甲狀腺乳頭狀癌組織中S100A14與LOXL2的表達及臨床意義

王冬海，任力，李騰，鄭吉春，朱建平

0 引言

甲狀腺乳頭狀癌是內(nèi)分泌系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占所有甲狀腺癌的85%～90%，大多數(shù)甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma,PTC）進展緩慢，侵襲性較弱，10年生存率達95%以上[1]，隨著高分辨率彩超的普及應(yīng)用及人們對甲狀腺體檢意識的提高，部分PTC患者早期就檢測出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，甚至是遠處轉(zhuǎn)移，其中一些病例不乏是甲狀腺微小乳頭狀癌。根據(jù)2017版WHO內(nèi)分泌器官腫瘤分類的標準，將甲狀腺乳頭狀癌分為15個病理亞型，其中部分甲狀腺乳頭狀癌病理亞型具有高侵襲性。越來越多的研究表明，S100A14和LOXL2在消化道腫瘤和婦產(chǎn)科腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮一定的作用，而二者在甲狀腺乳頭狀癌中的研究鮮有報道[2-3]。本試驗運用免疫組織化學法對甲狀腺乳頭狀癌組織中鈣結(jié)合蛋白S100A14和賴氨酰氧化酶（LOXL）2的表達水平進行半定量檢測，并結(jié)合臨床病理資料分析，探討二者之間的相關(guān)性及其與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年1月至2019年12月空軍特色醫(yī)學中心甲狀腺乳頭狀癌753例，通過對組織切片重新閱片、判讀，從中隨機篩選出30例經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌（classic papillary thyroid carcinoma,CPTC）、30例高侵襲性甲狀腺乳頭狀癌（包括6例鞋釘樣亞型、7例實體/梁狀亞型、8例柱狀細胞亞型、9例高細胞亞型甲狀腺乳頭狀癌病例）和30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫病例（nodular goiter,NG），以上病例均經(jīng)病理證實。30例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者年齡28～70歲，平均年齡（53.4±9.84）歲，男女比例為1∶5；30例CPTC患者年齡18～57歲，平均年齡（37.8±10.49）歲，男女比例為1∶2；30例高侵襲性PTC患者年齡26～65歲，平均年齡（40.57±11.52）歲，男女比例為1∶5。在60例PTC中（包括CPTC組和高侵襲組），22例腫瘤直徑≥2 cm，38例直徑＜2 cm；其中37例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，23例未轉(zhuǎn)移。CPTC和高侵襲組納入標準：（1）首次入住本院且經(jīng)手術(shù)冰凍或術(shù)后病理確診；（2）臨床資料和病理資料齊全。排除標準：（1）病理診斷不明確或腫瘤細胞個數(shù)極少；（2）轉(zhuǎn)移性甲狀腺腫瘤或伴有其他轉(zhuǎn)移惡性腫瘤病史。根據(jù)2018版AJCC甲狀腺乳頭狀癌分期標準，30例CPTC中有2例Ⅱ期，28例Ⅰ期；30例高侵襲性PTC中，1例Ⅱ期，29例Ⅰ期；所有PTC患者均給予甲狀腺癌根治術(shù)+區(qū)域淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)中神經(jīng)檢測（NIM3.0）、納米碳淋巴結(jié)顯影示蹤。本研究經(jīng)中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學中心倫理委員會批準。

1.2 組織芯片

90例PTC組織和結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織蠟塊由北京龍邁達斯科技開發(fā)有限公司代加工為組織芯片，芯片直徑為1.5 mm，切片厚度4 μm，主要分為以下幾個步驟：（1）芯片微陣列設(shè)計；（2）評估蠟塊、確定研究目標區(qū)域；（3）TMA受體蠟塊制備；（4）點樣、再包埋；（5）切片、撈片；（6）質(zhì)控。

1.3 主要試劑及方法

S100A14抗體和LOXL2抗體均為兔多克隆抗體，購自英國Abcam公司；根據(jù)預(yù)實驗的結(jié)果，所需配制的最佳滴度S100A14為1∶2 000，LOXL2為1∶200。免疫組織化學方法為SP法，試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，所有操作步驟嚴格按照說明書進行，用PBS緩沖液代替一抗作陰性對照，分別用前期預(yù)試驗證實陽性的食管上皮和胎盤組織作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判定[4]

