溫度對銀耳胞外酶活力及營養(yǎng)品質(zhì)特性的影響

陳 崗，詹 永，楊 勇，吳 振，謝會川，石文娟，柴佳炎，龔胡榮，羅 楊,*

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 409003）

溫度對銀耳胞外酶活力及營養(yǎng)品質(zhì)特性的影響

陳 崗1，詹 永1，楊 勇1，吳 振1，謝會川2，石文娟2，柴佳炎2，龔胡榮2，羅 楊1,*

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065；2.重慶市銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 409003）

研究不同溫度對銀耳栽培過程中生長發(fā)育各階段的7 種胞外酶活力和銀耳品質(zhì)特性的影響；采用相關(guān)性分析和通徑分析2 種數(shù)據(jù)分析方法，探討各胞外酶平均酶活力與銀耳品質(zhì)的關(guān)系，揭示各胞外酶對銀耳品質(zhì)的相對重要性，為銀耳工廠化高質(zhì)、高產(chǎn)栽培提供可靠理論依據(jù)。結(jié)果表明，在適宜的溫度范圍內(nèi)，同種胞外酶活力變化規(guī)律相似，不同胞外酶活力變化具有明顯的階段性；對比研究發(fā)現(xiàn)，在栽培溫度（23.0±0.5）℃時，成熟銀耳的干生物學(xué)效率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量在7 個溫度組中最高，分別為35.67%、21.51%和8.53%。相關(guān)性分析表明，所測胞外酶的平均酶活力（除羧甲基纖維素酶外）與干生物學(xué)效率和多糖含量呈正相關(guān)性，蛋白質(zhì)含量與7 種胞外酶平均酶活力均呈正相關(guān)性；進(jìn)一步通徑分析發(fā)現(xiàn)，蛋白酶是影響銀耳營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵胞外酶。綜上所述，在栽培溫度（23.0±0.5）℃時，基質(zhì)中主要胞外酶具有高活力，銀耳的營養(yǎng)品質(zhì)最高，可將此溫度作為銀耳工廠化栽培的指導(dǎo)溫度。

溫度；銀耳；胞外酶；酶活力；營養(yǎng)品質(zhì)

銀耳（Tremella fuciformis），又稱白木耳、雪耳、銀耳子等，為典型腐生異養(yǎng)大型擔(dān)子菌門真菌，其含有多糖、酚類、黃酮類和多種氨基酸等生物活性成分，被譽(yù)為“食用菌之王”[1]。我國是銀耳主產(chǎn)國，產(chǎn)地主要分布在福建古田、四川通江、重慶黔江等地。至20世紀(jì)80年代福建古田成功研究出銀耳袋料栽培技術(shù)，銀耳栽培逐漸實現(xiàn)工廠化人工生產(chǎn)。袋料銀耳栽培選用木屑、棉子殼、麥麩等物質(zhì)構(gòu)成栽培培養(yǎng)基，其中含有大量的木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。為滿足自身生長發(fā)育的需求，需將大分子碳水化合物、蛋白質(zhì)等分解為小分子的營養(yǎng)物質(zhì)，從而進(jìn)行吸收和轉(zhuǎn)化，而這些分解利用和轉(zhuǎn)化的過程與菌絲分泌的胞外酶的活性緊密相關(guān)。營養(yǎng)菌絲階段營養(yǎng)分解、吸收和轉(zhuǎn)化的程度，直接決定后期成熟子實體的產(chǎn)量和品質(zhì)，因此，深入研究不同培養(yǎng)溫度條件下，菌絲胞外酶活力的變化規(guī)律，對于明確不同栽培溫度下銀耳生理的變化情況非常必要。

目前關(guān)于銀耳栽培技術(shù)的研究主要集中在高產(chǎn)菌種的選育[2]、袋料基質(zhì)的優(yōu)化篩選[3]、栽培工藝[4]等方面，但培養(yǎng)溫度對銀耳栽培過程中生理的影響缺乏研究，相關(guān)報道很少。本實驗從與銀耳生長發(fā)育密切相關(guān)的幾類胞外酶，包括木質(zhì)素酶系（漆酶和錳過氧化物酶（manganese peroxidase，MnPs））、纖維素酶系（羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase，CMCs）和濾紙纖維素酶（filter paper cellulase，F(xiàn)Ps）、半纖維素酶（hemicellulase，HCs）、淀粉酶、蛋白酶開展研究，探討培養(yǎng)溫度對銀耳發(fā)育和營養(yǎng)品質(zhì)特性的影響，揭示各胞外酶對銀耳品質(zhì)相對重要性，為銀耳工廠化高質(zhì)、高產(chǎn)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

