EIF5A2在人肝細(xì)胞癌中的表達(dá)及其與術(shù)后生存期的關(guān)系

楊茜，葉冬雪，馬晏然，胡小媛，李宏，周璇，項(xiàng)鋒鋼,

0 引言

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見的六大惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康[1]。肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是肝癌最常見的組織學(xué)類型[2]，目前占癌癥相關(guān)死亡原因的第二位[3]。在我國，引起HCC高風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)鍵因素是慢性HBV感染和黃曲霉毒素暴露。由于其高發(fā)病率以及缺乏針對(duì)性的藥物[2,4]，患者預(yù)后不良，因此迫切需要進(jìn)一步研究HCC的發(fā)病機(jī)制以及尋找有效的靶向標(biāo)志物。

真核翻譯起始因子5A2（eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2）為EIF家族的重要一員，是一種相對(duì)分子質(zhì)量較?。?7 kDa）的保守酸性蛋白質(zhì)[5]。有研究表明，EIF5A2在上尿路尿道上皮癌、鼻咽癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，提示預(yù)后不良[6-9]，但關(guān)于其影響HCC發(fā)生、發(fā)展的研究相對(duì)較少。本文旨在通過檢測EIF5A2在人肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，揭示其與臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系，為尋找腫瘤治療新靶點(diǎn)提供思路。

1 資料與方法

1.1 組織樣本

選取青島大學(xué)附屬醫(yī)院2014年2月—2016年10月手術(shù)切除的284例肝細(xì)胞癌標(biāo)本（由于所掌握的臨床病理資料中僅有乙型肝炎的情況，因此我們僅進(jìn)行了EIF5A2與乙肝的相關(guān)分析），包括患者的癌組織及相應(yīng)癌旁非瘤組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）進(jìn)行此次研究，患者術(shù)前均未接受任何放化療，入組病例情況見表1。此外，收集2019年1月至3月經(jīng)手術(shù)切除的12對(duì)新鮮HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織，迅速置于-80℃冰箱中凍存。定期對(duì)患者進(jìn)行電話隨訪，隨訪日期截至2020年4月29日，284例HCC患者中術(shù)后滿三年且隨訪資料完整者有250例，其中63例死亡；術(shù)后滿五年且隨訪資料完整者有83例，其中31例死亡。試驗(yàn)經(jīng)青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 284例肝細(xì)胞癌患者一般臨床資料Table 1 General clinical data of 284 hepatocellular carcinoma (HCC) patients

1.2 主要試劑和耗材

PV6000免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，EIF5A2兔單克隆抗體（EPR7412-50 cat.no.ab150439）購于英國Abcam公司，免疫組織化學(xué)工作濃度1∶50，Western blot工作濃度1∶500；RIPA裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，BCA蛋白測定試劑盒購于美國Thermo Fisher Scientific公司，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（ECL）kit購于美國Millipore公司；PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex TaqTMⅡ熒光定量試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，EIF5A2引物和GAPDH引物均購于上海生工生物工程股份有限公司。

1.3 Western blot檢測蛋白和mRNA的表達(dá)

在新鮮切除的12對(duì)腫瘤組織和相應(yīng)的毗鄰非瘤組織中加入RIPA裂解液，均質(zhì)化并在冰上裂解30 min，BCA蛋白測定試劑盒測定提取總蛋白濃度。配制12%SDS-PAGE膠，蛋白上樣、電泳分離后，72 V恒壓電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入目標(biāo)一抗室溫孵育2 h，4℃過夜。次日TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育1 h，再次洗膜后于暗室中使用ECL試劑盒顯影。β-actin作為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參。

1.4 qRT-PCR檢測EIF5A2的表達(dá)

用TRIzol進(jìn)行組織總RNA的提取，紫外分光光度計(jì)測定其純度及濃度，按操作說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA，隨后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR測定。每個(gè)樣本設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性，30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s；共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為標(biāo)準(zhǔn)化內(nèi)參，2-△△Ct法計(jì)算EIF5A2在HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中的相對(duì)表達(dá)量。EIF5A2及GAPDH引物序列見表2。

表2 EIF5A2及GAPDH的引物序列Table 2 Primer sequences of EIF5A2 and GAPDH

1.5 免疫組織化學(xué)檢測

1.5.1 組織芯片構(gòu)建 取樣前由兩位病理醫(yī)師對(duì)蠟塊的HE切片進(jìn)行鏡下形態(tài)學(xué)觀察，圈出典型位置，并在蠟塊確定取樣部位，使用直徑1.5 mm的取樣針在每個(gè)蠟塊穿取組織芯轉(zhuǎn)移到受體蠟塊，53℃陣列融合，4 μm連續(xù)切片。芯片經(jīng)HE染色后進(jìn)行復(fù)檢。

