NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)P物質(zhì)作用后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、炎性因子表達(dá)的影響

習(xí)亮，梁偉，張永峰

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 西京醫(yī)院，西安710032)

NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)P物質(zhì)作用后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP、炎性因子表達(dá)的影響

習(xí)亮，梁偉，張永峰

(第四軍醫(yī)大學(xué)附屬第一醫(yī)院 西京醫(yī)院，西安710032)

目的探討NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)P物質(zhì)(SP)作用后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、TNF-α、IL-1β及NO表達(dá)的影響。方法將脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、SP組和抑制劑組。SP組用含有SP的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，抑制劑組用含有SP及NF-κB抑制劑SN50的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，調(diào)整SP終濃度為1×10-7mol/L、SN50終濃度為10 μmol/L；對(duì)照組僅加入細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。各組作用24 h，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB p65二聚體(NF-κB p65)表達(dá)，免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞GFAP表達(dá)，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β表達(dá)，硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO表達(dá)。結(jié)果SP組和抑制劑組NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量、GFAP表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。SP組和抑制劑組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、NO表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。結(jié)論SP能夠促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并分泌NO、TNF-α、IL-1β，NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50能夠降低SP的上述作用。

脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞；P物質(zhì)；核轉(zhuǎn)錄因子κB；膠質(zhì)纖維酸性蛋白；腫瘤壞死因子α；白細(xì)胞介素1β

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是除神經(jīng)元以外的第二大類神經(jīng)細(xì)胞，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中病理性疼痛傳遞和產(chǎn)生的參與者[1]。P物質(zhì)(SP)具有調(diào)控脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的作用，慢性疼痛能夠通過(guò)SP、炎癥因子等傳遞至脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，從而影響細(xì)胞功能的發(fā)揮[2～4]。已有研究表明，SP能夠活化脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞[5]。NF-κB參與多種組織、器官炎癥的發(fā)生過(guò)程，檢測(cè)NF-κB p65二聚體水平可以間接反映NF-κB信號(hào)通路的狀態(tài)[6]。2016年2月～2017年1月， 本研究觀察了NF-κB信號(hào)通路抑制劑對(duì)SP作用后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)及炎性因子分泌的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 細(xì)胞：參照劉濤等[7]的方法于SPF乳鼠中分離、培養(yǎng)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞貼壁后經(jīng)GFAP免疫熒光鑒定為脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞。主要試劑：FBS購(gòu)于杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶、PBS購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，NF-κB p65單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體購(gòu)自于上海威奧生物科技有限公司，NF-κB抑制劑SN50購(gòu)于美國(guó)AnaSpec公司，NO檢測(cè)試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)于碧云天生物技術(shù)研究所，TNF-α、IL-1β檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于上海弘順生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 取培養(yǎng)至第3代的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組、SP組和抑制劑組。SP組用含有SP的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，調(diào)整其終濃度為1×10-7mol/L；抑制劑組用含有SP及NF-κB抑制劑SN50的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，分別調(diào)整其終濃度為1×10-7mol/L、10 μmol/L；對(duì)照組用不含有SP和NF-κB抑制劑SN50的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。將脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞以2×106個(gè)/孔接種至6孔板中，參照1.2的方法進(jìn)行分組處理。培養(yǎng)24 h，用PBS洗滌細(xì)胞2次，每孔加入200 μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解10 min。用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，超聲粉碎5次，每次5 s；8 000 r/min離心5 min，吸取上清液，-70 ℃保存。采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白樣品濃度，將蛋白樣品與上樣緩沖液以1∶1的比例混合后于100 ℃水中煮沸5 min。加入到凝膠電泳(10%分離膠、4%濃縮膠)上樣孔中，每孔加入40 μg蛋白樣品，80 V電壓電泳30 min，120 V電壓至結(jié)束。50 V電壓在4 ℃條件下轉(zhuǎn)膜12 h，5%脫脂奶粉在37 ℃條件下封閉90 min。加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜；加入二抗(1∶2 000)，37 ℃孵育90 min。采用圖像分析軟件分析目的蛋白及內(nèi)參蛋白GAPDH條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值計(jì)算NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 細(xì)胞GFAP表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。取1.2中培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，0.1 mol/L PBS洗滌后，加入含5%乙酸的95%乙醇，-20 ℃固定20 min。0.1 mol/L PBS洗滌，加入Tris-HCL緩沖液37 ℃孵育15 min。加入100倍稀釋的GFAP抗體，37 ℃孵育30 min，加入50倍稀釋的GFAP二抗，37 ℃孵育60 min。0.1 mol/L PBS洗滌，50%甘油封片。以PBS代替GFAP抗體作為陰性對(duì)照，于200倍顯微鏡下采用ImageJ軟件計(jì)算積分光密度(IOD)值，以此表示GFAP表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β表達(dá)檢測(cè) 采用ELISA法。取1.2中培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，收集培養(yǎng)液上清，按照ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)液上清NO表達(dá)檢測(cè) 采用硝酸還原酶法。取1.2中培養(yǎng)24 h的各組細(xì)胞，收集培養(yǎng)液上清，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)NO表達(dá)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組NF-κB p65、GFAP表達(dá)比較 SP組和抑制劑組NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量、GFAP表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組NF-κB p65、GFAP表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與SP組比較，#P<0.05。