銀耳菌株（DD 1號）和香灰菌株（XH 3號）由重慶市銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心提供，從福建古田引進(jìn)。

栽培培養(yǎng)基質(zhì)：棉籽殼69%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）、麩皮19%、雜木屑10%、蔗糖1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.2%、石膏0.5%。

2,2’-聯(lián)氮-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）-二氨鹽（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS）和木聚糖 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9240A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D三孔電熱恒溫水槽 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；BS224S電子天平德國賽多利斯公司；Z300K離心機(jī) 德國Hermle公司。

1.3 方法

1.3.1 栽培管理

實驗在重慶市銀耳營養(yǎng)食品企業(yè)工程技術(shù)研究中心的銀耳栽培室內(nèi)進(jìn)行，栽培室內(nèi)的溫度、濕度及通風(fēng)采用自動設(shè)備進(jìn)行調(diào)控。

實驗采用袋料栽培法，選用規(guī)格12 cm×8 cm×0.03 cm的聚丙烯塑料袋，每袋裝菌料600 g（m（干料）∶m（水）＝4∶6），每袋在橫側(cè)面打1 個接種孔并用專用膠布封口，126 ℃條件下高壓滅菌2 h，冷卻后接種，每孔接種量為1.5 g。將已接種的銀耳菌袋分別放入溫度為（17.0±0.5）、（19.0±0.5）、（21.0±0.5）、（23.0±0.5）、（25.0±0.5）、（27.0±0.5）、（29.0±0.5）℃的7 個栽培室，每個溫度組設(shè)置500 袋，放置于同一水平位置的栽培架內(nèi)。

栽培室其他環(huán)境條件控制參照GB/T 29369—2012《銀耳生產(chǎn)技術(shù)規(guī)范》[5]并略有修改。銀耳菌絲營養(yǎng)生長期間，濕度為自然狀態(tài)，避光，每天使用風(fēng)機(jī)換氣1 次（每次30 min）；原基形成期間，相對濕度控制為80%～85%，自然光照，每天風(fēng)機(jī)換氣2 次（每次30 min）；子實體生長期間，相對濕度控制為90%～95%，自然光照，每天風(fēng)機(jī)換氣3 次（每次30 min）。

1.3.2 采樣方法及粗酶液制備

把銀耳生長期分為7 個階段：菌絲1/2滿袋（階段1）、菌絲滿袋（階段2）、吐黃水期（階段3：接種孔內(nèi)出現(xiàn)琥珀色黃水）、原基期（階段4：接種孔出現(xiàn)淡黃色原基）、菌蕾期（階段5：原基分化舌狀耳片，呈食指大）、開片期（階段6：耳片完全展開，呈疏松狀）、子實體成熟期（階段7：耳片略有收縮、褶皺，耳片加厚）。在不同階段采樣時，每一溫度組隨機(jī)抽取3 袋菌棒，每一菌棒先去除原種和子實體，再刮去表層約厚1 cm的培養(yǎng)料，取表層下3～6 cm深度的菌絲與培養(yǎng)料混合物100 g，置于-20 ℃保存。

準(zhǔn)確稱取同一待測樣品2 份，每份5 g，1 份用于制備粗酶液，另1 份在80 ℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥至質(zhì)量恒定（用于測干質(zhì)量）。將5 g樣品放入100 mL三角瓶中，加蒸餾水25 mL，在30 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提2 h，過濾，于8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。每個樣品分別取樣3 次進(jìn)行測定。

1.3.3 胞外酶活力測定

漆酶和MnPs活力分別參照ABTS法[6]和Wariishi等[7]的方法測定，酶活力單位均定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘吸光度增加0.01；CMCs活力參照安琪等[8]的方法測定，酶活力單位定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘水解CMC-Na生成1 mg葡萄糖所需的酶量；FPs活力參照趙玉萍等[9]的方法測定，酶活力單位定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘內(nèi)水解底物生成1 mg葡萄糖所需的酶量；HCs活力參照李江華等[10]的方法，酶活力單位定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘內(nèi)催化木聚糖水解生成1 mg木糖所需的酶量；淀粉酶活力參照王玉萬等[11]的方法測定，酶活力單位定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘內(nèi)催化底物釋放1 mg葡萄糖的酶量；蛋白酶活力測定參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》[12]中“蛋白酶活力的測定（福林法）”，酶活力單位定義為每克干培養(yǎng)基質(zhì)每分鐘內(nèi)催化底物釋放1 μg酪氨酸的酶量。

