基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

何彥平，金 涌，陳 達(dá)，邢仕歌，王燕飛，薛 強(qiáng)，齊小花，鄒明強(qiáng),*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；2.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；3.中檢國研（北京）科技有限公司，北京 100123）

基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

何彥平1,2，金 涌1,3，陳 達(dá)2，邢仕歌1，王燕飛1,3，薛 強(qiáng)1,3，齊小花1,3，鄒明強(qiáng)1,3,*

（1.中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京 100123；2.天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院，天津 300072；3.中檢國研（北京）科技有限公司，北京 100123）

廣義人工模擬抗體包括適配體、重組受體、分子印跡聚合物及多肽。人工模擬抗體與傳統(tǒng)抗體相比優(yōu)勢顯著，其具有易實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)、成本低、保存方便、可反復(fù)使用等特點(diǎn)。酶聯(lián)檢測技術(shù)是人工模擬抗體在食品安全檢測中應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)。本文綜述了人工模擬抗體的特點(diǎn)以及基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用。

適配體；重組受體；分子印跡聚合物；多肽；人工模擬抗體；酶聯(lián)檢測技術(shù)；食品安全檢測

人工模擬抗體是廣義上的抗體，其模擬抗體-抗原專一性相互作用，以分子識別為基礎(chǔ)與目標(biāo)物特異性結(jié)合，包括適配體[1-4]、重組受體[5-6]、分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）[7-10]和多肽[11]。之前的研究中，人工模擬抗體被定義為一種具有分子識別能力的新型高分子材料（MIP）[12]。隨著新型檢測元件的發(fā)展，人工模擬抗體的范圍越來越廣，其包括單鏈DNA或RNA分子、重組蛋白、新型高分子材料和多肽，因具有分子識別能力而作為檢測元件應(yīng)用于多種檢測技術(shù)。近年來，人工模擬抗體的研究聚焦于替代傳統(tǒng)抗體應(yīng)用于疾病診斷[13-14]、食品安全檢測等領(lǐng)域，以降低檢測成本，提高檢測的穩(wěn)定性和靈敏度。在食品安全檢測中，適配體、重組受體、MIP和多肽可以替代傳統(tǒng)抗體作為檢測元件，并在酶聯(lián)檢測方法中有較多應(yīng)用。

酶聯(lián)檢測方法發(fā)展于20世紀(jì)70年代，具有高準(zhǔn)確性和特異性。基于人工模擬抗體，酶聯(lián)檢測方法以人工模擬抗體作為檢測元件，酶作為標(biāo)記物，因成本低、檢測元件來源廣泛等優(yōu)勢在食品安全檢測中應(yīng)用日益廣泛。本文將對人工模擬抗體以及基于人工模擬抗體酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用展開論述。

1 基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

1.1 基于適配體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

圖1 人工模擬抗體與目標(biāo)物示意圖Fig. 1 Schematic illustration of artif i cial antibodies and targets

寡核苷酸適配體，又稱適配體[1-2]，是通過指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選得到的能夠與相應(yīng)配體靶分子特異性緊密結(jié)合的單鏈DNA或RNA分子。單鏈寡核苷酸堿基之間的相互作用會形成許多空間構(gòu)象（如發(fā)卡、假結(jié)、口袋或G-四堿基體等），基于這些獨(dú)特的三維空間構(gòu)象匹配、序列中堿基的堆積作用、帶電基團(tuán)之間的靜電作用或氫鍵作用，適配體實(shí)現(xiàn)與靶分子的高親和力高特異性結(jié)合[1,15]（圖1A）。與傳統(tǒng)抗體相比[16]，適配體的優(yōu)點(diǎn)是靶分子范圍廣、篩選周期短等；但RNA適配體易被酶降解，多數(shù)適配體親和力略差于傳統(tǒng)抗體（表1）。

表1 人工模擬抗體與傳統(tǒng)抗體比較Table 1 Comparison of artif i cial and conventional antibodies

在食品安全檢測中，由于適配體易于篩選和制備，基于適配體的酶聯(lián)檢測技術(shù)有著廣泛的應(yīng)用（表2）。Barthelmebs等[17]建立了基于適配體酶聯(lián)檢測直接競爭模式，可以快速檢測紅酒中的赭曲霉毒素A。該方法是以HRP作為標(biāo)記酶，四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）作為底物的比色法。赭曲霉毒素A適配體的平衡解離常數(shù)（KD）為130 nmol/L，與赭曲霉毒素B和苯基丙氨酸幾乎無交叉反應(yīng)。

