人肝細胞生長因子重組腺病毒枕大池注入對動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達的影響

郭寒冰，孫允芹，禹萌，趙爽,李彤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100)

人肝細胞生長因子重組腺病毒枕大池注入對動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達的影響

郭寒冰，孫允芹，禹萌，趙爽,李彤

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南衛(wèi)輝453100)

目的觀察人肝細胞生長因子重組腺病毒(Ad-HGF)枕大池注入對動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達的影響。方法60只15月齡SD雄性大鼠，隨機抽取50只采用腎動脈狹窄術(shù)及高脂飼料喂養(yǎng)法制作動脈粥樣硬化模型，造模成功大鼠20只;將造模成功大鼠隨機分為動脈粥樣硬化組、Ad-HGF組，各10只；另10只大鼠為對照組。對照組、動脈粥樣硬化組大鼠通過枕大池注入生理鹽水(10 μL)，Ad-HGF組大鼠通過枕大池注入Ad-HGF(10 μL，滴度5×109pfu/100 μL)；之后第10天處死大鼠，用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腦組織中的IL-6及TNF-α，用image-proplus軟件對IL-6及TNF-α在大鼠腦組織中的表達進行半定量分析，同時采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腦組織中的IL-6及TNF-α。結(jié)果免疫組織化學(xué)法檢測顯示，對照組、動脈粥樣硬化組、 Ad-HGF組大鼠腦組織中的IL-6相對表達量分別為0.216 0±0.068 1、0.331 0±0.043 3、0.174 9±0.010 7，TNF-α相對表達量分別為0.078 6±0.011 2、0.255 1±0.045 8、0.054 4±0.016 6；與對照組相比,動脈粥樣硬化組IL-6、TNF-α的表達增加(P均lt;0.05)；與動脈粥樣硬化組相比，Ad-HGF組IL-6、TNF-α的表達減少(P均lt;0.05)。 酶聯(lián)免疫吸附法檢測顯示，對照組、動脈粥樣硬化組、 Ad-HGF組大鼠腦組織中的IL-6表達量分別為(50.415±6.690)、(108.302±5.695)、(66.062±9.550)pg/mL，TNF-α表達量分別為(83.836±9.442)、(209.425±15.520)、(85.996±8.445)pg/mL；與對照組相比,動脈粥樣硬化組IL-6、TNF-α的表達增加(P均lt;0.05)；與動脈粥樣硬化組相比，Ad-HGF組IL-6、TNF-α的表達減少(P均lt;0.05)。結(jié)論動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α的表達增加，Ad-HGF可以減少動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α的表達，即抑制動脈粥樣硬化大鼠腦組織炎性反應(yīng)。

人肝細胞生長因子重組腺病毒； 動脈粥樣硬化； 腦組織； 炎性因子

動脈粥樣硬化是造成血管狹窄、引起缺血性腦血管病的主要原因，尤其是血管多處狹窄和彌漫性狹窄。隨著影像學(xué)技術(shù)的發(fā)展，小血管彌漫性狹窄、阻塞導(dǎo)致的缺血性腦血管病的診斷比較容易，但仍缺少有效的防治方法。人肝細胞生長因子重組腺病毒(Ad-HGF)作為一種新型的基因定植藥物，在血管新生方面的作用引起臨床醫(yī)生的廣泛關(guān)注[1，2]。研究發(fā)現(xiàn)，Ad-HGF能夠抑制受損組織產(chǎn)生的炎性反應(yīng)，對骨骼肌與心肌缺血有顯著療效并已進入臨床Ⅱ期應(yīng)用階段[3，4]。在正常大鼠腦組織中，Ad-HGF由于攜帶的腺病毒感染定植于腦膜間皮細胞并分泌表達人肝細胞生長因子(HGF)，活性蛋白HGF可發(fā)揮促進內(nèi)皮細胞增殖與遷移、血管新生和神經(jīng)發(fā)生等生物學(xué)作用[5]。孫允芹等[6]研究證明在經(jīng)枕大池注入Ad-HGF后動脈粥樣硬化大鼠腦血流量明顯改善。急性顱腦損傷及缺血性腦血管病患者的血清中IL-6、TNF-α表達明顯增加，且隨著疾病嚴重程度的上升而呈上升趨勢[7]。2015年12月20日～2017年3月6日，我們觀察了經(jīng)枕大池注入Ad-HGF對動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達的影響?，F(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 Ad-HGF(滴度5×109pfu/100 μL)，高酯飼料(膽固醇、丙基硫氧嘧啶、膽酸鈉、蛋白粉、蔗糖、蛋黃粉、豬油等)，一抗抗體兔抗鼠IL-6抗體，一抗抗體兔抗鼠TNF-α抗體，通用型二抗抗體，枸櫞酸鈉緩沖液，PBS沖洗液，IL-6酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒，TNF-α酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒，大鼠腦立體定位儀及大容量離心機。

