軟棗獼猴桃多糖、黃酮提取工藝的優(yōu)化及抗氧化活性

何婷婷　柴軍紅　金志民　宛春雷　張蕾

摘要：以提高軟棗獼猴桃中的總黃酮、多糖提取為目標，經(jīng)過提取方法對比及正交設(shè)計試驗，優(yōu)化總黃酮、多糖的提取工藝，研究其抗氧化活性。結(jié)果表明，影響提取工藝的因素由高到低為復(fù)合酶濃度>提取時間>料液比>提取功率，最佳工藝參數(shù)為05%纖維素+04%果膠復(fù)合酶濃度、料液比1 g ∶15 mL、提取時間10 min、微波功率300 W，此時其加權(quán)收率為6754 3，并經(jīng)驗證具有較好的穩(wěn)定性；提取物濃度超過08 mgmL時，對羥基自由基、超氧陰離子自由基的清除率在7000%以上。

關(guān)鍵詞：軟棗獼猴桃；總黃酮；多糖；提取工藝；優(yōu)化條件；抗氧化；穩(wěn)定性

中圖分類號： TS2011文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）21-0199-03

收稿日期：2016-05-26

基金項目：牡丹江師范學院國家級課題培育項目（編號：GP201609）；牡丹江師范學院國家預(yù)研項目（編號：GY201307）；黑龍江省牡丹江市科技攻關(guān)（編號：G2014d1509、G2012d1082）。

作者簡介：何婷婷（1983—），女，黑龍江牡丹江人，博士，講師，從事藥用植物學研究。E-mail：swxhtt@126com。

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為獼猴桃科獼猴桃屬植物，果實多汁，富含維生素C、維生素B、胡蘿卜素及衍生物質(zhì)、皂苷、黃酮、多糖等多種藥理活性成分1-2]，對高血壓、心絞痛、高血脂、腫瘤等有一定療效，其中多糖物質(zhì)對胃腫瘤有顯著抑制作用，抑制率高達964%3]，此外軟棗還具有一定的降血糖、抗病毒、改善視力、提高耐力等作用4]?，F(xiàn)代藥理研究表明，軟棗獼猴桃的藥理作用與其含有黃酮、多糖等成分有密切關(guān)系，因此進一步加強軟棗獼猴桃黃酮、多糖的提取工藝研究，加快其資源開發(fā)利用很有必要。

現(xiàn)階段，軟棗獼猴桃的黃酮、多糖提取主要集中在單指標工藝研究，不能很好地評價其提取工藝優(yōu)劣，且未系統(tǒng)研究各種提取方法之間的差異。本研究以黑龍江省牡丹江市橫道河地區(qū)生產(chǎn)、經(jīng)牡丹江師范學院于爽教授鑒定的軟棗獼猴桃（標本現(xiàn)存于牡丹江師范學院標本室）為材料，比較常規(guī)提取法、閃式提取法、超聲波提取法、酶促-微波提取法等對軟棗獼猴桃中總黃酮、多糖的提取效果，并采用含量加權(quán)法、正交試驗法優(yōu)化工藝參數(shù)，進行體外抗氧化研究，以期為軟棗獼猴桃的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

11主要試劑

葡萄糖，由上海國藥集團生產(chǎn)；濃硫酸，由天津市晶科化工有限公司；三氯甲烷、乙酸乙酯，均由天津大茂化學試劑廠生產(chǎn)；蕓香苷標準品，純度>99%，由貴州迪大生物技術(shù)公司生產(chǎn)；乙醇、甲醇、鹽酸、苯酚，均由沈陽試劑五廠生產(chǎn)；果膠酶、纖維素酶R-10，由日本W(wǎng)olsen生產(chǎn)。

12主要儀器

T6紫外可見分光光度計，由北京普析通用儀器公司生產(chǎn)；BT25S電子天平，由德國賽多利斯集團生產(chǎn)；R210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，由瑞士Buchi生產(chǎn)；SL-2010N超聲波提取器，由江蘇省南京順流設(shè)備有限公司生產(chǎn)；MCR-3型實驗微波提取器，由廣東省廣州予華設(shè)備有限公司生產(chǎn)；JHBE-50T閃式提取器，由江蘇省南京庚辰科學儀器有限公司生產(chǎn)。

