QuEChERS-高效液相色譜法檢測牛肉中的阿維菌素類藥物殘留

張 偉，舒均喜，鄭 妍，李 存

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

QuEChERS-高效液相色譜法檢測牛肉中的阿維菌素類藥物殘留

張 偉，舒均喜，鄭 妍，李 存1*

(天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

旨在建立牛肉組織中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素和甲氨基阿維菌素等4種阿維菌素類藥物殘留的QuEChERS-高效液相色譜檢測方法。牛肉組織樣品攪碎后，乙腈兩次提取，QuEChERS凈化，氮氣吹干，含1-甲基咪唑和三氟乙酸酐的乙腈溶液衍生化，高效液相色譜-熒光檢測器檢測(激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長475 nm)。在0.1 μg/mL～2 μg/mL范圍內(nèi)4種藥物均呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)大于0.999。檢測限為2 μg/kg(S/N=3)，當(dāng)添加濃度為2、10、40 μg/kg時，4種藥物的平均回收率在77.3%～97.2%，日內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.05%～4.91%(n=5)，日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.27%～1.64%(n=3)。建立的方法簡便、靈敏、高效、安全，可用于動物組織中阿維菌素類藥物殘留的檢測。

阿維菌素類藥物；QuEChERS；高效液相色譜；多殘留檢測

阿維菌素類藥物(avermectins，AVMs)是由阿維鏈霉菌產(chǎn)生的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是良好的殺蟲劑[1]，對動物體內(nèi)和體外節(jié)肢動物都有高效的驅(qū)殺作用，作為農(nóng)藥和獸藥均使用廣泛[2]。但阿維菌素類藥物具有神經(jīng)和發(fā)育毒性，在動物組織中殘留時間較長，因此檢測此類藥物的殘留至關(guān)重要。目前WHO將其列為高毒物質(zhì)，其殘留問題引起了很多國家極大關(guān)注[3]，我國農(nóng)業(yè)部規(guī)定在牛、羊的肝、腎、肌肉、脂肪等組織中阿維菌素、伊維菌素和多拉菌素的最高殘留限量，其中阿維菌素在牛肉中最高殘留限量為100 μg/kg，伊維菌素或多拉菌素在牛肉中最高殘留限量為10 μg/kg[4]。

動物組織成分復(fù)雜，前處理起到去除雜質(zhì)、凈化樣品的作用，是儀器分析的前提，也是獸藥殘留分析的關(guān)鍵。前處理方法主要有固相萃取[5-6]、液相萃取[6-7]、免疫親和色譜萃取[8]等方法，固相萃取和液相萃取使用大量有機(jī)試劑，污染環(huán)境；免疫親和色譜需要特異性抗體，而抗體的制作費事費力，且凈化范圍有限。

QuEChERS即quick、easy、cheap、effective、rugged。QuEChERS樣品凈化是基于分散固相萃取建立起來的一種凈化方法，具有快速、簡單、便宜、高效、耐用和安全的特點[9]。通常含有提取劑乙腈、丙酮、乙酸乙酯或緩沖液等，脫水劑無水NaCl或無水MgSO4和凈化劑PSA(乙二胺-N-丙基)、C18等。作為藥物殘留的前處理方法，QuEChERS有機(jī)試劑應(yīng)用少，環(huán)境友好；特異性不強(qiáng)，可作為多類藥物的凈化方法[10-11]；處理時間短，能在30 min～40 min凈化10～20個樣品；操作簡便，無需高技能便可完成等優(yōu)點。本試驗采用QuEChERS對待檢牛肉組織樣品凈化后，進(jìn)行牛肉樣品中阿維菌素類藥物殘留的液相色譜檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 高效液相色譜儀配熒光檢測器(Agilent-1260)為安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；氮吹儀(DC-12)為上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品；微型漩渦混合儀(WH-2)為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品；恒溫水浴鍋(DC-12H)為上海安譜實驗科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要藥品試劑 阿維菌素(abamectin)，伊維菌素(ivermectin)，多拉菌素(doramectin)，甲氨基阿維菌素(emamectin benzoate)均為美國Sigma-Alorich公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)為天津康巢生物醫(yī)藥有限公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)為天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；三氟乙酸酐(分析純)為成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)；1-甲基咪唑(色譜純)為美國Sigma-Alorich公司產(chǎn)品；純凈水為娃哈哈公司產(chǎn)品；0.22 μm濾膜為天津市科億隆實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；衍生化試劑的配制，衍生化試劑A為1-甲基咪唑/乙腈=1/1；衍生化試劑B為三氟乙酸酐/乙腈=1/1，現(xiàn)用現(xiàn)配。(三氟乙酸酐使用前需過0.22 μm濾膜)