1.3.4 銀耳營養(yǎng)品質(zhì)測定

采用苯酚-硫酸法[13]測定總糖含量，還原糖含量測定采用3,5-二硝基水楊酸法[14]，多糖含量按照公式（1）計算；蛋白質(zhì)含量的測定參考GB 5009.5—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[15]中分光光度法；干生物學(xué)效率的測定參照魏潤黔[16]、孔維麗[17]等的方法并略作修改，將采收后的新鮮銀耳在75 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒質(zhì)量，記錄每袋銀耳干品質(zhì)量，按照公式（2）計算干生物學(xué)效率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析、相關(guān)性分析和通徑分析，Duncan’s新復(fù)極差法比較各處理間差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀耳栽培周期內(nèi)胞外酶活力的變化

2.1.1 不同溫度條件下漆酶和MnPs活力的變化

木質(zhì)素是一種高度復(fù)雜的以苯丙烷為基本結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的芳香族高分子化合物，植物組織中木質(zhì)素與纖維素以共價鍵形式緊密結(jié)合，并將纖維素分子包埋在其中，影響由菌絲分泌的纖維素酶對纖維素的降解[18]。食用菌在生長過程中通過菌絲分泌木質(zhì)素酶將木質(zhì)素徹底分解為CO2、H2O，從而利用組織內(nèi)部的纖維素、半纖維素等碳源物質(zhì)[19]。木質(zhì)素酶主要包括漆酶、MnPs以及木質(zhì)素過氧化物酶等，其中木質(zhì)素過氧化物酶只有幾種白腐菌能夠產(chǎn)生[20]。

圖1 不同培養(yǎng)溫度條件下漆酶（A）和MnPs（B）活力Fig. 1 Changes in laccase (A) and MnPs (B) activity under different temperature conditions

由圖1A可知，不同溫度組的漆酶活力變化趨勢較為一致，呈“上升-下降”的單峰形態(tài)，但酶活力峰值出現(xiàn)的生長階段卻有差異。在栽培溫度（19.0±0.5）～（27.0±0.5）℃范圍內(nèi)，在階段4時漆酶活力達(dá)到峰值，隨后呈下降趨勢；（23.0±0.5）℃條件下漆酶活力最強(qiáng)，為467.46 U。在低溫（17.0±0.5）℃和高溫（29.0±0.5）℃條件下，漆酶活力在階段3達(dá)到峰值后便逐漸下降，且在整個生長期間處于較低水平。

在不同溫度條件下，MnPs活力的變化規(guī)律與漆酶有一定差別（圖1B）。在（17.0±0.5）～（27.0±0.5） ℃溫度范圍內(nèi)，MnPs活力在階段2和階段4出現(xiàn)雙峰值，且在階段4出現(xiàn)最大值；在（25.0±0.5）℃時，MnPs活力在各生長階段均為最高。在高溫（29.0±0.5）℃條件下，MnPs活力在階段3達(dá)到峰值后便逐漸下降，酶活力變化趨勢與其他溫度組不同。

2.1.2 不同溫度條件下CMCs和FPs活力的變化

纖維素是一種超分子結(jié)構(gòu)的高分子，需在纖維素酶的作用下降解為纖維二糖，最后水解為葡萄糖，才能被食用菌菌絲所吸收利用[21]。組成纖維素酶系的酶主要有3 種，分別是CMCs、FPs和β-葡萄糖甘酶，其中CMCs和FPs為食用菌的主要胞外酶[22]。

圖2 不同培養(yǎng)溫度條件下CMCs（A）和FPs（B）活力Fig. 2 Changes in CMCs (A) and FPs (B) activity under different temperature conditions

由圖2A可知，不同溫度組的CMCs活力變化趨勢較為一致，呈先上升后下降的單峰形態(tài)，且隨溫度升高酶活力逐漸增強(qiáng)，在（29.0±0.5）℃時酶活力最高；在（17.0±0.5）℃條件下，CMCs活力在階段4達(dá)到峰值后便逐漸下降，且在整個生長期間處于較低水平。