13提取總黃酮和多糖的對比試驗

131提取溶劑精確稱取軟棗獼猴桃200 g，分別以三氯甲烷、乙酸乙酯、乙醇、甲醇及水等作為提取溶劑，料液比1 ∶10（gmL），超聲波法提取30～40 min；回收溶劑，濃縮，乙醇沉淀，冷凍干燥即獲得多糖。將醇沉后的溶液回收乙醇，濃縮，干燥，測定總黃酮。多糖含量測定以葡萄糖為對照品，采用硫酸-苯酚顯色法，采用紫外可見分光光度計測定波長為490 nm的吸光度，計算多糖含量；總黃酮測定以蕓香苷為對照品，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法，采用紫外可見分光光度計測定波長為505 nm的吸光度，測定總黃酮含量。多糖對照品在23～23 μgmL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=0017 5x+0017 6（r2=0999 3）；蕓香苷對照品在0110 3～0661 8 mgmL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為y=0581 1x+0014 9（r2=0999 2）。

132提取方法軟棗獼猴桃200 g，去雜、-20 ℃冰箱預(yù)凍12 h，打漿機破碎，低溫烘干，備用；采用浸提法、回流提取法、索氏連續(xù)提取法等常規(guī)提取法、超聲波輔助法、閃式提取法、微波輔助法5-8]等提取方法，略有改動，分別提取軟棗獼猴桃多糖和總黃酮，料液比均為1 ∶10 gmL。

浸提法：料液浸泡2 d，濃縮干燥，備用?；亓魈崛》ǎ毫弦夯亓鲿r間2～4 h，提取2～3次，合并濾液，濃縮干燥，備用。索氏提取法：料液提取6～12 h，濃縮干燥。超聲波輔助法：料液提取時間30～40 min，溫度35～40 ℃，功率100 W，頻率 20 kHz。微波輔助法：料液提取時間10 min，功率300 W。酶促+微波法：料液中加入05%果膠酶和02%纖維素酶（以軟棗獼猴桃計），37 ℃處理2 h；微波輔助法提取 10 min，功率300 W。閃式提取法：料液提取溫度30 ℃，時間3 min，pH值為75，轉(zhuǎn)速5 000 rmin。酶促+浸提法：料液中加入05%果膠酶和02%纖維素酶（以軟棗獼猴桃計），37 ℃ 處理2 h；料液浸泡2 d，濃縮干燥。酶促+閃式提取法：料液中加入05%果膠酶和02%纖維素酶（以軟棗獼猴桃計），37 ℃處理2 h；料液提取溫度30 ℃，時間3 min，pH值為75，轉(zhuǎn)速5 000 rmin。酶促+超聲波法：料液中加入 05% 果膠酶和02%纖維素酶（以軟棗獼猴桃計），37 ℃處理2 h；料液提取時間30～40 min，溫度35～40 ℃，功率 100 W，頻率20 kHz。重復(fù)3次，取平均值。

14軟棗獼猴桃總黃酮和多糖提取工藝的優(yōu)化及其穩(wěn)定性驗證

在前期單因素試驗的基礎(chǔ)上，以復(fù)合酶添加量、微波功率、提取時間、料液比等為試驗因子，以總黃酮、多糖提取率為指標，采用L9（34）正交試驗（表1）優(yōu)化其提取工藝。以最佳工藝進行3次重復(fù)，以驗證其工藝穩(wěn)定性。

15活性成分的測定

151總黃酮采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法9]測定，即取適量提取浸膏，少量甲醇超聲溶解，100 mL容量瓶70%甲醇定容；移取上清05～10 mL，測定總黃酮含量。

152多糖采用5%苯酚-硫酸顯色法10]測定，即將提取液回收溶解，濃縮至原體積的110～16；加無水乙醇至60%以上，靜置12 h；離心，冷凍干燥；取適量熱水超聲溶解，100 mL 容量瓶定容，移取上清05～10 mL，測定多糖含量。

16提取物體外抗氧化活性

最佳工藝條件提取總黃酮和多糖，將提取液濃縮，40 ℃干燥，備用。參照文獻10]的方法并略有改變，測定提取物對超氧陰離子自由基的清除能力，依據(jù)文獻11]的方法測定提取物對羥基自由基的清除能力。