1.1.3 色譜條件 Eclipse plus C18色譜柱(3.5 μm，4.6 mm×100 mm)；流動相甲醇：水(95∶5)，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，熒光檢測器激發(fā)波長365 nm，發(fā)射波長475 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制 儲備液：分別稱取阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品100 mg，加入同一個10 mL容量瓶，少量甲醇溶解，甲醇定容至10 mL，配制成濃度為10 mg/mL的阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品混合溶液。

工作液：將阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素儲備液稀釋，配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL工作液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別取0.1、0.2、0.5、1、2 μg/mL阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素混合工作液40 μL，氮氣吹干，衍生化，液相色譜分離，熒光檢測器測定，以阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素的色譜峰面積對應(yīng)其濃度作線性回歸，分別得到阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 樣品前處理 準(zhǔn)確稱取2 g攪碎的牛肉樣品于15 mL離心管，加入5 mL 乙腈，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，將上清液移入另一個15 mL離心管，于樣品中再加入5 mL乙腈，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，合并上清液。50 ℃將上清液吹至2 mL，加入QuEChERS，渦旋振蕩2 min，10 000 r/min離心5 min，取上清，過0.22 μm濾膜，吹干，備用。

1.2.4 衍生化 將吹干的樣品加入衍生化試劑A，渦旋振蕩1 min，再加入衍生化試劑B，渦旋振蕩1 min，待液相色譜分析。

1.2.5 回收率及變異系數(shù)測定 設(shè)2、10、40 μg/kg三個添加水平，于2 g空白牛肉中添加0.1、0.5、2 μg/mL阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素標(biāo)準(zhǔn)品混合工作液40 μL，常溫振蕩1 h，使組織濃度分別為2、10、40 μg/kg，按照方法1.2.3～1.2.4處理添加樣品，液相色譜分析，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回收率，同一天重復(fù)5次，計算日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)測3 d，計算日間變異系數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 線性試驗

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素的線性方程見表1。由表1可見，4種藥物在0.1 μg/mL～2 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及相關(guān)系數(shù)

2.2 方法靈敏度

空白牛肉樣品和添加2 μg/kg阿維菌素類藥物后檢測結(jié)果見圖1。由圖1可見，阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素4個目標(biāo)峰分離良好，并且在目標(biāo)峰附近，無其他雜峰出現(xiàn)。按信噪比S/N=3為依據(jù)，將添加濃度2 μg/kg定為本方法的檢測限。

2.3 方法的添加回收率和精密度

在牛肉中添加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，同一天做5個重復(fù)樣品，計算日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)做3 d，計算日間變異系數(shù)。平均回收率、日內(nèi)變異系數(shù)及日間變異系數(shù)見表2；標(biāo)準(zhǔn)品和10 μg/kg樣品添加對照圖見圖2。從檢測數(shù)據(jù)可以看出，檢測方法的平均回收率為77.3%～97.2%，日內(nèi)變異系數(shù)為2.05%～4.91%，日間變異系數(shù)為0.27%～6.10%。由圖2可見，該方法比較穩(wěn)定，可以作為動物組織中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素殘留檢測方法使用，也為藥品測定及毒理學(xué)研究提供檢測依據(jù)。

3 討論

本試驗采用QuEChERS凈化，HPLC檢測牛肉中阿維菌素類藥物殘留，下面從凈化方法、液相色譜檢測方法及檢測結(jié)果三個方面進(jìn)行討論。

3.1 固相微萃取

QuEChERS是基于分散固相萃取建立起來的凈化方法，多應(yīng)用于農(nóng)殘檢測。在農(nóng)作物檢測中，農(nóng)殘多汁，萃取凈化中，無水MgSO4、NaCl主要用以除去萃取環(huán)境中的水分。PSA(乙二胺-N-丙基)可以除去有機(jī)酸和少量的色素(如葉綠素等)；C18能夠清除許多脂肪等非極性干擾物質(zhì)。