1.2 實驗動物、動脈粥樣硬化動物模型制備及Ad-HGF給予方法 雄性SD大鼠60只(300～400 g)，15月齡，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，自由飲水攝食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為19～20 ℃、空氣濕度為50%～60%。從60只大鼠中隨機抽取50只制作成動脈粥樣硬化模型。動脈粥樣硬化模型制備方法[7]：10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，腹正中線偏左肋弓下緣2 cm處切開，找到左腎動脈，剝離左腎動脈并用血管線穿過腎動脈下方，同時放入0.35 mm左右的針灸針，將線打結(jié)后拔出針灸針，用同樣方法處理右側(cè)腎動脈，術(shù)后閉合腹腔(剔出術(shù)后感染死亡大鼠共11只)。普通飼料喂養(yǎng)2周后，測量大鼠血壓(剔除不符合檢驗指標大鼠共9只),大鼠血壓明顯升高并高于正常上限。高血壓造模成功1周后使用高脂飼料喂養(yǎng)(0.2%丙基硫氧嘧啶，2%膽固醇，5%豬油，0.25%白糖，0.35%膽酸鈉等)16周。高血脂造模成功的標準：大鼠血脂升高并高于正常上限，大鼠頸內(nèi)動脈HE染色后觀察到其血管內(nèi)皮細胞排列紊亂并有粥樣斑塊形成(剔除未達到高血脂標準的大鼠共10只)。造模成功的20只大鼠隨機分為動脈粥樣硬化組、Ad-HGF組。另10只大鼠作為對照組，對照組大鼠分離左右腎動脈，不實施腎動脈狹窄術(shù),術(shù)后正常飼料喂養(yǎng)。對照組、動脈粥樣硬化組大鼠通過枕大池注入生理鹽水(10 μL)，Ad-HGF組大鼠通過枕大池注入Ad-HGF(10 μL，滴度5×109pfu/100 μL)；之后第10天處死大鼠，檢測大鼠腦組織中的IL-6及TNF-α。

1.3 大鼠腦組織中IL-6及TNF-α檢測方法 用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后暴露大鼠心臟，從心尖部插入粗針頭到達主動脈弓，同時剪開右心耳使靜脈血流出，心臟灌注觀察直到有清亮液體流出，隨后4%多聚甲醛灌注固定大鼠腦組織后快速分離完整腦組織，取部分腦組織，置多聚甲醛固定液，24 h后制作蠟塊，3 μm厚切片，于烘片機放置2～3 h。用免疫組織化學(xué)染色法檢測腦組織切片中的IL-6、TNF-α，于鏡下觀察表達IL-6、TNF-α的神經(jīng)元細胞，使用Image-proplus軟件對IL-6、TNF-α進行半定量分析。另取大鼠新鮮腦組織，稱重后液氮研磨、裂解、離心，取上清，用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測IL-6、TNF-α。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠腦組織IL-6、TNF-α的免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果 鏡下見對照組腦組織中基本沒有表達IL-6、TNF-α的神經(jīng)元細胞，動脈粥樣硬化組表達IL-6、TNF-α的神經(jīng)元細胞較多，Ad-HGF組表達IL-6、TNF-α的神經(jīng)元細胞較少(見圖1、2)。IL-6、TNF-α的相對表達量見表1。