在不同溫度條件下，F(xiàn)Ps活力的變化規(guī)律與CMCs的總體趨勢相似（圖2B）。在栽培溫度（17.0±0.5）～（27.0±0.5）℃時，F(xiàn)Ps活力峰值出現(xiàn)在階段6，之后酶活力下降；（25.0±0.5）℃溫度組的FPs活力在各生長階段均為最高，其酶活力峰值為6.52 U。

2.1.3 不同溫度條件下HCs活力的變化

半纖維素是植物細(xì)胞中除纖維素外包括木糖、阿拉伯糖、甘露糖、乳糖和糖醛酸等混合組分的一種雜多糖，在植物的纖維物質(zhì)中起著黏接作用。木聚糖是半纖維素的主要組成成分之一，木聚糖酶是HCs的主要誘導(dǎo)酶，半纖維素的降解可以促進(jìn)纖維素及整個纖維素類物質(zhì)的降解，因此菌株分泌木聚糖酶能力的高低在一定程度上能夠反映其對基質(zhì)中半纖維素的降解能力[23]。

圖3 不同培養(yǎng)溫度條件下HCs活力Fig. 3 Changes in HCs activity under different temperature conditions

由圖3可知，在（17.0±0.5）～（25.0±0.5）℃溫度范圍內(nèi)，HCs活力變化趨勢較為一致，在階段4前，HCs活力較低，然后呈“N”型變化，在階段7達(dá)到最大值；（23.0±0.5）℃溫度條件下，酶活力峰值最高，為49.17 U。

2.1.4 不同溫度條件下淀粉酶活力的變化

圖 4 不同培養(yǎng)溫度條件下淀粉酶活力Fig. 4 Changes in amylase activity under different temperature conditions

淀粉是栽培基質(zhì)中主要的非木質(zhì)纖維素營養(yǎng)物質(zhì)，淀粉酶能促進(jìn)淀粉降解為菌絲容易吸收的小分子物質(zhì)。由圖4可知，在栽培溫度（19.0±0.5）～（27.0±0.5）℃時，淀粉酶活力變化趨勢呈“M”型，在階段2和階段6出現(xiàn)雙峰，且在階段6出現(xiàn)最大值；（23.0±0.5）℃時淀粉酶活力在各生長階段均為最高，在階段6的酶活力為38.82 U。在高溫（29.0±0.5）℃條件下，淀粉酶在整個生長期間酶活力變化平緩，維持在3.98～4.30 U之間；低溫（17.0±0.5）℃時，淀粉酶活力在階段6前維持在較低水平，僅在階段6出現(xiàn)酶活力峰值，其最大酶活力為14.1 U。

2.1.5 不同溫度條件下蛋白酶活力的變化

圖5 不同培養(yǎng)溫度條件下蛋白酶活力Fig. 5 Changes in protease activity under different temperature conditions

氮源是合成菌絲細(xì)胞壁、蛋白質(zhì)和核酸等物質(zhì)的重要原料，蛋白酶能催化蛋白質(zhì)水解為氨基酸，為菌絲的生長和向子實體的轉(zhuǎn)化提供有效氮源[24]。由圖5可知，在栽培溫度（17.0±0.5）～（27.0±0.5）℃時，蛋白酶活力變化趨勢相似，呈“波浪”型。在階段1活力較高，隨后下降，在階段3達(dá)到第一個峰值后略有降低，在階段5達(dá)到最高值，此后快速下降；在高溫（29.0±0.5）℃條件下，蛋白酶在階段1活力出現(xiàn)峰值，為4.86 U，然后緩慢下降。在（23.0±0.5）℃條件下，蛋白酶活力高于其他溫度組。

2.2 胞外酶活力與銀耳品質(zhì)的相關(guān)性分析及通徑分析

2.2.1 栽培溫度對胞外酶平均酶活力和銀耳品質(zhì)的影響食用菌不含葉綠素，主要依靠多種胞外酶將周圍環(huán)境中的纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、淀粉和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)水解成小分子物質(zhì)，維持生命過程，完成生活史。因此胞外酶活力的高低決定著食用菌對培養(yǎng)基質(zhì)中物質(zhì)的降解速率，影響食用菌對營養(yǎng)的吸收和利用速率，進(jìn)而決定著食用菌的產(chǎn)量和品質(zhì)。

表1 溫度對胞外酶平均酶活力和銀耳品質(zhì)的影響Table 1 Effect of cultivation temperature on extracellular enzyme average activities and quality of Tremella fuciformis