S100A14和LOXL2分別以細胞膜和細胞質(zhì)著色為主。陽性判斷標準采用半定量計數(shù)法，即按著色強度和陽性細胞所占的百分比進行結(jié)果判定，按染色強度：陰性為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按著色細胞百分比，無陽性細胞為0分，＜25%為1分，25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%為4分。兩者的乘積作為總積分，總分0分為-，1～5分為弱+，5～8分為+，8～12分為++?？偡郑?分為陰性表達，≥5分為陽性表達，5～8分為低表達，8～12分為高表達。所有結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下進行計分。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS23.0軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料比較應(yīng)用卡方檢驗，當出現(xiàn)1＜T＜5時，改用卡方檢驗的校正公式或者用Fisher精確檢驗，S100A14和LOXL2表達的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 S100A14和LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達

S100A14的陽性表達主要位于細胞質(zhì)和細胞膜，以細胞膜上分布更典型，表達強度在NG組、CPTC組、高侵襲組逐步呈上升趨勢（χ2=37.542,P=0.000)。LOXL2陽性表達定位主要位于細胞質(zhì)，個別病例出現(xiàn)細胞核著色，表達強度在NG組、CPTC組、高侵襲組逐步呈上升趨勢（χ2=26.809,P=0.000）。S100A14和LOXL2在經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌與高侵襲性甲狀腺乳頭狀癌中的表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.667,P=0.01;χ2=5.934,P=0.015），見圖1～2、表1。

表1 S100A14和LOXL2在甲狀腺不同病變組織中的表達情況Table 1 Expression of S100A14 and LOXL2 in different thyroid lesions

圖1 S100A14在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(A,SP×300)、經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌(B,SP×500)和高侵襲性實體/梁狀亞型甲狀腺乳頭狀癌(C,SP×500)中的表達Figure 1 Expression of S100A14 in nodular goiter(A,SP×300),classic papillary thyroid carcinoma (B,SP×500) and highly invasive solid/trabecular variant of papillary thyroid carcinoma (PTC) (C,SP×500)

2.2 S100A14和LOXL2的表達與甲狀腺乳頭狀癌臨床參數(shù)的關(guān)系

S100A14在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理亞型具有顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、腫瘤大小、多灶性無關(guān)。LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌中的表達與病理亞型具有顯著相關(guān)性，而與患者的年齡、腫瘤大小、多灶性無關(guān)，見表2。

圖2 LOXL2在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(A,SP×300)、經(jīng)典型甲狀腺乳頭狀癌(B,SP×500)和高侵襲性鞋釘樣亞型甲狀腺乳頭狀癌 (C,SP ×500)中的表達Figure 2 Expression of LOXL2 in nodular goiter (A,SP×300),classic papillary thyroid carcinoma (B,SP×500) and highly invasive hobnail variant of PTC (C,SP ×500)

2.3 甲狀腺乳頭狀癌組織中S100A14與LOXL2表達的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，在60例甲狀腺乳頭狀癌組織中，S100A14與LOXL2的表達呈正相關(guān)（r=0.332,P=0.01），見表3。

表3 S100A14與LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌中表達的相關(guān)性Table 3 Relation between S100A14 and LOXL2 expression in PTC

3 討論

3.1 甲狀腺乳頭狀癌

PTC是甲狀腺組織濾泡上皮來源的惡性腫瘤，雖然是公認的分化良好的腫瘤，具有良好的預(yù)后和較高的生存率，但是依然存在遠處轉(zhuǎn)移的風險，給患者帶來經(jīng)濟和精神上的壓力。已經(jīng)證實一些亞型具有高侵襲性，包括高細胞亞型、鞋釘樣亞型、柱狀細胞亞型、實體/梁狀亞型[5]，具有很高的侵襲性行為和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率。有關(guān)研究表明S100A14和LOXL2與很多腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[6]，但目前有關(guān)二者在甲狀腺病變組織中的研究，國內(nèi)外文獻尚無報道。本文利用免疫組織化學法探討二者在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達情況及相關(guān)性。

