豬源沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

蔣增海，徐耀輝*，鄧同煒，趙攀登

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

豬源沙門菌分離鑒定與耐藥性分析

蔣增海1,2，徐耀輝1,2*，鄧同煒1,2，趙攀登1,2

(1.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450046；2.河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南鄭州 450046)

2015年9月和2016年10月，河南省兩豬場(chǎng)暴發(fā)保育仔豬的急性死亡，為了弄清原因，采集心血、肺臟和肝臟病料，通過(guò)常規(guī)分離、PCR鑒定、生化試驗(yàn)，分離到2株沙門菌，分別命名為HenanSep1、HenanSq2N。小鼠致病性試驗(yàn)結(jié)果顯示，每只小鼠接種0.2 mL菌液，其濃度為5×108CFU/mL，均導(dǎo)致小鼠發(fā)病，但是無(wú)死亡。選取21種藥物，采用K-B法對(duì)2個(gè)分離株進(jìn)行藥物敏感性測(cè)定。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，2株沙門菌對(duì)頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑、氯霉素、恩諾沙星耐藥，對(duì)美羅培南、亞胺培南、氨曲南、多黏菌素B、土霉素敏感，對(duì)其他藥物敏感性不同。研究結(jié)果為豬沙門菌病臨床診斷與防治提供了重要依據(jù)。

豬；沙門菌；分離鑒定；藥敏試驗(yàn)

豬源沙門菌的血清型相當(dāng)復(fù)雜，豬沙門菌病主要由豬霍亂沙門菌(S.cholerasuis)、豬霍亂沙門菌Kunzendorf變型、豬傷寒沙門菌(S.typhisuis)、豬傷寒沙門菌Voldagsen變型、 鼠傷寒沙門菌(S.typhimurirum)、德爾陴沙門菌(S.derby)和腸炎沙門菌(S.enteritidis)等血清型引起[1]。 豬沙門菌病又稱為仔豬副傷寒，臨床上分為急性(敗血型)、亞急性和慢性。本病常引起較高的病死率,其中敗血型病死率達(dá)90%,慢性型病死率達(dá)25%～50%[2]。近年來(lái)，豬場(chǎng)仔豬副傷寒發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，葉潤(rùn)全等[3]報(bào)道從佛山周邊地區(qū)送檢獸醫(yī)院門診168份可疑病例中，經(jīng)病原分離鑒定，分離到沙門菌51例，分離率達(dá)30.4%；據(jù)報(bào)道[4]，上海寶山地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)衛(wèi)生管理規(guī)范、飼養(yǎng)環(huán)境較好的豬場(chǎng)，豬霍亂沙門菌血清陽(yáng)性率就低(10%)，而比較臟亂差且飼養(yǎng)密度大的豬場(chǎng)陽(yáng)性率就高(可達(dá)75%)。由于豬沙門菌血清型眾多，加之豬場(chǎng)不重視仔豬副傷寒的免疫，獸醫(yī)臨床濫用抗生素，因此仔豬副傷寒報(bào)道病例[5-9]較多在所難免，應(yīng)引起重視。為弄清河南2個(gè)豬場(chǎng)保育仔豬急性死亡病因，總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)，區(qū)別豬瘟、豬藍(lán)耳病或豬鏈球菌病，開展了本次研究，為豬沙門菌病的診斷與防控提供重要參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料 采集河南2個(gè)豬場(chǎng)保育仔豬急性死亡典型病例的病料；臨床上，均表現(xiàn)為呼吸困難，咳嗽，精神不振，皮膚紫紅色斑點(diǎn)，體溫升高，后期拉稀，使用過(guò)氟苯尼考、替米考星等藥物，療效不佳，病死率50%～60%；病變?yōu)榉闻K出血點(diǎn)，有的肝臟有一層纖維素性薄膜覆蓋，并且有白色壞死點(diǎn)，腹股溝淺淋巴結(jié)腫大出血，腸系膜淋巴結(jié)索狀腫大，膽汁充盈。

1.1.2 培養(yǎng)基 普通營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂及SS瓊脂均為北京奧博星有限責(zé)任公司產(chǎn)品；50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板為鄭州博賽生物有限公司產(chǎn)品；TSA(胰蛋白大豆瓊脂)、TSB(胰蛋白大豆肉湯)為美國(guó)BD(Becton,dickinson and company)公司產(chǎn)品；MH瓊脂為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；TSA平板、TSB肉湯配制時(shí)，分別添加煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(縮寫NAD，終濃度為10 mg/L)和犢牛血清(終濃度50 mL/L)。

