERT/TK/pGL3）進(jìn)行改良重建，在保證載體具有良好靶向性的前提下，引入一個(gè)CMV增強(qiáng)子，即hTERT/CMV雙調(diào)控TK基因的增強(qiáng)型靶向表達(dá)載體，以從理論上彌補(bǔ)原有靶向載體系統(tǒng)的不足。本研究從此理論基礎(chǔ)出發(fā)，結(jié)果顯示改良構(gòu)建后的增強(qiáng)型胸苷激酶基因表達(dá)載體在鼻咽癌細(xì)胞中高效表達(dá)，且表達(dá)效率是單啟動(dòng)子載體的5倍。結(jié)合Boyden小室侵襲實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增強(qiáng)型載體組對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的體外增殖具有明顯的抑制殺傷作用，對(duì)裸鼠移植瘤亦具有明顯的體內(nèi)抑制作用，這些均明顯強(qiáng)于單啟動(dòng)子載體組（P ＜0.05）。在不良反應(yīng)方面，通過(guò)裸鼠肝腎病理檢查顯示，均無(wú)明顯毒副作用表現(xiàn)。

綜上所述，以hTERT啟動(dòng)子及CMV增強(qiáng)子對(duì)胸苷激酶基因的增強(qiáng)型表達(dá)載體進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控，成功改良構(gòu)建后能夠靶向及高效地殺傷鼻咽癌細(xì)胞及體外移植瘤，且應(yīng)用后在動(dòng)物模型體內(nèi)未見明顯的毒副反應(yīng)。改良后的增強(qiáng)型靶向載體抑瘤作用顯著提高，且載體的靶向性并無(wú)改變，體內(nèi)應(yīng)用具有一定安全性。本研究中增強(qiáng)型胸苷激酶基因載體的成功構(gòu)建及其基因分子與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究為進(jìn)一步惡性腫瘤靶向治療提供依據(jù)。

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Construction of enhanced thymidine kinase gene expression vector and its experimental study on killing efficiency

SONG Qiuling
(Department of Otorhinolaryngology,Heze Municiple Hospital of Shandong Province,Heze,Shandong 274000,China)

【Objective】To investigate the improved construction of enhanced expression vector of hTERT promoter combined with cytomegalovirus (CMV) enhancer for regulating thymidine kinase gene,and the effect and safety evaluation of killing nasopharyngeal carcinoma cells.【Methods】Link hTERT promoter,CMV enhancer and thymidine kinase gene were digested(template for pGL3 empty vector) to construct enhanced expression vector; the expression vector of thymidine kinase gene controlled by hTERT promoter was selected as the control group.Human nasopharyngeal carcinoma cells (telomerase positive,research group),human breast cancer cells (control group) and normal human umbilical vein endothelial cells (telomerase negative) were selected as samples,fluorescence microscopy was used to observe the expression of fluorescent protein,the expression of thymidine kinase gene mRNA was detected by polymerase chain reaction (PCR),and telomerase activity was detected by Telochaser assay,at the same time,the effect of enhanced vector on the proliferation and inhibition of nasopharyngeal carcinoma cells was analyzed.【Results】hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene could be successfully constructed;human nasopharyngeal carcinoma cells and breast cancer cells had fluorescence expression under fluorescence microscopy,and the latter was strengthened in expression number and expression intensity,there was fluorescence expression in human breast cancer cells in the control group,but no fluorescence expression in ECV-304 cells.In the quantitative detection of PCR,the results showed that the expression of thymidine kinase gene mRNA in the enhanced vector group was significantly stronger than that in the control group,and the difference was statistically significant (P＜0.05).In the telomerase activity of cells,ECV-304 cells were negative,and tumor cells were positive; the results of MMT detection showed that the proliferation of nasopharyngeal carcinoma cells in vitro was significantly inhibited in enhanced vector group,and the cell survival rate was significantly lower than that in the control group,the difference was statistically significant (P＜0.05).At the same time,in the in vivo experiment of nasopharyngeal carcinoma cells,enhanced vector also showed a significant inhibitory effect on the transplantation tumor of nasopharyngeal carcinoma,and the tumor inhibition rate of enhanced vector group was significantly higher than that of the control group (P＜0.05).The differences in the tumor inhibition rate between the research group and other control groups were statistically significant (P＜0.05).The pathological examination of liver and kidney of nude mice in the research group showed normal tissue structure of liver and kidney without significant damage.【Conclusion】The improved construction of hTERT promoter and CMV enhancer for regulating the expression vector of thymidine kinase gene,can successfully targetedly and efficiently kill nasopharyngeal carcinoma cells and transplantation tumors in vitro,and there were no obvious side effects on animal models.

nasopharyngeal carcinoma; thymidine kinase gene; telomerase; cytomegalovirus

R739

A

10.19338/j.issn.1672-2019.2017.10.005

2017-01-19

（胥洪娟 編輯）