注：A為對照組；B為動脈粥樣硬化組；C為Ad-HGF組

圖1表達IL-6的神經(jīng)元細胞(免疫組化染色，×200)

注：A為對照組；B為動脈粥樣硬化組；C為Ad-HGF組

圖2 表達TNF-α的神經(jīng)元細胞(免疫組化染色，×200)

注：與對照組相比，*Plt;0.05；與動脈粥樣硬化組相比，#Plt;0.05。

2.2 三組大鼠腦組織IL-6、TNF-α的酶聯(lián)免疫吸附法檢測結(jié)果 酶聯(lián)免疫吸附法檢測的三組大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達量見表2。

表2 酶聯(lián)免疫吸附法檢測的三組大鼠腦組織IL-6、TNF-α表達量比較

注：與對照組相比，*Plt;0.05；與動脈粥樣硬化組相比，#Plt;0.05。

3 討論

HGF具有強烈的促進血管新生的作用[3,5]，不會引發(fā)組織水腫、低血壓等問題[8]，對心臟組織沒有明顯的毒性和誘變作用。HGF也有促進腦組織血管新生的作用[9]，可以抑制由于腦組織損傷而產(chǎn)生的纖維化[10]，進而緩解由于腦供血不足導(dǎo)致的各種臨床癥狀及后遺癥。目前，我國已構(gòu)建具有專利技術(shù)的腺病毒HGF載體，即 Ad-HGF，這是一種新型的基因定植藥物，其腺病毒載體為E1、E3缺失體，避免了野生型腺病毒的復(fù)制[11，12]。體外實驗[13]顯示，將Ad-HGF重復(fù)注入心臟衰竭大鼠的心肌組織中，其心臟新生血管密度明顯增加、心臟功能明顯改善[14]。同時，Ad-HGF可有效感染腦膜間皮細胞，產(chǎn)生活性蛋白HGF，作用于缺血腦組織，發(fā)揮促血管新生作用，但要排除Ad-HGF對腦組織的損傷。

IL-6是由活化的T細胞產(chǎn)生的淋巴因子,可與集落刺激因子協(xié)同增強自然殺傷細胞的功能。激活的IL-6會損傷血管的內(nèi)膜，繼而增強血管內(nèi)皮與血細胞的黏附性,引起大量自由基聚集、炎癥介質(zhì)增多，導(dǎo)致細胞溶解及死亡[15～17]。TNF-α是一種具有多種生物活性的細胞因子，是機體炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答的重要炎性遞質(zhì)[18，19]，通過介導(dǎo)炎癥級聯(lián)反應(yīng)、破壞血腦屏障等誘導(dǎo)細胞凋亡[20，21]。在炎癥反應(yīng)及損傷組織中，IL-6與TNF-α表達增加[22，23]，特別在急性腦血管病患者的血清中IL-6、TNF-α的表達顯著增加[24]。冠心病、腦梗死、顱內(nèi)感染患者血清IL-6、TNF-α水平明顯升高，且隨著疾病嚴重程度升高而呈上升趨勢[25]。因此，我們選擇觀察IL-6、TNF-α的表達變化來判斷Ad-HGF對腦組織炎性反應(yīng)的作用。我們的實驗結(jié)果顯示，動脈粥樣硬化大鼠腦組織IL-6、TNF-α的表達明顯增加，經(jīng)枕大池注入Ad-HGF后大鼠腦組織IL-6、TNF-α的表達明顯減少，這說明Ad-HGF可以減少與組織損傷有關(guān)的炎性因子IL-6、TNF-α的表達，即可以抑制腦組織的炎性反應(yīng)，對腦組織發(fā)揮保護作用，這也為Ad-HGF進入臨床使用提供了依據(jù)。

已有研究[13]發(fā)現(xiàn)，與單次注射相比，重復(fù)注射Ad-HGF，其作用會明顯增強，下一步我們計劃對不同劑量Ad-HGF的有效性和安全性及Ad-HGF不同作用時間的有效性與安全性進行觀察。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.43.011

R743

A

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河南省醫(yī)學(xué)科技攻關(guān)省部共建項目(201401012)。

李彤(E-mail： litong0833@163.com)

2017-06-10)