1.1.3 藥敏片 卡那霉素(K)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)，氨芐西林(AMP)，阿莫西林-克拉維酸(AMC)，頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑林(KZ)，頭孢曲松(CRO)，美羅培南(MEM)、亞胺培南(IPM)，氨曲南(ATM)，四環(huán)素(TE)、土霉素(OT)，多黏菌素B(PB)，氯霉素(C)，恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)，磺胺甲惡唑(SXT)/甲氧芐啶、磺胺異惡唑(SF)、呋喃妥因(F)，均為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品。

1.1.4 其他主要試劑 犢牛血清為杭州四季青生物有限公司產(chǎn)品；NAD為Roche公司產(chǎn)品，使用前均需過(guò)濾除菌；2×TaqPCR Master Mix為南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品；DNA Marker DL 2 000為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;各種生化試管均為青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;大腸埃希菌ATCC25922質(zhì)控菌株由揚(yáng)州大學(xué)人獸共患病學(xué)江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；麥?zhǔn)媳葷峁転閺V東環(huán)凱微生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病菌分離、純化 無(wú)菌采集典型病例的心血、肺臟、肝臟，分別接種于TSA平板(加有犢牛血清、NAD)、5%綿羊血瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂，37℃恒溫箱，培養(yǎng)24 h～48 h，進(jìn)一步用相同培養(yǎng)基純化傳代2～3次；然后將純化的分離菌接種于SS瓊脂平板，挑取單個(gè)菌落保存在20%的無(wú)菌甘油中，然后放在-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 染色鏡檢 將純化的分離菌，革蘭染色，顯微鏡下觀察細(xì)菌形狀和大小。

1.2.3 PCR鑒定 按照參考文獻(xiàn)[11]設(shè)計(jì)一對(duì)引物，上游引物Sal1:5′-CAGGATACCTATAGTGCTGC-3′，下游引物Sal2：5′-CGCACCGTCAAAGGAACCGT-3。將純化后的分離菌，接種TSB肉湯增菌后，用煮沸法提取細(xì)菌的DNA，作為PCR反應(yīng)模板。PCR體系為25 μL，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃ 4 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L凝膠電泳檢測(cè)，若與預(yù)期條帶580 bp左右一致，即為陽(yáng)性。

1.2.4 生化試驗(yàn) 按照生產(chǎn)廠家說(shuō)明書操作。

1.2.5 小鼠致病性試驗(yàn) 將分離菌在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂復(fù)活培養(yǎng)12 h后，挑取單菌落，無(wú)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，使用營(yíng)養(yǎng)肉湯將其稀釋為5×108CFU/mL菌液,每只小鼠腹腔接種0.2 mL，共接種4只；同時(shí)選擇4只小鼠作為對(duì)照組，每只小鼠腹腔接種無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯0.2 mL。接種后，觀察1周，記錄接種后小鼠臨床表現(xiàn)。

1.2.6 藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì) (Clinical and laboratory standards institute,CLSI)手冊(cè)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)[12]，以E.coli(ATCC25922)為質(zhì)控菌株，測(cè)定分離菌株的藥物敏感性。首先將保存于-80℃分離菌在普通培養(yǎng)基上劃線復(fù)活，培養(yǎng)18 h～24 h，挑取培養(yǎng)好的單個(gè)菌落4～6個(gè)，接種于5 mL肉湯中，放置搖床，37℃恒溫，振蕩培養(yǎng)2 h～6 h；然后取出，對(duì)比0.5和1.0麥?zhǔn)媳葷峁?，使菌懸液的濃度在二者之間且更接近于0.5麥?zhǔn)媳葷峁艿臐舛?，若濃度偏高可用無(wú)菌肉湯進(jìn)行稀釋；將稀釋好的培養(yǎng)菌懸液在15 min內(nèi)，用無(wú)菌棉簽均勻涂于MH培養(yǎng)基上，重復(fù)兩遍；然后將藥敏片貼于其表面；將貼有藥敏片的平板15 min內(nèi)，放于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)16 h～18 h，取出后用直尺測(cè)量其直徑。