干生物學(xué)效率是食用菌栽培生產(chǎn)中一個重要指標(biāo)，反映了食用菌對栽培料營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化利用能力。干生物學(xué)效率越高，表示食用菌獲得的營養(yǎng)物質(zhì)越多，產(chǎn)量越高。由表1可知，在實驗溫度范圍內(nèi)，（21.0±0.5）、（23.0±0.5） ℃溫度組銀耳產(chǎn)品的干生物學(xué)效率比其他溫度組明顯高（p＜0.05），其中（23.0±0.5） ℃溫度組的干生物學(xué)效率最高，為（11.89±2.45）%，是（29.0±0.5）℃溫度組的3.67倍，說明溫度是影響銀耳干生物學(xué)效率的一個重要因素。研究發(fā)現(xiàn)，溫度對銀耳干生物學(xué)效率的影響是通過影響栽培過程中胞外酶活力而實現(xiàn)的。在栽培溫度為（23.0±0.5）℃時，漆酶、HCs、淀粉酶和蛋白酶的平均酶活力最高；而在栽培溫度為（29.0±0.5）℃時，這4 種胞外酶平均酶活力最低，說明銀耳干生物學(xué)效率的高低與這4 種胞外酶平均酶活力有一定關(guān)聯(lián)性。胞外酶對干生物學(xué)效率的影響可能與食用菌品種、栽培料基質(zhì)組成等因素有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，草菇的生物學(xué)效率與胞外酶CMCs、木聚糖酶和漆酶活力呈正相關(guān)性，其中漆酶是關(guān)鍵的限制性因子[25]，而黑木耳的生物學(xué)效率與漆酶和多酚氧化酶活力呈正相關(guān)性，與CMCs活力不相關(guān)[26]；Ahlawat等[27]在研究不同栽培基質(zhì)對草菇胞外酶活力及產(chǎn)量的影響時發(fā)現(xiàn)，在經(jīng)巴氏消毒后的水稻秸稈栽培基質(zhì)實驗組中，內(nèi)切葡聚糖酶、漆酶和多酚氧化酶是影響草菇產(chǎn)量的關(guān)鍵胞外酶，而在以堆制發(fā)酵后的水稻秸稈栽培基質(zhì)實驗組中，木聚糖酶和β-葡萄糖甘酶是影響草菇產(chǎn)量的關(guān)鍵胞外酶。

多糖與蛋白質(zhì)是評價銀耳品質(zhì)的2 個重要指標(biāo)。由表1可知，在實驗溫度范圍內(nèi)，（23.0±0.5）℃溫度組的銀耳產(chǎn)品多糖含量最高，為（21.51±0.42）%，與其他溫度組差異顯著（p＜0.05）；（23.0±0.5）、（25.0±0.5）℃溫度組銀耳產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量與其他溫度組有顯著差異（p＜0.05），兩組產(chǎn)品的蛋白質(zhì)含量分別為（8.53±0.62）%和（8.34±1.94）%。在高溫（29.0±0.5）℃條件下，除CMCs外其他胞外酶平均酶活力均低于其他溫度組，造成所得銀耳品質(zhì)相對較低，其多糖含量和蛋白質(zhì)含量僅為（4.93±2.47）%和（5.16±1.94）%。

2.2.2 胞外酶活力與銀耳品質(zhì)的相關(guān)性分析

為考察不同胞外酶活力大小對銀耳產(chǎn)品品質(zhì)的影響，對7 種胞外酶在不同溫度條件下所得銀耳產(chǎn)品的3 個品質(zhì)指標(biāo)與平均酶活力進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果見表2。所測胞外酶的平均酶活力除CMCs外與干生物學(xué)效率和多糖含量2 個銀耳品質(zhì)呈正相關(guān)性。其中，銀耳產(chǎn)品的干生物學(xué)效率與漆酶、HCs和淀粉酶的平均酶活力呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與蛋白酶的平均酶活力顯著正相關(guān)（p＜0.05）；銀耳產(chǎn)品的多糖含量與漆酶、淀粉酶和蛋白酶的平均酶活力呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（p＜0.01），與HCs的平均酶活力顯著正相關(guān)（p＜0.05）。蛋白質(zhì)含量與7 種胞外酶平均酶活力均呈正相關(guān)，與漆酶、MnPs、淀粉酶和蛋白酶的平均酶活力呈極顯著正相關(guān)（p＜0.01），與FPs的平均酶活力顯著正相關(guān)（p＜0.05）。CMCs的平均酶活力與3 個品質(zhì)指標(biāo)的相關(guān)性不顯著（P＞0.05）。

