辛伐他汀對缺氧黑素瘤細(xì)胞A375增殖凋亡及遷移的影響

李娟 李立

450012鄭州市婦幼保健院皮膚科（李娟）；鄭州市第二人民醫(yī)院皮膚科（李立）

辛伐他汀對缺氧黑素瘤細(xì)胞A375增殖凋亡及遷移的影響

李娟 李立

450012鄭州市婦幼保健院皮膚科（李娟）；鄭州市第二人民醫(yī)院皮膚科（李立）

目的 探討辛伐他汀對缺氧黑素瘤細(xì)胞A375增殖、凋亡、遷移調(diào)控的分子機(jī)制。方法在常氧或缺氧環(huán)境下體外培養(yǎng)A375細(xì)胞，細(xì)胞分為辛伐他汀處理的辛伐他汀組與二甲基亞砜處理的對照組，通過CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒檢測細(xì)胞活力，Annexin V/PI凋亡實驗檢測細(xì)胞凋亡，插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿transwell遷移實驗檢測細(xì)胞遷移。RT-PCR法、Western印跡法檢測辛伐他汀組與對照組細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、生存素、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27），以及沉默缺氧A375細(xì)胞的HIF-1α后的生存素、p27 mRNA與蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 常氧或缺氧環(huán)境下，辛伐他汀組與對照組A375細(xì)胞增殖活力、凋亡細(xì)胞比例、細(xì)胞遷移數(shù)組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F值95.84、37.22、177.5，均P ＜0.001），缺氧對照組A375細(xì)胞的增殖活力（1.391±0.129）、細(xì)胞遷移數(shù)（322.550±26.226）均高于常氧對照組（0.807±0.049、125.583±17.256）、缺氧辛伐他汀組（0.685±0.417、115.167±12.050）（P＜0.001）；缺氧對照組細(xì)胞凋亡比例（6.167%±2.714%）均低于常氧對照組（11.833%±2.483%）、缺氧辛伐他汀組（17.833%±2.714%）（P＜0.01）。缺氧辛伐他汀組HIF-1α mRNA與蛋白水平、生存素mRNA與蛋白水平均低于對照組（P＜0.05）；P27 mRNA與蛋白水平均高于對照組（P＜0.05）。沉默缺氧A375細(xì)胞中HIF-1α后，生存素mRNA與蛋白水平均低于對照組（t值為5.346、8.281，P ＜ 0.05），P27 mRNA與蛋白水平高于對照組（t值為31.37、9.954，P ＜ 0.01）。結(jié)論辛伐他汀可抑制缺氧A375細(xì)胞的增殖及遷移，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制可能與HIF通路有關(guān)。

黑素瘤；細(xì)胞系，腫瘤；缺氧；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞遷移分析；生存素；低氧誘導(dǎo)因子；辛伐他汀

黑素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤，發(fā)病率低，但死亡率高［1］。黑素瘤細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致氧供需失衡，局部組織存在缺氧。研究顯示，缺氧可誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞（A375）增殖，增強(qiáng)遷移能力［2-3］，是患者預(yù)后不良的獨立危險因素［4］。低氧誘導(dǎo)因子（HIF）信號通路在腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞增殖及遷移中發(fā)揮了重要作用［2，5］。研究發(fā)現(xiàn)，他汀類藥物可以通過調(diào)控線粒體功能、氧化應(yīng)激反應(yīng)、誘導(dǎo)血紅素合酶1［6］、黑素濃集激素Ⅰ類相關(guān)蛋白A［7］等參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移的調(diào)控。本研究旨在明確缺氧環(huán)境下黑素瘤的生長和遷移能力的變化，探討他汀類藥物對缺氧黑素瘤的增殖、凋亡、遷移的調(diào)控作用。

材料和方法

一、試劑和儀器

辛伐他?。绹鳶igma-Aldrich公司）儲存濃度為10 g/L，采用二甲基亞砜（DMSO）配制。轉(zhuǎn)染試劑盒（Lipofectanmol/Line 2000）（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；HIF-1α抗體（美國Novus公司）；生存素（survivin）及細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）抗體（美國Proteintech公司）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Advansta公司）；CCK-8試劑盒（日本同仁公司）；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

A375細(xì)胞系購于ATCC公司，采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）培養(yǎng)。常氧組細(xì)胞于5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，缺氧組細(xì)胞于5%CO2、5%O2、90%N2的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