2結(jié)果與分析

21總黃酮和多糖提取的對比試驗

211提取溶劑由表2可見，醇類物質(zhì)作為提取劑對總黃酮和多糖的提取效果相對較好，提取率相對較高?？紤]毒性、成本等因素，本試驗采用乙醇 ∶水=6 ∶4作為提取溶劑。

212提取方法由表3可見，傳統(tǒng)提取法從提取時間、效率等與超聲波法、微波法等存在差異，浸提法總黃酮、多糖的提取率分別為028%、015%，不足微波+酶促法的10%。閃式提取法對軟棗獼猴桃總黃酮、多糖有較好的提取效果，具有快速、溫度低等優(yōu)勢，具有很好發(fā)展?jié)摿?；由于軟棗獼猴桃果實中的果膠吸附作用和阻礙傳質(zhì)原因，漿果對活性物質(zhì)的提取往往會產(chǎn)生不利影響，通過酶促作用，可明顯提高對黃酮及多糖的提取率。本試驗采用酶促+微波法以提取軟棗獼猴桃的總黃酮、多糖。

22軟棗獼猴桃總黃酮和多糖的提取工藝

221提取工藝優(yōu)化為更好地評價提取工藝，參考文獻12]，以提取率的算數(shù)平均值比值為系數(shù)，對多糖及總黃酮提取率進行加權(quán)處理。經(jīng)計算，多糖（T）系數(shù)為175，總黃酮（F）系數(shù)為100，其總指標計算公式為：

總指標=175×T+100×F。

由表4可見，影響提取工藝的因素由高到低為復(fù)合酶濃度>提取時間>料液比>提取功率，最佳工藝條件為A3B2C1D3，即復(fù)合酶（纖維素酶+果膠酶）濃度05%+04%、料液比1 ∶15 gmL、提取時間10 min、功率在300 W，其加權(quán)收率為6754 3%。依據(jù)k值，最佳組合A2B2C1D3不在正交設(shè)計表范圍內(nèi)，須進一步驗證以獲得最佳工藝。將A2B2C1D3組合依據(jù)試驗方法進行提取，獲得多糖、總黃酮的提取率分別為1876%、289%，其結(jié)果低于組合A3B2C1D3。因此，軟棗獼猴桃多糖、總黃酮最佳提取工藝為A3B2C1D3。

222最佳提取工藝穩(wěn)定性驗證試驗結(jié)果表明，軟棗獼猴桃總黃酮、多糖3次提取率分別為3197%、3201%、3190%和1982%、1998%、2011%，平均值分別為3196%、1997%，相對標準差分別為018%、073%，在10%以內(nèi)，另考慮試驗誤差，說明本試驗最佳提取工藝較為穩(wěn)定。

23活性成分抗氧化試驗

由圖1、圖2可見，軟棗獼猴桃提取物具有良好的羥基自由基、超氧陰離子自由基清除效果，提取物濃度為08 mgmL時其清除率在7000%以上。

3結(jié)論

乙醇 ∶水=6 ∶4作為提取劑，對軟棗獼猴桃總黃酮、多糖的提取效果相對較好，其提取率分別為189%、134%，雖然甲醇 ∶水的提取效果也較好，但考慮毒性和操作性，所以本試驗采用乙醇 ∶水。微波法提取軟棗獼猴桃總黃酮、多糖有良好的操作性，通過正交試驗優(yōu)化和加權(quán)分析，微波法在軟棗獼猴桃總黃酮及多糖提取上具有提取時間短、料液比適中、耗能相對較低的特點，在最佳提取工藝復(fù)合酶（纖維素酶+果膠酶）濃度05%+04%、料液比1 g ∶15 mL、提取時間 10 min、功率在300 W條件下，其多糖提取率平均為1997%，總黃酮提取率平均為3196%。軟棗獼猴桃提取物在 08 mgmL 以上時，對羥基自由基、超氧自由基的清除率在7000%以上，具有較好的抗氧化活性。最佳提取工藝經(jīng)試驗驗證，標準差在10%內(nèi)，具有較好的穩(wěn)定性。

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