甘肅地區(qū)453例宮頸鱗癌患者人乳頭瘤病毒（HPV）感染亞型及其年齡分布的研究

周慶云，趙 潔，王梓欣，王東存，孫建平

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

甘肅地區(qū)453例宮頸鱗癌患者人乳頭瘤病毒（HPV）感染亞型及其年齡分布的研究

周慶云，趙 潔，王梓欣*，王東存，孫建平

（甘肅省婦幼保健院，甘肅 蘭州 730050）

目的 研究甘肅地區(qū)宮頸鱗癌患者感染人乳頭瘤病毒（HPV）的基因亞型及其年齡分布特點(diǎn)，為甘肅地區(qū)臨床防治宮頸癌、制訂適合我國(guó)臨床遵循的宮頸癌篩查相關(guān)指南、研制適合本地區(qū)的預(yù)防性HPV疫苗提供流行病學(xué)資料。方法 采用醫(yī)用核酸分子快速導(dǎo)流雜交基因芯片技術(shù)（Hybrimax），對(duì)453例甘肅省內(nèi)經(jīng)我院病理確診為宮頸鱗癌患者的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行21種HPV亞型感染檢測(cè)，研究人乳頭瘤病毒感染亞型與宮頸鱗癌的相關(guān)性。結(jié)果 宮頸鱗癌患者中35歲以下所占比例最少，為5．30%，45～54歲的占比最多，為46．36%；453例宮頸鱗癌患者中有435例HPV陽性，陽性率96．03%；共檢測(cè)到17 種 HPV 亞 型 ， 其 中 高 危 型 13 種（HPV16、HPV18、HPV58、HPV33、HPV31、HPV52、HPV68、HPV39、HPV51、HPV53、HPV45、HPV56、HPV59），低危型 4 種（HPV44、HPV42、HPV43、HPV81），未檢測(cè)到 HPV35、HPV66、HPV6、HPV11 亞型；HPV16 感染率最高，為 77．01%，其次為 HPV18（6．44%）、HPV58（5．98%）、HPV33（3．22%）；HPV 單一感染 386 例，感染率為88．74%（386/435）。結(jié)論 甘肅地區(qū)宮頸鱗癌高發(fā)年齡為45～54歲，35歲以下患者最少；高危型HPV16、HPV18、HPV58、HPV33是甘肅地區(qū)宮頸鱗癌的主要感染亞型，特別是HPV16單一感染可能更易導(dǎo)致宮頸鱗癌的發(fā)生。

宮頸鱗癌；人乳頭瘤病毒；基因亞型；年齡

宮頸癌是嚴(yán)重威脅女性生命和健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于乳腺癌，在全球婦女癌癥死亡率中居第二位，在一些發(fā)展中國(guó)家甚至居首位。目前已經(jīng)明確高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌的病因[1]。其中HPV16、HPV18與世界上70%的浸潤(rùn)性宮頸癌相關(guān)[2－3]。本研究通過檢測(cè)甘肅省內(nèi)宮頸鱗癌患者感染人乳頭瘤病毒（HPV）的基因亞型及年齡分布特點(diǎn)，以探討不同基因亞型HPV感染的致癌性，對(duì)本地區(qū)婦女宮頸癌的早期篩查、早期發(fā)現(xiàn)和早期診治具有重要價(jià)值，可為HPV疫苗的研制開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)介紹如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

2014年5月—2017年2月在甘肅省婦幼保健院婦科門診和住院，未經(jīng)放療、化療，經(jīng)我院病理確診為宮頸鱗癌的患者共453例，年齡26～79歲，平均年齡49．08歲，均為已婚婦女，來源于甘肅省內(nèi)。取患者的宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行21種HPV基因亞型感染檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑

主要包括HPV－DNA提取試劑盒，PCR擴(kuò)增儀，Hybrimax醫(yī)用核酸分子快速雜交儀，人乳頭瘤病毒基因微陣列分型檢測(cè)試劑盒（均由香港凱普公司提供）。

1.3 標(biāo)本采集和保存

采用窺陰器充分暴露宮頸，用棉拭子擦去宮頸口過多的分泌物，用凱普公司配套專用宮頸刷置于宮頸口，沿順時(shí)針旋轉(zhuǎn)5周，慢慢抽出，以獲得足夠的移行區(qū)上皮細(xì)胞樣本，放入3 ml專用細(xì)胞保存液中，沿刷柄折痕處將宮頸刷柄折斷，旋緊管蓋，做好樣本標(biāo)記，立即送檢或放入4℃冰箱中，3天內(nèi)檢驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)方法