表2 胞外酶平均酶活力與銀耳品質(zhì)的相關(guān)性分析Table 2 Correlation between the average activity of extracellular enzymes and the quality of Tremella fuciformis

2.2.3 胞外酶活力與銀耳品質(zhì)的通徑分析

胞外酶活力與銀耳品質(zhì)之間的相關(guān)性分析只能表明兩者之間的直接關(guān)系，而不同酶之間相互作用對銀耳品質(zhì)的影響沒有直觀表現(xiàn)，因此需在相關(guān)性分析基礎(chǔ)上進(jìn)行通徑分析，把胞外酶活力與銀耳品質(zhì)的相關(guān)性分解為直接作用和間接作用，以明確不同胞外酶活力的相互作用對品質(zhì)的效應(yīng)大小。

分別以銀耳品質(zhì)指標(biāo)——干生物學(xué)效率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量為因變量Y1、Y2和Y3，漆酶、MnPs、CMCs、FPs、HCs、淀粉酶和蛋白酶的平均酶活力為自變量X1、X2、X3、X4、X5、X6和X7，采用偏回歸分析法建立Y1、Y2和Y3的最優(yōu)多元回歸方程（剔除偏回歸系數(shù)不顯著的自變量），分別為Y1＝0.371-0.039X3+0.186X5+1.430X7（F＝396.804，p＜0.001），Y2＝-11.845-0.010X1-0.703X4+0.283X5+4.699X7（F＝22 842.602，p＜0.001），Y3＝0.874+0.039X2+0.523X7（F＝1 378.535，p＜0.001），3 個方程的顯著性檢驗表明具有顯著意義，進(jìn)一步做通徑分析。

表3 以干生物學(xué)效率為因變量的通徑分析Table 3 Path analysis using drying biology eff i ciency as dependent variable

由表3可以看出，在與干生物學(xué)效率（Y1）的簡單相關(guān)性中，3 個自變量與Y1的相關(guān)性程度大小為X5＞X7＞X3，直接通徑作用的關(guān)聯(lián)程度為X7＞X5＞X3。通過分析各個間接通徑系數(shù)發(fā)現(xiàn)，X5通過X3和X7對Y1的間接作用高于X7通過X3和X5對Y1的間接作用（0.558＞0.336），從而使X5對Y1的影響高于X7；X3對Y1的直接和間接作用均表現(xiàn)為負(fù)效應(yīng)，說明當(dāng)栽培基質(zhì)中CMCs酶活力高時，將降低銀耳產(chǎn)品的干生物學(xué)效率。決策系數(shù)是通徑分析中的決策指標(biāo)，用于自變量對因變量的綜合作用進(jìn)行排序，確定主要決策變量和限制變量[28]。3 個自變量對Y1的決策性大小為X7＞X5＞X3，說明蛋白酶變量對Y1的綜合作用是最大的，這種影響效應(yīng)包括直接作用以及與其他胞外酶的協(xié)同作用。

表4 以多糖含量為因變量的通徑分析Table 4 Path analysis using polysaccharide content as dependent variable

由表4可以看出，在與多糖含量（Y2）的簡單相關(guān)性中，4 個自變量與Y2的相關(guān)性程度大小為X7＞X1＞X5＞X4，直接通徑作用的關(guān)聯(lián)程度為X7＞X5＞X1＞X4。X7與Y2的相關(guān)程度和直接通徑作用均為最大，表明在以提高銀耳產(chǎn)品多糖含量的目標(biāo)中應(yīng)重點把握蛋白酶這一因素；雖然X1和X4對Y2的直接通徑作用表現(xiàn)為負(fù)影響，但二者通過與X5和X7的間接作用而表現(xiàn)出對Y2的正影響，而且間接作用程度較大，所以與Y2的正相關(guān)程度仍然很高；X5對Y2的直接通徑作用小于通過蛋白酶變量的間接作用；決策系數(shù)的大小說明蛋白酶變量對Y2的綜合作用是最大的。

表5 以蛋白質(zhì)含量為因變量的通徑分析Table 5 Path analysis using protein content as dependent variable

由表5可知，X2和X7均與蛋白質(zhì)含量（Y3）有較大的正相關(guān)性；X2對Y3的直接作用大于X7；X7通過X2對Y3的間接作用大于X2的間接作用；決策系數(shù)說明X2對Y3的綜合作用是最大的。