1.5.2 免疫組織化學(xué)染色 按照試劑盒說明書采用PV6000法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。白片經(jīng)60℃恒溫烘箱烤片30 min后，二甲苯脫蠟，梯度酒精水化；置于3%H2O2中浸泡20 min，充分水洗；微波修復(fù)（1 mmol/L EDTA，pH8.0），自然冷卻，PBS洗3次；滴加目標(biāo)一抗，4℃過夜，PBS洗3次；滴加二抗于37℃水浴鍋中孵育30 min，PBS洗3次；DAB顯色，光學(xué)顯微鏡下控制顯色時(shí)間；蘇木精對(duì)比染色，脫水，透明，中性樹膠封片。用已知陽性表達(dá)EIF5A2的結(jié)腸癌組織作為陽性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.5.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果判讀 以胞質(zhì)或胞核中出現(xiàn)棕黃色或棕褐色計(jì)為EIF5A2陽性表達(dá)，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[10-11]：陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：0分（陰性）、1分（弱染色）、2分（中等強(qiáng)度染色）、3分（強(qiáng)染色）；陽性細(xì)胞所占百分比計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：1分（＜25%）、2分（25%～50%）、3分（≥50%～75%）、4分（≥75%）。EIF5A2免疫組織化學(xué)染色總得分=染色強(qiáng)度得分×陽性細(xì)胞百分比得分，≤4分為低表達(dá)，＞4分為高表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中的表達(dá)應(yīng)用配對(duì)t檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行分析；EIF5A2在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)與臨床病理參數(shù)間的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行分析；Kaplan-Meier生存曲線和Log rank檢驗(yàn)對(duì)患者術(shù)后生存時(shí)間進(jìn)行分析；Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型對(duì)影響患者術(shù)后生存時(shí)間的因素進(jìn)行單因素和多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中mRNA水平的表達(dá)

qRT-PCR法檢測12對(duì)組織中EIF5A2 mRNA水平的表達(dá)情況。結(jié)果表明，肝細(xì)胞癌中EIF5A2的表達(dá)水平顯著高于相應(yīng)癌旁非瘤組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.305,P=0.0003），見圖1。

圖1 qRT-PCR法檢測EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中的表達(dá)Figure 1 EIF5A2 expression in HCC and adjacent nontumor tissues detected by qRT-PCR

2.2 EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中蛋白水平的表達(dá)

Western blot法檢測12對(duì)組織中EIF5A2蛋白水平的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)相比于癌旁非瘤組織，EIF5A2在肝細(xì)胞癌中表達(dá)均上調(diào)，且表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=10.120,P＜0.001），見圖2。

圖2 Western blot法檢測EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中的表達(dá)Figure 2 EIF5A2 expression in HCC and adjacent nontumor tissues detected by Western blot

2.3 EIF5A2在肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁非瘤組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測結(jié)果顯示EIF5A2在胞質(zhì)和胞核中均有表達(dá)，見圖3。肝細(xì)胞癌中176例（61.97%）呈高表達(dá)，相應(yīng)癌旁非瘤組織中11例（3.87%）呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（z=-12.186,P＜0.001）。

圖3 EIF5A2在肝細(xì)胞癌及癌旁非瘤組織中的表達(dá) (IHC ×200)Figure 3 Expression of EIF5A2 in HCC and adjacent nontumor tissues (IHC ×200)

2.4 EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系

EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者的腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)、分化程度有關(guān)（P＜0.05），而與患者的性別、年齡、AFP水平、是否有乙型肝炎、肝硬化、包膜侵犯、脈管侵犯、TNM分期無關(guān)（P＞0.05），見表3。

表3 EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 3 Relation between EIF5A2 expression and clinicopathological characteristics of HCC patients

2.5 EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者術(shù)后生存期的關(guān)系

對(duì)250例術(shù)后滿三年且有完整隨訪資料的患者進(jìn)行生存預(yù)后分析，結(jié)果顯示：EIF5A2低表達(dá)組和高表達(dá)組的生存率分別為88.8%、65.8%，低表達(dá)患者術(shù)后總體生存期及無病生存期較高表達(dá)患者更長（均P＜0.001），見圖4A、B。對(duì)83例術(shù)后滿5年有完整隨訪資料的患者進(jìn)行預(yù)后分析，結(jié)果顯示：EIF5A2低表達(dá)組和高表達(dá)組的5年生存率分別為91.3%、27.0%，低表達(dá)患者術(shù)后總體生存期及無病生存期較高表達(dá)患者更長（均P＜0.001），見圖4C、D；在腫瘤≥5 cm分組中，低表達(dá)組和高表達(dá)組的五年生存率分別為100%、23.8%，低表達(dá)患者術(shù)后總體和無病生存期高于高表達(dá)患者（P=0.004、0.002），見圖4E、F。