1.甲氨基阿維菌素；2.阿維菌素；3.多拉菌素；4.伊維菌素1.Emamectin benzoate; 2.Abamectin; 3.Doramectin; 4.Ivermectin

藥物名稱Samples添加濃度/(μg·kg-1)Spikinglevel日內(nèi)Intraday平均回收率/%Meanrecovery變異系數(shù)/%Coefficientofvariation日間Interday平均回收率/%Meanrecovery變異系數(shù)/%Coefficientofvariation阿維菌素Abamectin287.787.24.910.511080.079.13.461.644071.771.82.220.44伊維菌素Ivermectin297.397.22.930.271086.986.13.211.044076.176.52.911.28多拉菌素Doramectin293.393.34.280.861089.088.42.580.714079.279.32.050.53甲氨基阿維菌素Emamectinbenzoate291.792.34.130.511085.386.23.400.934079.277.82.831.50

與農(nóng)藥殘留不同，動物組織中水分含量少，且含有大量蛋白質(zhì)和脂肪，所以凈化過程需要考慮去除蛋白質(zhì)和脂肪，本試驗中對QuEChERS各種吸附劑粉末的用量進(jìn)行調(diào)整，減少了MgSO4、NaCl的含量，增加了C18的量，50 mg MgSO4，50 mg PSA、150 mg C18。通過調(diào)整，當(dāng)添加濃度為2、10、40 μg/kg時，阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、甲氨基阿維菌素4種藥物的回收率在77.3%～97.2%之間。

較用固相萃取C18柱做前處理[6]，使用QuEChERS做前處理，其有機(jī)試劑的用量大大減少，且操作步驟簡單，用時少，同時也保證了試驗的順利進(jìn)行。

3.2 檢測限、回收率和變異系數(shù)

本試驗采用液相色譜-熒光檢測阿維菌素類藥物的殘留，檢測限為2 μg/kg，我國要求伊維菌素和多拉菌素的最高殘留限量為牛肉中不超過10 mg/kg[4]，完全滿足國家對阿維菌素類藥物殘留檢測的要求。張偉等[12]采用液相色譜-紫外檢測器檢測水中阿維菌素的殘留，檢測限為100 μg/L。質(zhì)譜檢測該類物質(zhì)的檢測限低，且能檢測更多物質(zhì)[13-14]，但是質(zhì)譜價位高，一般為液相色譜的5～10倍，在基層應(yīng)用較少。免疫分析法分析樣品步驟簡單，快速，但是假陽性較高，且檢測范圍小。采用間接競爭酶聯(lián)免疫法只能檢測阿維菌素和伊維菌素兩種藥物[15]。

采用5 mL乙腈提取，回收率為55%左右，采用10 mL乙腈提取，回收率為60%左右，兩次采用5 mL乙腈提取，合并提取液，回收率在70%以上。因此，本試驗采用5 mL乙腈兩次提取的方法，提高回收率，同時也節(jié)省了有機(jī)試劑的使用。

1.甲氨基阿維菌素; 2.阿維菌素; 3.多拉菌素; 4.伊維菌素1.Emamectin benzoate; 2.Abamectin; 3.Doramectin; 4.Ivermectin

3.3 色譜條件優(yōu)化

文獻(xiàn)多用乙腈作為液相色譜的流動相[7]。本試驗采用甲醇和乙腈分別作為流動相，結(jié)果表明甲醇和乙腈均能很好的分離4種物質(zhì)，考慮到乙腈毒性較大，本實驗采用了甲醇∶水(95∶5)作為流動相。

本研究比較了250 mm的C18色譜柱和100 mm 的C18色譜柱，發(fā)現(xiàn)在現(xiàn)有液相色譜條件下，100 mm的C18柱就可以達(dá)到4種物質(zhì)的完全分離，峰型左右對稱，分離時間比250 mm色譜柱短。因此，本試驗采用了100 mm的C18色譜柱分離上述4種物質(zhì)。

[1] 陳杖榴,獸醫(yī)藥理學(xué)[M],北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2009:309.

[2] Shahla H B,Steven Ogbourne.Eco-toxicological effects of the avermectin family with a focus on abamectin and ivermectin[J].Chemosphere,2016,154:204-214.

[3] 何繼紅,申屠芬琴.阿維菌素類藥物殘留分析技術(shù)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(5):98-100.

[4] 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國農(nóng)業(yè)部235號公告,《動物性食品中獸藥最高殘留限量》[S].2002.