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)溫度對銀耳栽培基質(zhì)中的7 種胞外酶活力的影響主要體現(xiàn)在兩方面，一是溫度對胞外酶活力變化規(guī)律的影響；二是溫度對各種胞外酶活力大小的影響。在栽培溫度（19.0±0.5）～（27.0±0.5）℃范圍內(nèi)，不同溫度組的銀耳漆酶活力變化規(guī)律是一致的，說明此溫度范圍是漆酶活力適宜溫度條件，（23.0±0.5）℃溫度組的漆酶活力最高。同理，MnPs、FPs和蛋白酶活力的適宜溫度范圍為（17.0±0.5）～（27.0±0.5）℃，HCs酶活力的適宜溫度范圍為（17.0±0.5）～（25.0±0.5）℃，淀粉酶活力的適宜溫度范圍為（19.0±0.5）～（27.0±0.5）℃。銀耳CMCs是一種中高溫酶，在實驗溫度范圍內(nèi)，其酶活力隨溫度的升高而增加，在（29.0±0.5）℃條件下酶活力最高。銀耳7 種胞外酶中除MnPs、CMCs和FPs外，其余4 種胞外酶活力的最適溫度為（23.0±0.5）℃，可將此溫度作為銀耳工廠化栽培的指導(dǎo)溫度。

食用菌胞外酶活力與菌絲生長和子實體發(fā)育有密不可分的關(guān)系[29]。當(dāng)食用菌各種胞外酶活力的動態(tài)變化符合菌體生長及發(fā)育的規(guī)律時，才能完成由營養(yǎng)生長向生殖生長的轉(zhuǎn)變[30]。在適宜的溫度范圍內(nèi)，銀耳栽培基質(zhì)中7 種胞外酶的活力變化具有明顯的階段性。在銀耳菌絲生長期，培養(yǎng)基質(zhì)中的木質(zhì)素酶系（漆酶和MnPs）酶活力較強(qiáng)，同時淀粉酶和蛋白酶也表現(xiàn)出較高活力（可能主要作用于基質(zhì)中已有的少量淀粉和蛋白質(zhì)底物）；在銀耳菌絲營養(yǎng)生長向生殖生長過度期間，木質(zhì)素酶系的酶活力達(dá)到最大峰值，纖維素酶系（CMCs和FPs）酶活力在此階段逐漸增強(qiáng)，蛋白酶活力出現(xiàn)峰值；在銀耳子實體生長發(fā)育期，纖維素酶系、HCs、淀粉酶和蛋白酶均出現(xiàn)最大酶活力，木質(zhì)素酶系酶活力呈快速下降趨勢。由此可見，銀耳菌絲先降解基質(zhì)中木質(zhì)素等結(jié)構(gòu)復(fù)雜的非碳源物質(zhì)，再直接利用已存在的淀粉和蛋白質(zhì)，為后續(xù)降解提供有利條件；等到子實體發(fā)育階段需要大量能量時，再降解纖維素、半纖維素等物質(zhì)。銀耳胞外酶這種階段性的變化規(guī)律與在香菇[31]、平菇[32]、金針菇[33]、白靈菇[34]、黑木耳[35]、雙孢蘑菇[36]等食用菌上的研究結(jié)果相似。