Wang Sai等[18]建立了基于適配體酶聯(lián)檢測的間接競爭方法快速檢測蜂蜜里的四環(huán)素殘留。四環(huán)素適配體的KD是63.6 nmol/L，與四環(huán)素類似物幾乎無交叉反應(yīng)；與其他方法相比，該方法有更高的靈敏度（檢測限是9.6×10-3ng/mL）、更寬的線性范圍（0.01～100 ng/mL）和更高的回收率（蜂蜜中平均回收率為93.23%）。Wang Yuankai等[19]篩選出玉米赤霉烯酮單抗的適配體，通過間接競爭酶聯(lián)方法提高玉米赤霉烯酮檢測限，拓寬了適配體在酶聯(lián)檢測技術(shù)中的應(yīng)用，將檢測物單抗的適配體運(yùn)用到檢測方法中，提高了檢測的特異性和靈敏度。

表2 基于人工模擬抗體酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全中的應(yīng)用Table 2 Applications of enzyme-linked assays based on arti fi cial antibodies in food safety detection

Nie Ji等[20]首次建立了基于適配體的夾心法檢測可卡因。該方法將可卡因的適配體剪成2 個(gè)片段，一個(gè)片段固定到96 孔板上，另一個(gè)片段標(biāo)記生物素；當(dāng)2 個(gè)片段和目標(biāo)物同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，就會形成一個(gè)適配體片段/目標(biāo)物的復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)了夾心法檢測目標(biāo)物，提高可卡因檢測的特異性和靈敏度。

綜上所述，目前基于適配體酶聯(lián)檢測技術(shù)包括直接競爭法、間接競爭法和夾心法。夾心法創(chuàng)造性地將一個(gè)適配體剪成2 段應(yīng)用到分析技術(shù)中，可有效提高檢測的靈敏度和特異性，是基于適配體酶聯(lián)檢測技術(shù)的一個(gè)重要發(fā)展方向。

1.2 基于重組受體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

受體（receptor）[29-30]是一類存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)的特殊蛋白質(zhì)，其能與細(xì)胞外專一信號分子結(jié)合進(jìn)而激活細(xì)胞內(nèi)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，使細(xì)胞對外界刺激產(chǎn)生相應(yīng)效應(yīng)。重組受體[21-23]可通過基因工程的方法在細(xì)胞中大量表達(dá)，利用受體可特異結(jié)合信號物質(zhì)（配體）的特性，可將純化的重組受體作為檢測元件應(yīng)用到分析技術(shù)中（圖1B）。重組受體可以對一類藥物進(jìn)行多殘留檢測，如Liang Xiao等[21]建立酶聯(lián)磺胺受體（dihydropteroate synthase，DHPS）檢測方法，可以檢測9 種磺胺類藥物和對氨基苯甲酸，而抗體大多只能特異性的檢測一種或少數(shù)幾種物質(zhì)（表1）；但重組受體由于分子質(zhì)量較大，在表達(dá)純化過程中易由于不正確折疊而失去活性。

在食品安全檢測中，基于受體的酶聯(lián)檢測技術(shù)因能實(shí)現(xiàn)多殘留檢測從而應(yīng)用日益廣泛（表2）。Seifert等[5]以POD為標(biāo)記酶，建立基于人類雌激素α受體酶聯(lián)檢測方法，高通量低成本地篩查水樣品中的17 beta-雌二醇。當(dāng)配體是17 beta-雌二醇時(shí)，該受體的KD是2.33×10-10mol/L，與17 beta-雌二醇類似物有較強(qiáng)交叉反應(yīng)，與其他物質(zhì)無交叉反應(yīng)。Cheng Guyue等[23]建立了一個(gè)基于敘利亞倉鼠beta2-腎上腺素受體酶聯(lián)檢測方法，該方法可以篩查動(dòng)物飼料中的3 個(gè)beta-激動(dòng)劑（RAC、克倫特羅和沙丁胺醇），對RAC的靈敏度是5.20 μg/L，對克倫特羅和沙丁胺醇的交叉反應(yīng)分別是87.7%和58.5%；與傳統(tǒng)方法比，該方法整個(gè)過程只需要45 min（更快速）且可同時(shí)檢測一組beta-激動(dòng)劑（高通量）。Zhang Jing等[22]運(yùn)用可溶的青霉素結(jié)合蛋白3（soluble form of penicillin-binding protein 3，sPBP3）建立了酶聯(lián)檢測方法檢測牛乳中的青霉素類和頭孢菌素類抗生素。該受體與27 種beta-內(nèi)酰胺類藥物有很強(qiáng)交叉反應(yīng)；建立的方法可以檢測11 種青霉素類和16 種頭孢菌素類抗生素，且檢測限都在歐盟設(shè)定的最大殘留限定（maximum residue levels，MRLs）之下。