2 結(jié)果

2.1 分離、培養(yǎng)特征

無(wú)菌采集心血、肺臟或者肝臟，分別接種于TSA平板(加有犢牛血清、NAD)、50 mL/L綿羊鮮血瓊脂平板、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24 h～48 h后，在同一種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)為相似菌落，純化后，37℃培養(yǎng)24 h，在50 g/L綿羊血瓊脂平板生長(zhǎng)為無(wú)色透明、圓形、邊緣整齊、濕潤(rùn)的大小約為0.5 mm～2 mm菌落，菌臺(tái)生長(zhǎng)為奶油狀；分別純化后，接種于SS瓊脂平板，HenanSep1生長(zhǎng)為無(wú)色透明、細(xì)小、圓形、光滑、中央無(wú)黑色點(diǎn)菌落，HenanSq2N生長(zhǎng)為無(wú)色透明、細(xì)小、圓形、光滑、中央為黑色小點(diǎn)菌落。

2.2 染色、鏡檢

革蘭氏染色，顯微鏡下觀察到2株分離菌，均為革蘭陰性、桿狀、中等大小(圖1和圖2)。

2.3 PCR鑒定

將分離的2株疑似沙門菌復(fù)活，TSB增菌培養(yǎng)后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，結(jié)果表明PCR擴(kuò)增大小為于500 bp～750 bp(圖3)，與預(yù)期PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段580 bp大小一致，表明2株分離菌均為沙門菌。

2.4 生化試驗(yàn)

生化試驗(yàn)結(jié)果符合沙門菌生化特征，因此將2株分離菌鑒定為沙門菌(表1)。

表1 生化試驗(yàn)結(jié)果

注:“ +” 產(chǎn)酸 ;“ -” 陰性;“⊕” 產(chǎn)酸產(chǎn)氣。

Note：“ +”Acid production ;“ -” Negative;“⊕”Acid and gas production.

2.5 小鼠致病性試驗(yàn)

接種HenanSep1菌10 h后開始出現(xiàn)臨床癥狀，接種HenanSq2N菌16 h開始出現(xiàn)臨床癥狀，均表現(xiàn)為精神不振、蹲伏、不愿活動(dòng)、毛蓬松、怕冷、不愿采食等，持續(xù)觀察1周無(wú)死亡，但是逐漸消瘦；而對(duì)照組，4只小鼠均活潑亂跳，無(wú)臨床表現(xiàn)。結(jié)果表明2株沙門菌對(duì)小鼠均具有致病性。

2.6 藥敏試驗(yàn)

將分離保存的2株沙門菌分別做藥敏試驗(yàn)(表2)。2株沙門菌對(duì)頭孢噻呋、氨芐西林、氯霉素、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑抑菌圈為零，屬于完全耐藥，同時(shí)對(duì)恩諾沙星也耐藥；對(duì)美羅培南、亞胺培南、氨曲南、頭孢曲松、多粘菌素B、土霉素等敏感，對(duì)其他藥物敏感性不同。

3 討論

自1885年Salmon等分離得到豬霍亂沙門菌以來(lái),目前已檢出沙門菌血清型2 500余種,我國(guó)已有292個(gè)血清型報(bào)道[13]。沙門菌在自然界中十分普遍，是一種條件致病菌，對(duì)家養(yǎng)畜禽健康、人類公共安全、食品安全都具有嚴(yán)重的影響，是一種重要的人獸共患病病原。豬可感染多個(gè)血清型，除豬霍亂沙門菌和鼠傷寒沙門菌外，很少有其他血清型能引起臨床發(fā)病，但這些對(duì)豬非致病性的血清型可造成豬肉產(chǎn)品的感染，在公共衛(wèi)生上具有重要意義[14]。本研究中，2例仔豬發(fā)病，分別采集典型病例的心血、肺臟、肝臟，接種各種培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h～48 h，在相同培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)為同一種類型菌落，推測(cè)在典型病例的心血、肺臟以及肝臟中，均存在這種病原菌，通過(guò)常規(guī)鑒定、生化鑒定、PCR鑒定，確定為沙門菌，小鼠致病性試驗(yàn)具有致病性，結(jié)合流行病學(xué)、臨床癥狀和病理變化，將兩次病例確診為仔豬副傷寒。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

注：S.敏感；I.中介 ；R.耐藥。

Note:S.Sensitive；I.Intermediary ； R.Resistance.