基質(zhì)中胞外酶活力的變化和強(qiáng)弱常能反映出菌絲生理生化的活躍程度和基質(zhì)中化學(xué)組分的降解特性，胞外酶的活躍程度和食用菌生長發(fā)育及生物量息息相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在不同溫度條件下，銀耳胞外酶平均酶活力大小存在較大差異性，造成各組銀耳產(chǎn)品的干生物學(xué)效率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量差異顯著。在栽培溫度（23.0±0.5）℃時，基質(zhì)中主要胞外酶具有高活力，所得銀耳的干生物學(xué)效率、多糖含量和蛋白質(zhì)含量在7 個溫度組中最高；在（29.0±0.5）℃時，銀耳胞外酶（除CMCs外）的平均酶活力最低，造成所得銀耳品質(zhì)也最低。將銀耳胞外酶的平均酶活力與銀耳品質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，所測胞外酶平均酶活力（除CMCs外）與干生物學(xué)效率和多糖含量2 個銀耳品質(zhì)呈正相關(guān)性，蛋白質(zhì)含量與7 種胞外酶平均活力均呈正相關(guān)性。為進(jìn)一步考察不同胞外酶之間相互作用對銀耳品質(zhì)的影響，采用逐步線性回歸法在相關(guān)性分析基礎(chǔ)上進(jìn)行通徑分析，結(jié)果表明，蛋白酶對干生物學(xué)效率的綜合作用是最大的，這種影響效應(yīng)包括直接作用和HCs、CMCs的間接作用；同時，蛋白酶通過直接作用和漆酶、FPs、HCs的間接作用對多糖含量影響最大；MnPs和蛋白酶通過直接及相互間接作用影響銀耳蛋白質(zhì)含量。由此可見，蛋白酶是影響銀耳營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵胞外酶。此結(jié)論與莊慶利[37]的研究結(jié)果相似，他發(fā)現(xiàn)平菇胞外蛋白酶活力與第一茬菇產(chǎn)量有極顯著的正相關(guān)性，依據(jù)不同的生長階段淀粉酶、蛋白酶、過氧化物酶和CMCs活力的高低可預(yù)測第一茬菇產(chǎn)量的高低。

綜上所訴，在栽培溫度（23.0±0.5）℃時，基質(zhì)中主要胞外酶具有高活力，銀耳的營養(yǎng)品質(zhì)指標(biāo)（干生物學(xué)效率、多糖含量、蛋白質(zhì)含量）最高，因此可將此溫度作為銀耳工廠化栽培的指導(dǎo)溫度；蛋白酶是影響銀耳營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)鍵胞外酶，在工廠化生產(chǎn)中，可通過調(diào)節(jié)栽培溫度、改良基質(zhì)配方（調(diào)整基質(zhì)中C/N）及良種培育等技術(shù)手段提升蛋白酶活力，以達(dá)到增產(chǎn)增效的目的。

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Effect of Cultivation Temperature on Extracellular Enzyme Activities and Nutritional Quality Characteristics of Tremella fuciformis

CHEN Gang1, ZHAN Yong1, YANG Yong1, WU Zhen1, XIE Huichuan2, SHI Wenjuan2, CHAI Jiayan2, GONG Hurong2, LUO Yang1,*
(1. Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China;
2. Chongqing Engineering Research Center for Tremella Nutrition Food Enterprises, Chongqing 409003, China)

In order to provide a theoretical basis for growth regulation and eff i cient cultivation of Tremella fuciformis, the effects of different cultivation temperatures on seven extracellular enzyme activities at various growth and development stages and nutritional quality characteristics of Tremella fuciformis were studied. Meanwhile, the relative importance of seven extracellular enzymes for the nutritional quality of Tremella fuciformis was discussed by correlation analysis and path analysis. The results showed that the changes in the activity of extracellular enzymes of the same type were similar and the changes in all enzyme activities tested were stepwise in the appropriate temperature range. Comparative study revealed that the dry biological eff i ciency, polysaccharide content and protein content of mature Tremella fuciformis were the highest at (23.0 ± 0.5)℃ among seven cultivation temperatures, which were 35.67%, 21.51% and 8.53%, respectively.Correlation analysis showed that the average activity of all extracellular enzymes except carboxymethyl cellulase was positively correlated with dry biological eff i ciency and polysaccharide content, and protein content was positively correlated with the average activity of all seven extracellular enzymes. Further, path analysis showed that protease was a key factor for the nutritional quality of Tremella fuciformis. Collectively, these results indicated at (23.0±0.5)℃, the activity of key extracellular enzymes was higher and the nutritional quality of Tremella fuciformis was the best. Therefore, (23.0 ± 0.5)℃can be recommended for industrial cultivation of Tremella fuciformis.

temperature; Tremella fuciformis; extracellular enzyme; enzyme activity; nutritional quality

10.7506/spkx1002-6630-201723019

TS255.1；S318

A

1002-6630（2017）23-0113-08

2016-09-13

重慶市科技攻關(guān)項目（cstc2013yykfa80004）；重慶市科技支撐示范工程項目（cstc2015jcsf-kjfp80014）；重慶市社會事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項（cstc2016shmszx80077）

陳崗（1978—），男，助理研究員，碩士，研究方向為食用菌的開發(fā)利用。E-mail：zyychengang@163.com

*通信作者：羅楊（1986—），女，助理研究員，碩士，研究方向為中藥健康食品研發(fā)。E-mail：122056563@qq.com

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