3.2 S100A14與甲狀腺乳頭狀癌

S100A14 是S100 家族的新成員，定位在1q21.3，該區(qū)段穩(wěn)定性差，染色體移位、重組、缺失及擴增頻繁，易致S100A14表達失控，影響S100A14蛋白正常表達，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系緊密[7]。S100A14蛋白功能主要包括細胞內(nèi)功能和細胞外功能。細胞內(nèi)功能主要與二價鈣離子結(jié)合而發(fā)揮作用，調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、周期、侵襲、轉(zhuǎn)移、基因轉(zhuǎn)錄等，參與腫瘤的發(fā)生與進展。細胞外功能主要與受體結(jié)合，通過分泌來發(fā)揮作用，主要的受體是RAGE[8]，部分也與Toll樣受體4相互作用[9]。S100A14在不同腫瘤中的表達有明顯差異，具有明顯的組織特異性，在正常結(jié)、直腸、子宮內(nèi)膜、食管組織中呈高表達，在肺[10]、肝、腎組織中中度表達，在心臟組織中低表達，腦、脾、外周血白細胞不表達，肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌、乳腺癌和子宮腫瘤中高表達[11-13],在腎癌、食管癌、口腔鱗癌、結(jié)直腸癌中低表達[14-15]。有研究[12]表明細胞內(nèi)S100A14蛋白通過p53依賴上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）的表達進而促進細胞侵襲。有研究[5]表明，細胞外低濃度S100A14蛋白可以激活MAPK信號通路，其中鈣離子發(fā)揮了重要作用。NFKB信號分子與細胞增殖、應(yīng)激反應(yīng)、炎性反應(yīng)密切相關(guān)，S100A14蛋白對其也有顯著的激活作用，目前沒有統(tǒng)一的機制，各學者報道不一。S100A14是具有雙重作用的蛋白，對腫瘤既有促進作用，也有抑制作用[6]，目前研究主要集中于其對腫瘤增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移與凋亡的影響。有文獻[16]報道，S100A14在具有高風險注射藥物行為且在未被HIV感染的人群中高表達，NK細胞的數(shù)量和活性增加，提示了其在增強自然免疫方面的潛在功能。王巖等發(fā)現(xiàn)S100A14蛋白在子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)性卵巢癌中陽性率達87.8%[4]，本研究顯示，S100A14蛋白在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、CPTC及高侵襲性PTC中的表達呈上升趨勢，且任兩組比較均有顯著差異。Hu等[2]通過Meta分析發(fā)現(xiàn)S100A14的高表達與腫瘤的分化不良有關(guān)，而在年齡、性別、腫瘤分期、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素差異無統(tǒng)計學意義。本研究中S100A14蛋白的高表達與PTC的高侵襲亞型有關(guān)，并且S100A14表達與甲狀腺乳頭狀癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，提示S100A14蛋白的陽性表達可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移，這與Zhao等[17]在非小細胞肺癌中的研究一致。本研究尚未證實與患者年齡、腫瘤大小及多灶性有關(guān)，與文獻[18]報道基本相符。