三、細(xì)胞活力檢測

將A375細(xì)胞以1×104/ml的密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，分別給予0.25、0.5、1、2、4、8 μmol/L辛伐他汀（辛伐他汀組）及DMSO（對照組）干預(yù)，置于常氧或缺氧培養(yǎng)箱48 h后，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞，更換新鮮培養(yǎng)基，每孔加入10 μl染色液CCK-8，常氧培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3～4 h。酶標(biāo)儀測定每孔在450 nmol/L處的吸光度（A值），記錄并分析。

四、細(xì)胞凋亡實驗

將A375細(xì)胞接種于6孔板中，采用含0.5%血清的低血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，分別給予辛伐他汀及DMSO干預(yù)，置于常氧或缺氧培養(yǎng)箱48 h后，收集細(xì)胞，PBS 洗滌，加入400 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，先加入5 μl Annexin-V-FITC熒光探針混勻，室溫避光5 ～ 10 min，再加入5 μl PI核酸染料，流式細(xì)胞儀檢測熒光。分析各組晚期凋亡（Annexin-V及PI陽性）細(xì)胞比例。

五、細(xì)胞遷移實驗

采用transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗。A375細(xì)胞長至90%融合時，去血清培養(yǎng)24 h同步化細(xì)胞。在transwell小室下室中加入500 μl 15%血清DMEM培養(yǎng)基，上室加入100 μl的1×104/ml細(xì)胞懸液（無血清DMEM培養(yǎng)基），分別給予辛伐他汀及DMSO處理，置于常氧或缺氧培養(yǎng)箱8 h后，PBS漂洗，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，倒置顯微鏡下觀察，每個小室隨機(jī)選擇8個視野數(shù)細(xì)胞數(shù)。

六、沉默A375細(xì)胞中HIF-1α

委托廣州銳博生物有限公司合成針對HIF-1α基因的小干擾RNA（si-HIF）及陰性對照si-NC。Si-HIF的序列，正向引物：5′-UGCUCUUUGUGGUUGGAUC UA-3′，反向引物：5′-ACGAGAAACACCAACCUAGA U-3′。接種1×105個缺氧環(huán)境下的A375細(xì)胞至細(xì)胞培養(yǎng)板，采用無雙抗培養(yǎng)基，按照Lipofectamine 2000說明書將siRNA以20 nmol/L終濃度轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞內(nèi)，轉(zhuǎn)染48～72 h后提取總蛋白，用于本研究后續(xù)實驗。

七、檢測A375細(xì)胞mRNA表達(dá)

依照Total RNA提取試劑說明書提取各組A375細(xì)胞RNA。合成cDNA，所得反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物采用ABI 7500型實時熒光定量PCR擴(kuò)增，HIF-1α正向引物：5′-ATGAAGTGTACCCTAACTAGC CG-3′，反向引物：5′-GCTTGAGTTTCAACCCAGACATA-3；P27正向引物：5′-TTGCGCAATTAGGTTTTTCC-3′，反向引物：5′-AAAGGAATTCAAGCCCTTCC-3′；生存素正向引物：5′-TGCCCCGACGTTGCC-3′，反向引物：5′-CAGTTCTTGAATGTAGAGATGCGGT-3′；內(nèi) 參 照GAPDH正向引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物：5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據(jù)如下公式計算mRNA的相對表達(dá)量，△Ct=C（t）目標(biāo) -C（t）GAPDH，△△C（t）=2-△C（t）。

八、免疫印跡實驗

用蛋白裂解液提取各處理組的A375細(xì)胞總蛋白，制作聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE），采用BCA蛋白測定法檢測蛋白濃度，根據(jù)濃度計算上樣量，加入5×SDS上樣緩沖液，混勻后煮沸10 min。蛋白電泳，使用聚偏二氟乙烯膜轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶加入Tween的Tris-Hcl緩沖鹽溶液（TBST）混合液封閉，加入相應(yīng)的一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影，Image J圖像處理軟件分析目的條帶的灰度值。

九、統(tǒng)計學(xué)方法

使用GraphPad Prism 5.0分析數(shù)據(jù)并繪制統(tǒng)計圖。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；多組間比較采用雙因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗；半抑制濃度（IC50）采用非線性回歸擬合計算；計量資料采用±s表示，所有獨立的實驗重復(fù)3次取均值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、不同濃度辛伐他汀對缺氧A375細(xì)胞增殖的影響

辛伐他汀濃度分別0.25、0.50、1.00、2.00、4.00、8.00 μmol/L時，A375細(xì)胞增殖抑制率分別為15.038%、22.535%、45.614%、58.186%、84.262%、84.815%，半抑制濃度（IC50）為1.3 μmol/L，故本研究后續(xù)實驗采用1.3 μmol/L作為辛伐他汀的處理濃度，且常氧聯(lián)合1.3 μmol/L辛伐他汀處理A375細(xì)胞時，細(xì)胞活力（0.662±0.018）與常氧對照組（0.812±0.032）比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=2.027，P=0.08）。