仔豬副傷寒臨床上，很容易與豬藍(lán)耳病、豬瘟、豬鏈球菌病、急性胸膜肺炎、副豬嗜血桿菌病等病混淆，導(dǎo)致誤診。孫華偉等[9]報(bào)道一起肥育豬沙門菌病被誤診為豬藍(lán)耳病的病例，反映出基層散養(yǎng)戶普遍存在一個(gè)誤區(qū)，即只要豬耳朵出現(xiàn)發(fā)紺就懷疑是豬藍(lán)耳病，豬沙門菌病作為老病和二類動(dòng)物傳染病不被重視。本研究為了確診病例是否存在副豬嗜血桿菌或者而傳染性胸膜肺炎放線桿菌感染，選擇了這兩種菌能生長(zhǎng)的TSA平板(加有犢牛血清、NAD)培養(yǎng)，但是均未培養(yǎng)出相應(yīng)的病菌。

藥敏試驗(yàn)表明，2株沙門菌對(duì)獸醫(yī)臨床上常用藥物頭孢噻呋、氨芐西林、磺胺甲惡唑/甲氧芐啶、磺胺異惡唑、恩諾沙星均耐藥，但對(duì)人用藥物美羅培南、亞胺培南、氨曲南、頭孢曲松敏感性好；然而獸醫(yī)臨床禁止使用藥物氯霉素也完全耐藥，推測(cè)與獸醫(yī)臨床長(zhǎng)期使用氯霉素類藥物氟苯尼考有關(guān)，據(jù)養(yǎng)殖戶反應(yīng)上述兩次病例中，均使用過(guò)氟苯尼考、替米考星等藥物治療，但是無(wú)效，病死率依舊高達(dá)50%～60%；2株沙門菌對(duì)土霉素、多黏菌素敏感，提示臨床上可嘗試選用這兩種藥物治療仔豬副傷寒。本研究結(jié)果表明對(duì)氨芐西林100%耐藥，對(duì)碳青霉烯類美羅培南、亞胺培南敏感，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[10]，提示臨床上治療仔豬副傷寒選擇氨芐西林要謹(jǐn)慎。

對(duì)豬沙門菌防控最關(guān)鍵的是良好的飼養(yǎng)管理,對(duì)豬舍嚴(yán)格消毒，改善飼養(yǎng)管理與環(huán)境衛(wèi)生、減少豬應(yīng)激，對(duì)飲水、飼料等均應(yīng)執(zhí)行嚴(yán)格的獸醫(yī)衛(wèi)生管理，提高豬體自身免疫力，才能有利于控制沙門菌病的暴發(fā)，特別是季節(jié)交替，天氣驟變，長(zhǎng)途運(yùn)輸?shù)葠毫忧闆r下仔豬的預(yù)防更為重要。對(duì)于季節(jié)更替和仔豬斷奶前后，可選擇合適仔豬副傷寒疫苗免疫。

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Isolation,IdentificationandDrugResistanceAnalysisofSalmonellaIsolatesfromPiglets

JIANG Zeng-hai1,2,XU Yao-hui1,2，DENG Tong-wei1,2,ZHAO Pan-deng1,2

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou,Henan,450046,China；2.HenanEngineeringandTechnologyResearchCenterofVeterinaryBiotechnology,Zhengzhou,Henan,450046,China)

In order to clarify the etiology of two cases of swine diseases,we collected the heart blood,lung and liver from diseased or dead piglets in two pig farms located in Henan province,China in September 2105 and October 2106.TwoSalmonellaisolates were obtained by the conventional isolation,PCR identification and biochemical identification,being named asSalmonellaHenanSep1 andSalmonellaHenanSq2N respectivly.The result of pathogenicity test in mice indicated that all of mice were sick rather than dead after inoculation with 0.2 mL 5×108CFU/mL concentration of 2Salmonellaisolates.Antimicrobial susceptibility of 2Salmonellaisolates was determined using 21 drugs by Kirby-Bauer method.The results showed that both of 2Salmonellaisolates were resistant to ceftiofur,ampicillin,sulfamethoxazole/trimethoprim,sulfamethoxazole,chloramphenicol,and enrofloxacin,being sensitive to meropenem,imipenem,aztreonam,polymyxin B,and oxytetracycline.This study provided an important basis for the clinical diagnosis and prevention of swine salmonellosis.

pigs;Salmonella; isolation and identification; antimicrobial susceptibility test

2017-03-04

河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(162102110144)；江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題(R1407)；河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目(MXK2016102)

蔣增海(1976-)，男，四川簡(jiǎn)陽(yáng)人，講師，博士，主要從事豬病原微生物學(xué)研究。*

S852.612

B

1007-5038(2017)11-0121-05