HPV基因分型檢測(cè)步驟：（1）樣本DNA提取：取樣本500 μl，以14 000 r/min離心1分鐘，棄上清液后，用凱普公司試劑盒提取DNA。（2）PCR擴(kuò)增：將PCR反應(yīng)試劑及Taq酶按比例混合后加入24 μl至反應(yīng)管，再加入DNA模板1 μl，混勻后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。每一批同時(shí)擴(kuò)增HPV18型陽性對(duì)照及陰性對(duì)照各一份。（3）核酸分子快速導(dǎo)流雜交：采用凱普醫(yī)用核酸分子快速導(dǎo)流雜交儀（Hybrimax）及配套試劑盒，在雜交平臺(tái)上放入標(biāo)記有21種HPV基因型寡核苷酸探針的低密度基因芯片雜交膜，按試劑盒說明進(jìn)行導(dǎo)流雜交，酶標(biāo)顯色。（4）結(jié)果判斷：肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果，陽性點(diǎn)為清晰可見的藍(lán)紫色圓點(diǎn)，根據(jù)膜條HPV亞型分布圖，判斷陽性點(diǎn)為何種HPV病毒亞型。本檢測(cè)將HPV分為21種亞型，其中15種為高危亞型：HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV56、HPV58、HPV59、HPV66、HPV68，6 種 為 低 危 亞 型 ：HPV6、HPV11、HPV42、HPV43、HPV44、HPV81。有兩型或兩型以上者為多重感染，對(duì)多重感染者，各亞型的陽性率重復(fù)計(jì)算。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以百分率作為HPV感染的評(píng)價(jià)指標(biāo)，HPV檢出率采用χ2檢驗(yàn)，P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 宮頸鱗癌患者年齡分布

在453例26～79歲的宮頸鱗癌患者中，小于35歲所占比例最少，為 5．30%；45～54 歲所占比例最多，為 46．36%，見表 1。

表1 宮頸鱗癌患者年齡分布

2.2 宮頸鱗癌HPV感染亞型分布

453例宮頸鱗癌患者中，有435例HPV陽性，陽性率96．03%。21種HPV亞型共檢測(cè)到17種，其中高危型13種（HPV16、HPV18、HPV58、HPV33、HPV31、HPV52、HPV68、HPV39、HPV51、HPV53、HPV45、HPV56、HPV59），低危型 4 種（HPV44、HPV42、HPV43、HPV81），未檢測(cè)到 HPV35、HPV66、HPV6、HPV11 亞型。感染HPV16的共343例，感染率最高，占78．85%（343/435），其他亞型感染率由高到低依次為 HPV18、HPV58、HPV33、HPV31、HPV52、HPV68、HPV39、HPV51、HPV53、HPV45、HPV56、HPV59、HPV44、HPV81、HPV42、HPV43，見表 2。

表2 435例HPV陽性標(biāo)本中各基因亞型分布

2.3 HPV單一感染和多重感染與宮頸鱗癌的關(guān)系

本研究中HPV陽性患者共435例，其中單一感染386例，占 88．74%（386/435）。在多重感染的 49 例（11．26%）中，二重感染最多見，為46例，占多重感染的93．88%，最常見的是HPV16型合并其他亞型的二重感染，共39例，占多重感染的79．59%（39/49）；三重感染3例，其中2例是HPV16型合并其他亞型的感染，檢測(cè)出的低危亞型均與高危亞型合并感染。宮頸鱗癌HPV感染主要亞型的單一感染與多重感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），見表 3。

表3 宮頸鱗癌HPV感染主要亞型的單一感染與多重感染情況[n（%）]

3 討論

大量流行病學(xué)和分子生物學(xué)研究資料表明，HPV與宮頸癌及癌前病變密切相關(guān)[4]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)兩百多種亞型的HPV，根據(jù)其致病性的差異，將其分為高危型和低危型兩大類[5]，長(zhǎng)期持續(xù)感染高危型可以致癌，危及生命。在本研究中，宮頸鱗癌HPV陽性率為96．03%，低危亞型僅檢出6例，并且均與高危亞型HPV16合并感染，充分證實(shí)了只有感染高危亞型HPV才會(huì)引發(fā)宮頸癌的觀點(diǎn)。

3.1 宮頸鱗癌年齡分布有一定地域性

大多數(shù)宮頸鱗癌患者的診斷年齡為45～50歲，年齡范圍17～90歲[6]。本研究中年齡45～54歲宮頸鱗癌患者在所有患者中占46．36%，接近一半，與文獻(xiàn)結(jié)果一致。近年來人們?cè)絹碓秸J(rèn)識(shí)到宮頸癌可以發(fā)生在35歲以下的女性中，在美國(guó)，浸潤(rùn)性宮頸癌的所有患者中，35歲以下患者占22．1%[6]。本研究中35歲以下宮頸鱗癌患者的占比最少，僅為5．30%，遠(yuǎn)低于美國(guó)的患病率，說明35歲以下女性宮頸癌患病率存在種族差異及地域性。美國(guó)2012年宮頸癌篩查指南中，對(duì)象為30歲以上婦女[7]，是否適用于我國(guó)有待進(jìn)一步研究。