2.2 各組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β及NO表達(dá)比較 SP組和抑制劑組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、NO表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯(P均<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β及NO表達(dá)比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與SP組比較，#P<0.05。

3 討論

星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布最廣的一種膠質(zhì)細(xì)胞，存在于腦、脊髓等組織中，對(duì)神經(jīng)元具有支持、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)、修復(fù)等作用[8～11]。近年來(lái)研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的痛覺(jué)傳導(dǎo)有關(guān)。SP在中樞神經(jīng)和周?chē)窠?jīng)中廣泛存在，是一種神經(jīng)遞質(zhì)，參與中樞疼痛感的傳導(dǎo)，在多種慢性疼痛組織SP均升高。研究表明，一定濃度的SP能夠誘發(fā)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化[12]。

NF-κB是一種存在于多種組織細(xì)胞中的核轉(zhuǎn)錄因子，在皮膚、肺、淋巴結(jié)、骨骼、胚胎組織中均有廣泛表達(dá)[13]。NF-κB具有調(diào)控炎癥因子和免疫相關(guān)基因表達(dá)的作用。正常情況下，NF-κB處于非活化狀態(tài)，其在細(xì)胞質(zhì)與NF-κB抑制蛋白結(jié)合，當(dāng)受到病理因素作用后，細(xì)胞內(nèi)NF-κB與NF-κB抑制蛋白解離，并調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)[14]。本研究結(jié)果顯示，SP組和抑制劑組NF-κB p65相對(duì)表達(dá)量均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯；說(shuō)明SN50對(duì)SP作用后脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路有阻斷作用，可降低細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的重要骨架蛋白，也是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)上調(diào)標(biāo)志著星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化程度升高[15]。本研究結(jié)果顯示，SP組和抑制劑組GFAP表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯；說(shuō)明SP能夠促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，而SN50可降低SP作用后引起的脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化。

脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌炎癥及疼痛因子，主要有NO、TNF-α、IL-1β等。IL-1β、TNF-α具有促進(jìn)炎癥發(fā)生的作用[16]。研究表明，TNF-α具有損傷神經(jīng)元的作用，脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞能夠分泌TNF-α，促進(jìn)NF-κB激活，引起細(xì)胞產(chǎn)生NO等氧自由基[17]。NO具有壽命短、活性高等特點(diǎn)，可參與免疫系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等多種病理及生理過(guò)程的發(fā)生。NO能夠影響神經(jīng)細(xì)胞的興奮性，促進(jìn)感覺(jué)傳導(dǎo)[18,19]，其表達(dá)升高能促進(jìn)炎癥和疼痛的發(fā)生[20]。本研究結(jié)果顯示，SP組和抑制劑組培養(yǎng)液上清TNF-α、IL-1β、NO表達(dá)均高于對(duì)照組，且SP組升高更明顯；說(shuō)明SP能夠促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-1β，而SN50具有拮抗SP促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌NO、TNF-α、IL-1β的作用。

綜上所述，SP能夠促進(jìn)脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞活化并分泌NO、TNF-α、IL-1β，NF-κB信號(hào)通路抑制劑SN50能夠降低SP的上述作用。本研究為進(jìn)一步探討NF-κB信號(hào)通路在脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞功能中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病導(dǎo)致的疼痛及炎癥反應(yīng)提供了新的思路。

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中國(guó)博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2013M532112)。

梁偉(E-mail： pdu_3466@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.013

R741

A

1002-266X(2017)44-0045-03

2017-03-15)