基于受體酶聯(lián)檢測技術(shù)檢測目標(biāo)物數(shù)量最高可達(dá)27種，可以有效地提高檢測效率，降低檢測成本，最大限度滿足食品安全檢測中多殘留檢測的要求。由于重組受體的特異性弱，該技術(shù)無法區(qū)分有交叉反應(yīng)的目標(biāo)物，不適合食品安全中特定目標(biāo)物的檢測。

1.3 基于MIP酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

MIP[31]是一種具有分子識別能力的新型高分子材料。在模板分子存在的情況下，功能單體和交聯(lián)劑由引發(fā)劑引發(fā)而發(fā)生共聚合。由于模板分子和功能單體之間存在共價(jià)或非共價(jià)的作用，功能單體按照一定的順序排列在模板分子的周圍。洗去模板分子后，這樣在聚合物中就留下與模板分子大小、形狀、功能團(tuán)互補(bǔ)的孔穴，表現(xiàn)出分子配位識別效應(yīng)（圖1C）。MIP與傳統(tǒng)抗體相比[7,31-32]，對制備技術(shù)要求不高，并且具有良好的耐酸、堿、高溫等性質(zhì)，合成成本低，保存時(shí)間長等優(yōu)點(diǎn)；但MIP的親和力和特異性要略差于傳統(tǒng)抗體（表1）。

在食品安全檢測中，因MIP成本低且制備簡便，基于MIP的酶聯(lián)檢測技術(shù)具有廣泛應(yīng)用（表2）。Surugiu等[24]使用TOP作為標(biāo)記物建立了基于MIP酶聯(lián)檢測方法用于檢2,4-D。該方法比酶聯(lián)免疫吸附測定法成本低且穩(wěn)定性更好。Fang Guozhen等[25]制備分子印跡膜作為人工模擬抗體，建立直接競爭的基于分子印跡膜酶聯(lián)檢測方法檢測尿液和豬肉樣品中的RAC。該方法靈敏度高（半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為15.77 μg/L）、檢測限低（IC15為0.01 μg/L），與高效液相色譜的結(jié)果相關(guān)系數(shù)大于0.99。Liu Huilin等[26]建立了一個(gè)直接競爭的基于分子印跡膜酶聯(lián)檢測方法檢測水和土壤中的TBM，該檢測方法靈敏度高（IC50為19.73 μg/L）且檢測限低（IC15為0.30 μg/L）。與TBM抗體相比，TBM分子印跡膜成本更低、穩(wěn)定性更好且制備周期更短。

基于MIP酶聯(lián)檢測技術(shù)能達(dá)到較低的檢測限和較高的回收率；其最大的優(yōu)勢是可以直接在96 孔板中合成，合成過程簡單、周期短、成本低。由于MIP的目標(biāo)物是小分子，該技術(shù)對食品安全中的大分子有毒有害物質(zhì)無法檢測。

1.4 基于多肽的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用

人工模擬抗體多肽[11]由2～50 個(gè)氨基酸組成，具有分子識別能力，可以與目標(biāo)物特異性結(jié)合。近年來，人工模擬抗體多肽由于結(jié)構(gòu)簡單、易實(shí)現(xiàn)非競爭法檢測小分子物質(zhì)，在檢測領(lǐng)域有了長足的發(fā)展，其主要包括來源于噬菌體展示的多肽[33-34]（圖1D）、設(shè)計(jì)合成的多肽[35]、小型化受體的多肽[36]和配體來源的多肽[37]。人工模擬抗體多肽易于化學(xué)合成、成本低廉；但其親和力略差于傳統(tǒng)抗體。

在食品安全檢測中，因多肽篩選與鑒定效率高并可以建立非競爭的檢測模式，基于多肽酶聯(lián)檢測技術(shù)包括噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法（phage anti-immunocomplex assay，PHAIA）受到越來越多的重視。Dong Jiexian等[27]建立基于多肽的非競爭的噬菌體抗免疫復(fù)合物分析法檢測魚樣品中的孔雀石綠和無色孔雀石綠。該方法的靈敏度是抗體競爭法的16 倍。Vanrell等[28]通過化學(xué)法合成了來源于噬菌體展示的多肽，并使用該多肽建立了非競爭酶聯(lián)檢測方法用于檢測草達(dá)滅和廣滅靈，與抗體競爭法相比靈敏度分別提高了18 倍和3.3 倍。

基于多肽酶聯(lián)分析方法可以建立非競爭方法檢測食品中有毒有害的物質(zhì)，提高了方法的靈敏度和陽性檢出率。作為新型檢測元件，多肽在食品安全檢測中的應(yīng)用將是一個(gè)重要方向。