二、缺氧與辛伐他汀對A375細(xì)胞增殖的影響

常氧環(huán)境與缺氧環(huán)境下，對照組與辛伐他汀組的A375細(xì)胞增殖活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），缺氧辛伐他汀組與缺氧對照組A375細(xì)胞增殖活力均高于常氧組（P＜0.001），缺氧辛伐他汀組低于缺氧對照組（t=17.88，P＜0.001）。見表1。

表1 辛伐他汀對缺氧誘導(dǎo)的A375細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響（±s）

表1 辛伐他汀對缺氧誘導(dǎo)的A375細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的影響（±s）

注：n=3。a與常氧對照組比較，P＜0.01；b與缺氧對照組比較，P＜0.001

三、辛伐他汀對缺氧誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡與遷移的影響

細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示，A375細(xì)胞凋亡細(xì)胞比例組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），缺氧對照組低于常氧對照組、缺氧辛伐他汀組（t值分別為3.860、7.946，P ＜ 0.001）。細(xì)胞遷移實驗結(jié)果顯示，A375細(xì)胞遷移數(shù)組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），缺氧對照組高于常氧對照組、缺氧聯(lián)合辛伐他汀組（t值分別為18.06、19.01，P ＜ 0.001）。見表1。

四、辛伐他汀調(diào)控缺氧A375細(xì)胞增殖凋亡的機(jī)制研究

缺氧環(huán)境下，辛伐他汀組HIF-1α mRNA水平與蛋白水平、生存素mRNA水平與蛋白水平均低于對照組，P27 mRNA水平與蛋白水平高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）。見表2，圖1。

沉默缺氧A375細(xì)胞中HIF-1α后，生存素mRNA與蛋白表達(dá)低于對照組，P27 mRNA與蛋白表達(dá)高于對照組（P＜0.01），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或＜0.01）。見表3，圖1。

討 論

黑素瘤過度增殖導(dǎo)致局部組織缺氧，缺氧可以通過上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、白細(xì)胞介素8（IL-8）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）等誘導(dǎo)黑素瘤細(xì)胞選擇性突變，發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，使細(xì)胞適應(yīng)缺氧環(huán)境，促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖及遷移。HIF信號通路參與了缺氧對黑素瘤細(xì)胞的調(diào)控。常氧環(huán)境中，正常細(xì)胞及組織中HIF-1α被迅速降解幾乎檢測不到，而28%的黑素瘤組織可表達(dá)HIF-1α［8］。HIF-1α通過調(diào)控細(xì)胞周期蛋白水平、線粒體凋亡途徑等參與細(xì)胞的增殖、凋亡［9］。生存素作為凋亡蛋白抑制因子家族成員之一，可以在98%（62/63）的黑素瘤患者中檢出，且組織標(biāo)本中生存素的mRNA水平與接受術(shù)后黑素瘤疫苗Canvaxin的患者的生存期成負(fù)相關(guān)［10］。P27是細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子，參與調(diào)控細(xì)胞G0至S期轉(zhuǎn)換。研究顯示，P27的水平與腫瘤浸潤厚度負(fù)相 關(guān)［11］，是晚期轉(zhuǎn)移黑素瘤患者預(yù)后的獨立預(yù)測因子［12］。常氧環(huán)境中，他汀類藥物可以通過凋亡依賴途徑作為化療藥物的增敏劑發(fā)揮抗腫瘤作用［13］。他汀類藥物可以通過觸發(fā)一個“自分泌環(huán)”放大外源性途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［14］。辛伐他汀可以通過誘導(dǎo)G1期停滯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其機(jī)制可能通過上調(diào)P27的表達(dá)而實現(xiàn)［15］。近期研究發(fā)現(xiàn)脂溶性他汀類藥物對常氧B16.F10小鼠黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用可能通過抑制HIF-1α的表達(dá)和抗氧化防御機(jī)制實現(xiàn)［16］。

表2 缺氧環(huán)境下辛伐他汀對A375細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、生存素、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

表2 缺氧環(huán)境下辛伐他汀對A375細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、生存素、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。a與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05；b與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01

表3 缺氧環(huán)境下A375細(xì)胞沉默HIF-1α對生存素、P27的mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