圖4 EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌患者術(shù)后三年及五年生存時(shí)間的關(guān)系Figure 4 Relation between EIF5A2 expression and 3-and 5-year survival time of HCC patients

2.6 Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型分析影響肝細(xì)胞癌者術(shù)后生存時(shí)間的因素

將EIF5A2的表達(dá)水平與可能影響HCC術(shù)后生存期的臨床病理參數(shù)進(jìn)行單因素分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)影響術(shù)后三年總體生存期的因素為：AFP（P=0.002）、腫瘤大?。≒＜0.001）、包膜侵犯（P=0.019）、脈管侵犯（P=0.004）、腫瘤是否多發(fā)（P＜0.001）、分化程度（P＜0.001）、TNM分期（P=0.009）、EIF5A2的表達(dá)水平（P＜0.001）；影響術(shù)后三年無病生存期的因素為：AFP（P＜0.001）、腫瘤大?。≒＜0.001）、包膜侵犯（P=0.012）、脈管侵犯（P=0.003）、腫瘤是否多發(fā)（P＜0.001）、分化程度（P＜0.001）、TNM分期（P=0.010）、EIF5A2的表達(dá)水平（P＜0.001）。進(jìn)一步行多因素分析發(fā)現(xiàn)影響術(shù)后三年總體生存期的獨(dú)立預(yù)后因素有：腫瘤大小（P=0.021）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.004）、EIF5A2的表達(dá)水平（P=0.005）；影響術(shù)后三年無病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素有：腫瘤大小（P=0.035）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.003）、EIF5A2的表達(dá)水平（P=0.007），見表4～5。

表4 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞癌患者三年總體生存時(shí)間的因素Table 4 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 3-year overall survival of HCC patients

影響術(shù)后五年總體生存期的因素為：腫瘤大?。≒=0.002）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.028）、TNM分期（P=0.002）、EIF5A2的表達(dá)水平（P＜0.0 0 1）；影響術(shù)后五年無病生存期的因素：腫瘤大?。≒=0.002）、腫瘤是否多發(fā)（P=0.025）、TNM分期（P＜0.001）、EIF5A2的表達(dá)水平（P＜0.001）。進(jìn)一步多因素分析發(fā)現(xiàn)影響術(shù)后五年總體和無病生存時(shí)間的獨(dú)立預(yù)后因素為：EIF5A2的表達(dá)水平（P＜0.001），見表6～7。

表5 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞癌患者三年無病生存時(shí)間的因素Table 5 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 3-year disease-free survival of HCC patients

表6 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞癌患者五年總體生存時(shí)間的因素Table 6 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 5-year overall survival of HCC patients

表7 單因素和多因素Cox回歸模型分析影響肝細(xì)胞癌患者五年無病生存時(shí)間的因素Table 7 Univariate and multivariate Cox regression analyses of factors affecting 5-year disease-free survival of HCC patients

3 討論

EIF5A2 最初是從原發(fā)性卵巢癌細(xì)胞系UACC-1598中分離出的一種候選癌基因，位于染色體3q26.2位點(diǎn)上[12]。EIF5A是一種包含特殊氨基酸8-羥基2，7，10-三氨基癸酸（hypusine）的細(xì)胞蛋白，其家族中的各個(gè)成員通過核糖體亞基和mRNA相互作用組成復(fù)合體，在蛋白質(zhì)的翻譯起始階段發(fā)揮作用[13]。EIF5A2作為EIF5A家族的重要一員，與另一成員EIF5A1的廣泛表達(dá)不同，EIF5A2只存在于特定的組織（睪丸、腦或部分惡性腫瘤）或細(xì)胞中[14]。EIF5A2參與了mRNA相關(guān)的核質(zhì)運(yùn)輸、轉(zhuǎn)錄和翻譯等功能，尤其在翻譯過程中起著核心作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)EIF5A2在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，促進(jìn)腫瘤形成和癌細(xì)胞生長，增加癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并通過多種手段（誘導(dǎo)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換、細(xì)胞骨架重排和代謝重編程等）促進(jìn)腫瘤耐藥[16]。