[5] Wang H,Wang Z J,Lin S Y,et al.Rapid method for multi-residue determination of avermectins in bovine liver using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J].B Environ Comtam Tox,2009,82(4):395-398.

[6] Danaher M,O’Keeffe M,Glennon J D.Development and optimization of an improved derivatisation procedure for the determination of avermectins and milbemycins in bovine liver[J].Analyst,2001,126(5):576-580.

[7] 侯曉林,何繼紅,杜向黨,等.牛肝中阿維菌素類藥物殘留的高效液相色譜熒光檢測方法的研究[J],畜牧獸醫(yī)學(xué)報,2006,37(5),500-503.

[8] Hou X L,Li X,Ding S Y,et al.Simultaneous analysis of avermectins in bovinet issues by LC-MS-MS with immunoaffinity chromatography clean up[J].Chromatographia,2006,63(11-12):543-550.

[9] Rahman M M,El-Aty A M A,Kim S W,et al.Quick,easy,cheap,effective,rugged,and safe sample preparation approach for peticide residue analysis using traditional detectors in chromatography:A review[J].J Sep Sci,2017,40(1):203-212.

[10] Kuzukiran O,Filazi A.Determination of selected polychlorinated biphenyl residues in meat products by QuEChERS method coupled with gas chromatography-mass spectrometry[J].Food Anal Meth,2016.9(7):1867-1875.

[11] Paz M,Correiasa L,Vidal C B,et al.Application of the QuEChERS method for the determination of organochlorine pesticide residues in Brazilian fruit pulps by GC-ECD[J].J Environ Sci Heal B,2017,52(1):48-58.

[12] 張 偉,張 鑫,張欣達(dá),等.分散液相微萃取-高效液相色譜聯(lián)用測定水中阿維菌素殘留[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(7):279-281.

[13] Xie Z J,Kong D Z,Liu L Q,et al.Development of ic-ELISA and lateral-flow immunochromatographic assay strip for the simultaneous detection of avermectin and ivermectin[J].Food Agr Immunol,2017,28(3):439-451.

[14] Kiljanek T,Niewiadowska A,Semeniuk S,et al.Multi-residue method for the determination of pesticides and pesticide metabolites in honeybees by liquid and gas chromatography coupled with tandem mass spectrometry-Honeybee poisoning incidents[J].J Chromatogr A,2016,1435:100-114.

[15] Ozdemir N,Kahraman T.Rapid confirmatory analysis of avermectin residues in milk by liquid chromatography tandem mass spectrometry[J].J Food Drug Anal,2016,24(1):90-94.

DeterminationofAvermectinsResiduesinBeefbyQuEChERS-HighPerformanceLiquidChromatography

ZHANG Wei,SHU Jun-xi,ZHENG Yan,LI Cun

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine,TianjinAgriculturalUniversity,Tianjin,300384,China)

A multiresidue detection method was developed for the determination of abamectin,ivermectin,doramectin,emamectin benzoate in beef using QuEChERS-High performance liquid chromatography.The homogenized samples were extracted by acetonitrile twice,cleaned up by QuEChERS,and then dried by nitrogen.After being derivatised by 1-methylimidazole and trifluoroacetic anhydride in acetonitrile,the samples were determined by high performance chromatography with fluorescence detection(excitation wavelength is 365 nm,emission wavelength is 475 nm).In the range of 0.1 μg/mL-2 μg/mL,the calibration curves of abamectin,ivermectin,doramectin and emamectin benzoate showed good linearity,with the correlation coefficients being higher than 0.999.The limits of detection were 2 μg/kg (S/N=3).At the spiked levels of 2,10,40 μg/kg,the average recoveries were in the range of 77.3%-97.2%,with the intraday relative standard deviations ranging from 2.05 to 4.91% (n=5) and the daytime relative standard deviations ranging from 0.27 to 1.64% (n=3).The procedure provided a simple,sensitive,reliable and safe method for routine residual analysis.

avermectins; QuEChERS; high performance liquid chromatography; multiresidue analysis

2017-07-03

天津市高等學(xué)?？萍及l(fā)展基金(20130623)；國家自然科學(xué)基金項目(31372482)

張 偉(1979-)，女，碩士，實驗師，主要從事獸醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究與應(yīng)用。*

O657.72；TQ572.48

A

1007-5038(2017)11-0056-05