2 結(jié) 語

人工模擬抗體非來源于傳統(tǒng)抗體，模仿傳統(tǒng)抗體作為分子識別元件應(yīng)用于分析檢測。由于食品安全檢測中目標(biāo)物（大多是半抗原小分子物質(zhì)）的傳統(tǒng)抗體較難獲得，人工模擬抗體將替代傳統(tǒng)抗體在分析檢測中發(fā)揮更大的作用。在未來的食品安全檢測中，人工模擬抗體將會在以下兩方面得到更進(jìn)一步的發(fā)展。

首先，更多的新型檢測材料將作為人工模擬抗體應(yīng)用于檢測中。人工模擬抗體的來源廣泛，可以是DNA或RNA（適配體）、重組蛋白（重組受體）、多肽、小分子聚合材料（MIP）或是其他來源的物質(zhì)。只要該物質(zhì)具有檢測元件所必須的特異性和敏感性，并具有比傳統(tǒng)抗體更優(yōu)越的性能，能夠作為其補(bǔ)充和延伸，替代傳統(tǒng)抗體作為分析技術(shù)中的檢測元件，它就可以被定義為人工模擬抗體。目前學(xué)者研究較多的人工模擬抗體包括適配體、重組受體、MIP和多肽。新型檢測材料作為人工模擬抗體需要很長的探索階段和更多的實(shí)驗(yàn)考證。隨著技術(shù)的發(fā)展，相信會有更多的人工模擬抗體替代傳統(tǒng)抗體在食品安全分析技術(shù)中廣泛使用。

其次，人工模擬抗體將會應(yīng)用到各種新興的分析技術(shù)中。免疫學(xué)檢測技術(shù)有放射免疫法、酶聯(lián)免疫分析法、化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。其中，酶聯(lián)分析方法因靈敏度高、操作簡便、成本低而發(fā)展得最為成熟。基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)是人工模擬抗體替代傳統(tǒng)抗體在食品安全檢測中應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，主要應(yīng)用于真菌毒素殘留、農(nóng)獸藥殘留等。人工模擬抗體在其他食品安全免疫學(xué)檢測技術(shù)中的應(yīng)用也有報(bào)道，如膠體金層析法[38-39]、電化學(xué)傳感器技術(shù)[40]等。隨著食品安全檢測技術(shù)的發(fā)展，人工模擬抗體將會和一些新興的分析技術(shù)相結(jié)合，如時(shí)間分辨熒光免疫分析法、均相免疫分析技術(shù)、微流控技術(shù)等，以提高檢測靈敏度及降低檢測成本。

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Application of Arti fi cial Antibody in Enzyme-Linked Assay for Food Safety Detection

HE Yanping1,2, JIN Yong1,3, CHEN Da2, XING Shige1, WANG Yanfei1,3, XUE Qiang1,3, QI Xiaohua1,3, ZOU Mingqiang1,3,*
(1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100123, China; 2. School of Precision Instrument and Optoelectronics Engineering, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 3. Zhong Jian Guo Yan (Beijing) Technology Co. Ltd., Beijing 100123, China)

Generalized artif i cial antibodies include aptamers, recombinant receptors, molecularly imprinted polymers and polypeptides. Artificial antibodies are significantly advantageous over conventional antibodies in terms of their ease of industrial production, low cost, ease of storage and reutilizability. In food safety detection, the most widely used technique is enzyme-linked assay based on artif i cial antibody. This paper reviews the benef i ts and drawbacks of applying aptamers,receptor, molecularly imprinted polymers and polypeptides in enzyme-linked assay, as well as the prospect of artificial antibody in enzyme-linked assay for food safety detection.

aptamer; recombinant receptor; molecularly imprinted polymer; polypeptide; artif i cial antibody; enzyme-linked assay; food safety detection

10.7506/spkx1002-6630-201723049

TS201.6

A

1002-6630（2017）23-0313-05

何彥平, 金涌, 陳達(dá), 等. 基于人工模擬抗體的酶聯(lián)檢測技術(shù)在食品安全檢測中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(23): 313-317.

10.7506/spkx1002-6630-201723049. http://www.spkx.net.cn

HE Yanping, JIN Yong, CHEN Da, et al. Application of artificial antibody in enzyme-linked assay for food safety detection[J]. Food Science, 2017, 38(23): 313-317. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201723049. http://www.spkx.net.cn

2016-09-05

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃重點(diǎn)專項(xiàng)（2016YFF0203802）；“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2015BAK44B01）；國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（21305101）；國家重大科學(xué)儀器設(shè)備開發(fā)專項(xiàng)（2012YQ0901970501）

何彥平（1985—），男，博士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：heyanping85521@163.com

*通信作者：鄒明強(qiáng)（1964—），男，研究員，博士，研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測。E-mail：mingqiangz@sina.com