表3 缺氧環(huán)境下A375細(xì)胞沉默HIF-1α對生存素、P27的mRNA及蛋白表達(dá)的影響（±s）

注：n=3。si-NC：陰性對照小干擾RNA；si-HIF：針對HIF-1α的小干擾RNA；a與si-NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；b與si-NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）

圖1 缺氧環(huán)境下A375細(xì)胞低氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α、生存素、細(xì)胞周期素依賴性蛋白激酶抑制因子（P27）的mRNA及蛋白的表達(dá) 1A：缺氧及辛伐他汀對A375細(xì)胞HIF-1α、生存素、P27的蛋白表達(dá)的影響；1B：缺氧A375細(xì)胞沉默HIF-1α對生存素、P27的蛋白表達(dá)的影響；si-NC：對照小干擾RNA；si-HIF：針對HIF-1α的小干擾RNA；a：P ＜0.05；b：P ＜ 0.001

本研究通過檢測缺氧環(huán)境下人黑素瘤細(xì)胞A375細(xì)胞的增殖、凋亡及遷移能力，明確了缺氧促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞增殖及遷移、抑制凋亡的作用，證實了缺氧是黑素瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要誘導(dǎo)因素。同時，使用辛伐他汀干預(yù)缺氧A375細(xì)胞，可以逆轉(zhuǎn)缺氧對A375細(xì)胞的促生長和遷移作用。沉默缺氧黑素瘤細(xì)胞HIF-1α之后，生存素表達(dá)下降，P27增加，提示生存素及P27可能是HIF-1α的下游靶蛋白。辛伐他汀可以抑制缺氧黑素瘤細(xì)胞HIF-1α的表達(dá)，從而下調(diào)生存素、上調(diào)P27，提示辛伐他汀通過HIF-1α信號通路發(fā)揮抑制缺氧黑素瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)凋亡的作用。

［1］Miller AJ,Mihm MC Jr.Melanoma［J］.N Engl J Med,2006,355（1）:51-65.DOI:10.1056/NEJMra052166.

［2］Bedogni B,Powell MB.Hypoxia,melanocytes and mela-nomasurvival and tumor development in the permissive microenvironmol/Lent of the skin［J］.Pigment Cell Melanoma Res,2009,22（2）:166-174.DOI:10.1111/j.1755-148X.2009.00553.x.

［3］Huber R,Meier B,Otsuka A,et al.Tumour hypoxia promotes melanoma growth and metastasis via High Mobility Group Box-1 and M2-like macrophages［J］.Sci Rep,2016,6:29914.DOI:10.1038/srep29914.

［4］Lartigau E,Randrianarivelo H,Avril MF,et al.Intratumoral oxygen tension in metastatic melanoma［J］.Melanoma Res,1997,7（5）:400-406.DOI:10.1097/00008390-199710000-00006.

［5］Hanna SC,Krishnan B,Bailey ST,et al.HIF1α and HIF2α independently activate SRC to promote melanoma metastases［J］.J Clin Invest,2013,123（5）:2078-2093.DOI:10.1172/JCI66715.

［6］Ivanov VN,Hei TK.Regulation of apoptosis in human melanoma and neuroblastoma cells by statins,sodium arsenite and TRAIL:a role of combined treatment versus monotherapy［J］.Apoptosis,2011,16（12）:1268-1284.DOI:10.1007/s10495-011-0649-2.

［7］Pich C,Teiti I,Rochaix P,et al.Statins Reduce Melanoma Development and Metastasis through MICA Overexpres-sion［J］.Front Immunol,2013,4:62.DOI:10.3389/fimmu.2013.00062.

［8］Sandru A,Voinea S,Panaitescu E,et al.Survival rates of patients with metastatic malignant melanoma［J］.J Med Life,2014,7（4）:572-576.

［9］Giatromanolaki A,Sivridis E,Kouskoukis C,et al.Hypoxiainducible factors 1alpha and 2alpha are related to vascular endothelial growth factor expression and a poorer prognosis in nodular malignant melanomas of the skin［J］.Melanoma Res,2003,13（5）:493-501.DOI:10.1097/01.cmr.0000056268.56735.4c.

［10］Goda N,Dozier SJ,Johnson RS.HIF-1 in cell cycle regulation,apoptosis,and tumor progression［J］.Antioxid Redox Signal,2003,5（4）:467-473.DOI:10.1089/152308603768295212.

［11］Takeuchi H,Morton DL,Elashoff D,et al.Survivin expression by metastatic melanoma predicts poor disease outcome in patients receiving adjuvant polyvalent vaccine［J］.Int J Cancer,2005,117（6）:1032-1038.DOI:10.1002/ijc.21267.