3.3 LOXL2與甲狀腺乳頭狀癌

LOXL2是賴氨酰氧化酶家族之一，LOXL2基因定位在8p21.2～21.3，11個外顯子，該區(qū)域染色體易丟失，是一種銅依賴性胺氧化酶，主要作用是催化膠原和彈性蛋白在細胞外基質(zhì)中的共價交聯(lián)，使其纖維化[19]，保持細胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的完整性，與多種腫瘤及纖維化疾病的發(fā)展密切相關(guān)。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)其在乳腺癌、結(jié)腸癌、食管癌、胰腺癌、胃癌、肺癌等細胞和組織中表達上調(diào)，并可通過促進腫瘤相關(guān)纖維化、腫瘤血管的生成在腫瘤微環(huán)境中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2的高表達與腫瘤的侵襲性有關(guān)。劉鵬等[20]研究發(fā)現(xiàn)，47例膽管癌組織中LOXL2蛋白陽性率達68.1%，LOXL2 mRNA的表達為154.63±128.96。田潔等[21]研究發(fā)現(xiàn)，71例卵巢癌病例中LOXL2陽性表達率為78.87%。研究發(fā)現(xiàn)[22]，LOXL2參與了腫瘤微環(huán)境下血管的形成，與乳腺癌細胞的侵襲及轉(zhuǎn)移有關(guān)。相反，也有少量研究表明LOXL2可能起抑癌作用，方堃[23]研究發(fā)現(xiàn)LOXL2在前列腺癌組織中的表達明顯低于良性前列腺增生組織。Ye等[24]在研究GINS2與甲狀腺癌增殖和凋亡關(guān)系時發(fā)現(xiàn)，GINS2的干擾導(dǎo)致了LOXL2的顯著下調(diào)，其調(diào)節(jié)可能與FAK/Akt/mTOR信號通路有關(guān)，富含肉豆蔻酰化丙氨酸的c激酶底物樣1（MARCKSL1）可導(dǎo)致該調(diào)節(jié)通路的磷酸化降低，調(diào)節(jié)細胞周期和凋亡蛋白，而LOXL2可直接與MARCKSL1結(jié)合，激活FAK/Akt/mTOR信號調(diào)節(jié)通路，抑制MARCKSL1誘導(dǎo)的細胞凋亡，從而促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展與轉(zhuǎn)移[25]。本研究顯示，LOXL2蛋白在三組的表達呈遞增趨勢，且任意兩組比較均有顯著差異，由此推斷LOXL2可能參與了甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移；Lin等[26]在腎透明細胞癌的薈萃分析表明，LOXL2 mRNA的高表達與腫瘤的不良預(yù)后、分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，而本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOXL2的表達與腫瘤大小、多灶性無關(guān)，且尚未證實在三組中表達遞增的趨勢與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可能與樣本量不足、缺乏代表性有關(guān)，有待進一步分析和研究。

3.4 S100A14與LOXL2的關(guān)系

Chen等[27]研究發(fā)現(xiàn)S100A14蛋白通過p53依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)控MMP-2的表達和功能，參與細胞的侵襲，而MMP-2是一類可降解細胞外基質(zhì)成分的蛋白酶，在高轉(zhuǎn)移性腫瘤中，MMP-2的高表達可降解Ⅳ型膠原蛋白，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。LOXL2蛋白的功能是催化細胞外基質(zhì)（ECM）中膠原蛋白、彈性蛋白的共價交聯(lián)，Peng等[28]的研究表明，LOXL2的高表達可以上調(diào)MMP-2、MMP-9的表達，從而促進胃癌細胞的遷移和侵襲。S100A14與LOXL2高表達都可以上調(diào)MMP-2的表達，從而促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。二者的交匯點和共同點是都可以上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達。還有研究[28-29]表明二者都可以促進腫瘤微血管的形成，具體協(xié)同機制不詳。本實驗表明S100A14與LOXL2在甲狀腺病變組織中的表達依次呈遞增趨勢，通過Pearson相關(guān)性分析，二者具有顯著相關(guān)性。關(guān)于兩者具體協(xié)同發(fā)生機制有待進一步研究。

3.5 S100A14、LOXL2與甲狀腺乳頭狀癌的關(guān)系

本課題前期研究發(fā)現(xiàn)甲狀腺乳頭狀癌在男性中比例有升高和年輕化的趨勢，而腫瘤的診治關(guān)鍵在于早發(fā)現(xiàn)，迫切需要尋找新的蛋白分子或血清學指標，對腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)或預(yù)后提示具有重要意義[30]。而S100A14與LOXL2主要集中在婦科腫瘤、消化道腫瘤方面的研究，尚無在甲狀腺乳頭狀癌中的研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，S100A14與LOXL2在甲狀腺乳頭狀癌不同病理亞型中的表達具有顯著差異，提示對規(guī)范甲狀腺乳頭狀癌的診治工作具有重要意義，再次強調(diào)對PTC病理分型的重要性。本實驗尚有不足之處，比如樣本量少、組織芯片采樣產(chǎn)生的誤差、缺乏對高侵襲性具體亞型討論及抗體表達情況與患者預(yù)后等，有待進一步提高改進。