Zheng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，與非腫瘤組織相比，EIF5A2在膽囊癌組織中過表達(dá)。Lu等[18]通過免疫組織化學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)EIF5A2在72例前列腺癌組織中表達(dá)上調(diào)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR以及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)EIF5A2在3例前列腺癌組織中的表達(dá)水平高于癌旁非瘤組織。本研究采用免疫組織化學(xué)檢測284對(duì)HCC和相應(yīng)癌旁非瘤組織標(biāo)本，顯示EIF5A2在HCC組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，與上述結(jié)果一致。此外，我們還通過qRT-PCR和Western blot檢測了12對(duì)新鮮HCC及相應(yīng)癌旁非瘤組織中EIF5A2的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)EIF5A2在HCC中的mRNA和蛋白水平均上調(diào)。以上結(jié)果提示EIF5A2可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)生過程有關(guān)。

進(jìn)一步分析EIF5A2與肝細(xì)胞癌的臨床病理參數(shù)的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，EIF5A2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的腫瘤大小、腫瘤是否多發(fā)及分化程度有關(guān)。與高-中分化組相比，低分化肝細(xì)胞癌組中的EIF5A2表達(dá)水平明顯上調(diào)；腫瘤直徑≥5 cm組的EIF5A2表達(dá)水平高于腫瘤直徑＜5 cm組，這與Yang等[19]在胃癌中的研究結(jié)果一致，該研究發(fā)現(xiàn)EIF5A2的表達(dá)與胃癌的腫瘤大小相關(guān)；此外，腫瘤多發(fā)組中EIF5A2的表達(dá)水平高于腫瘤單發(fā)組，以上結(jié)果提示EIF5A2可能與肝細(xì)胞癌的發(fā)展過程有關(guān)。已有研究表明，EIF5A2在腫瘤增殖中發(fā)揮重要作用[20]，提示在肝細(xì)胞癌中，EIF5A2可能通過影響其增殖過程進(jìn)一步影響HCC的進(jìn)展。然而目前關(guān)于EIF5A2影響肝細(xì)胞癌增殖的具體分子機(jī)制研究較少，值得我們?cè)诮窈蟮难芯恐羞M(jìn)一步深入探討。

染色體3q26.2擴(kuò)增是在實(shí)體瘤中發(fā)現(xiàn)的最常見的遺傳改變之一，而位于染色體3q26的eIF5A2基因也經(jīng)常在多種人類惡性腫瘤中擴(kuò)增。Meng等[20]發(fā)現(xiàn)EIF5A2表達(dá)上調(diào)與胃癌患者預(yù)后差有關(guān)。在HGC27細(xì)胞中沉默EIF5A2可顯著降低細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)一步研究顯示EIF5A2可能通過上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（cyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白D3（cyclinD3）促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。Yang等[19]研究發(fā)現(xiàn)在胃癌組織中，EIF5A2表達(dá)上調(diào)患者的三年及五年術(shù)后總體生存時(shí)間較低表達(dá)者更短，并未對(duì)EIF5A2影響患者的術(shù)后無病生存時(shí)間進(jìn)行評(píng)估。我們應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)EIF5A2的HCC患者術(shù)后三年及五年總體生存時(shí)間和無病生存時(shí)間均較低表達(dá)者短；此外，我們還發(fā)現(xiàn)在腫瘤直徑≥5 cm的HCC患者中，EIF5A2高表達(dá)組的五年總體生存期和無病生存期較低表達(dá)組短。由于患者術(shù)后沒有經(jīng)過抗腫瘤治療，只進(jìn)行了營養(yǎng)支持治療，因此無法分析抗腫瘤治療是否對(duì)預(yù)后產(chǎn)生影響，有待在今后研究中加以探討。隨后進(jìn)一步行Cox回歸模型分析，發(fā)現(xiàn)EIF5A2的表達(dá)水平、腫瘤大小及腫瘤是否多發(fā)是影響HCC患者三年總體生存期和無病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素；EIF5A2的表達(dá)水平是影響HCC患者五年總體生存期和無病生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。以上Cox回歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果所顯示的因素有所不同，推測可能與樣本數(shù)量有關(guān)（284例HCC患者中術(shù)后滿三年病例數(shù)為250例，滿五年病例數(shù)僅83例），因此有待今后繼續(xù)隨訪，增加五年病例數(shù)進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)證實(shí)。綜合以上結(jié)果，提示EIF5A2高表達(dá)與HCC患者預(yù)后差關(guān)系密切，EIF5A2可能成為評(píng)估肝細(xì)胞癌患者術(shù)后生存期的潛在標(biāo)志物。

綜上所述，EIF5A2可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生及發(fā)展過程中扮演十分重要的角色，EIF5A2高表達(dá)的HCC患者術(shù)后預(yù)后不良，因此具有判斷HCC患者的預(yù)后指標(biāo)的潛在應(yīng)用價(jià)值，但EIF5A2在HCC中發(fā)揮的具體生物學(xué)作用及分子機(jī)制還需要在以后的研究中繼續(xù)探討。