3.2 宮頸鱗癌組織中主要感染的HPV亞型存在地理差異

亞洲婦女宮頸癌中常見HPV亞型最新報(bào)道顯示[8]：在西亞和東亞地區(qū)，HPV16和HPV18亞型是感染率最高的前兩位。其他常見的HPV感染亞型排序有所差異。在西亞地區(qū)，HPV45、HPV33、HPV31、HPV35、HPV58、HPV52、HPV56 和 HPV59 為繼HPV16和HPV18亞型后最常見的8種HPV亞型；而在東亞地區(qū)，則 為 HPV58、HPV33、HPV52、HPV45、HPV31、HPV59、HPV39、HPV35。本研究顯示，宮頸鱗癌患者感染了17種HPV亞型，主要是 HPV16、HPV18 及 HPV58、HPV33、HPV31、HPV52、HPV68、HPV39、HPV51、HPV53，主要感染亞型與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致，符合東亞人群研究結(jié)果。近年國(guó)內(nèi)喻朝霞等[9]報(bào)道南方地區(qū)宮頸鱗癌患者HPV主要感染亞型依次為HPV16、HPV18、HPV33、HPV58、HPV31、HPV52、HPV59、HPV45；陶萍萍等[10]報(bào)道北京宮頸癌患者 HPV主要感染亞型依次為 HPV16、HPV18、HPV52、HPV58、HPV33。這說明國(guó)內(nèi)南方及北方不同地區(qū)宮頸癌主要感染亞型存在一致性，同時(shí)也存在一定的地理差異。在我們的研究資料中，宮頸鱗癌主要感染亞型為HPV16、HPV18，與國(guó)內(nèi)研究結(jié)果具有一致性，其他亞型排序均不同，有一定的地域性，值得重視。

3.3 單一感染較多重感染更有可能增加宮頸鱗癌的發(fā)病率

HPV的多重感染是否會(huì)促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生目前研究觀點(diǎn)不一致，有學(xué)者認(rèn)為多重感染并不增加宮頸癌的發(fā)病率[4]；但也有學(xué)者認(rèn)為多重感染可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，并使治療棘手[11]。本研究中，宮頸鱗癌單一感染和多重感染比為7．88∶1，單一感染明顯高于多重感染，宮頸鱗癌HPV感染主要亞型單一感染與多重感染比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），與第一種觀點(diǎn)一致。在一定程度上說明單一感染對(duì)宮頸鱗癌的發(fā)展起促進(jìn)作用，但其具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

Clifford等[12]發(fā)現(xiàn)HPV16在宮頸浸潤(rùn)癌（SCC）患者中的檢出率是在LSIL（低度鱗狀上皮內(nèi)病變）中檢出率的2倍，HPV18是1．5倍，說明感染HPV16、HPV18更易進(jìn)展為宮頸浸潤(rùn)癌。研究資料表明，HPV16的感染由于清除率降低可能更易導(dǎo)致持續(xù)性感染，發(fā)生CINⅡ、CINⅢ，甚至SCC[13]。本研究宮頸鱗癌中HPV16感染率高達(dá)77．01%，且HPV單一感染占居首位，表明甘肅地區(qū)HPV16單一感染可能更易導(dǎo)致宮頸鱗癌的發(fā)生。因此對(duì)于HPV感染患者，不僅要重視其是否已經(jīng)發(fā)生宮頸病變，積極進(jìn)行臨床治療，還要重視其所感染的HPV具體亞型，特別應(yīng)對(duì)感染HPV16亞型的患者密切隨診，以便及早發(fā)現(xiàn)異常、及早干預(yù)，有效降低宮頸癌的發(fā)生。

中國(guó)幅員遼闊，不同地區(qū)及民族宮頸癌的HPV主要感染亞型不同。明確一個(gè)地區(qū)HPV致癌的主要亞型，可根據(jù)感染亞型預(yù)測(cè)病情進(jìn)展，評(píng)估預(yù)后，指導(dǎo)臨床醫(yī)生制訂合理的診治方案，避免過度診斷及治療，同時(shí)為研制適合中國(guó)乃至本地區(qū)易感人群的HPV疫苗提供流行病學(xué)資料。

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R195

B

1671－1246（2017）24－0109－03

（*

王梓欣）