［12］Fl?renes VA,Maelandsmo GM,Kerbel RS,et al.Protein expression of the cell-cycle inhibitor p27Kip1 in malignant melanoma:inverse correlation with disease-free survival［J］.Am J Pathol,1998,153（1）:305-312.DOI:10.1016/S0002-9440（10）65572-1.

［13］Chen G,Cheng Y,Zhang Z,et al.Prognostic significance of cytoplasmic p27 expression in human melanoma［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2011,20（10）:2212-2221.DOI:10.1158/1055-9965.EPI-11-0472.

［14］Feleszko W,M?ynarczuk I,Olszewska D,et al.Lovastatin potentiates antitumor activity of doxorubicin in murine melanoma via an apoptosis-dependent mechanism［J］.Int J Cancer,2002,100（1）:111-118.DOI:10.1002/ijc.10440.

［15］Minichsdorfer C,Hohenegger M.Autocrine amplification loop in statin-induced apoptosis of human melanoma cells［J］.Br J Pharmacol,2009,157（7）:1278-1290.DOI:10.1111/j.1476-5381.2009.00298.x.

［16］Saito A,Saito N,Mol W,et al.Simvastatin inhibits growth via apoptosis and the induction of cell cycle arrest in human melanoma cells［J］.Melanoma Res,2008,18（2）:85-94.DOI:10.1097/CMR.0b013e3282f60097.

Effect of simvastatin on the proliferation,apoptosis and migration of hypoxic A375 melanoma cells

Li Juan,Li Li
Department of Dermatology,Women&infants Hospital of Zhengzhou,Zhengzhou 450012,China（Li J）;Department of Dermatology,Zhengzhou Second Hospital,Zhengzhou 450006,China（Li L）

Li Juan,Email:l1984210@163.com

Objective To evaluate the regulatory effect of simvastatin on the proliferation,apoptosis and migration of hypoxic A375 melanoma cells,and to explore their molecular mechanisms.Methods Under normoxic or hypoxic culture conditions,A375 cells were treated with 0.25,0.5,1,2,4,8 μmol/L simvastatin（simvastatin groups）and dimethyl sulfoxide（DMSO,control group）separately for 48 hours.Cell counting kit-8（CCK-8）assay,Transwell assay using immersion culture system and flow cytometry using annexin-V/propidium iodide（PI）staining were conducted to assess the proliferative and migratory activities and apoptosis of A375 cells,respectively.RT-PCR and Western blot analysis were performed to measure the mRNA and protein expression of hypoxia-inducible factor 1α（HIF-1α）,survivin and cyclin-dependent kinase inhibitor p27 in the simvastatin groups and control group,as well as in the HIF-1α-silenced hypoxic A375 cells.Results Under normoxic or hypoxic culture conditions,there were significant differences in the proliferative activities of A375 cells,proportion of apoptotic cells and number of migrating cells between the simvastatin groups and control groups（F=95.84,37.22 and 177.5 respectively,P ＜0.001）.The hypoxic control group showed significantly higher cellular proliferative activity（1.391 ± 0.129）and higher number of migrating cells（322.550 ± 26.226）compared with the normoxic control group（0.807±0.049,125.583±17.256 respectively,both P＜0.001）and hypoxia+simvastatin group（0.685±0.417,115.167±12.050 respectively,both P＜0.001）,but significantly lower proportion of apoptotic cells（6.167% ±2.714%）compared with the normoxic control group（11.833% ±2.483%,P ＜0.01）and hypoxia+simvastatin group（17.833% ±2.714%,P ＜0.01）.Under the hypoxic condition,the simvastatin group showed significantly lower mRNA and protein expression of HIF-1α and survivin compared with the control group（all P ＜ 0.05）,but significantly higher mRNA and protein expression of P27 compared with the control group（both P ＜ 0.05）.Under the hypoxic condition,HIF-1αsilenced A375 cells showed significantly decreased mRNA and protein expression of survivin（t=5.346 and 8.281 respectively,both P ＜ 0.05）,but significantly increased mRNA and protein expression of p27（t=31.37 and 9.954 respectively,both P ＜ 0.01）compared with the unsilenced cells.Conclusion Simvastatin can inhibit the proliferation and migration of hypoxic A375 cells,and promote their apoptosis,likely by activating the HIF signaling pathway.

Melanoma;Cell line,tumor;Anoxia;Cell proliferation;Apoptosis;Cell migration assays;Survivin;Hypoxia inducible factor;Simvastatin

李娟，Email：l1984210@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.10.009

2016-10-31）

（本文編輯：朱思維 顏艷）