HIF-1α基因干擾對低氧環(huán)境下人鼻黏膜上皮細(xì)胞TGF-β1、VEGF、bFGF表達(dá)的影響及其機(jī)制

楊琳紅，張愛華，范宗憲，韓琳，王維峰

(1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154000；2 中國人民解放軍第二二四醫(yī)院)

HIF-1α基因干擾對低氧環(huán)境下人鼻黏膜上皮細(xì)胞TGF-β1、VEGF、bFGF表達(dá)的影響及其機(jī)制

楊琳紅1，張愛華1，范宗憲1，韓琳2，王維峰1

(1 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江佳木斯154000；2 中國人民解放軍第二二四醫(yī)院)

目的觀察低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)基因干擾對低氧環(huán)境下人鼻黏膜上皮細(xì)胞(HNEC)轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法體外培養(yǎng)HNEC，取傳3代對數(shù)生長期細(xì)胞隨機(jī)分為空白對照組、NC-shRNA組、HIF-shRNA組和低氧誘導(dǎo)組?？瞻讓φ战M不予任何處理，NC-shRNA組、HIF-shRNA組分別予NC-shRNA、HIF-shRNA轉(zhuǎn)染，并于轉(zhuǎn)染24 h后經(jīng)CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)模擬低氧環(huán)境；低氧誘導(dǎo)組僅經(jīng)CoCl2化學(xué)誘導(dǎo)模擬低氧環(huán)境。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法和Western blotting法檢測各組HIF-1α、TGF-β1、VEGF、bFGF mRNA和蛋白表達(dá)；采用Western blotting法檢測PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt表達(dá)。結(jié)果與空白對照組比較，低氧誘導(dǎo)組HIF-1α、VEGF、TGF-β1、bFGF mRNA和蛋白表達(dá)均明顯升高(P均<0.05)；與NC-shRNA組比較，HIF-shRNA組上述指標(biāo)mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P均<0.05)。與空白對照組比較，低氧誘導(dǎo)組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高(P均<0.05)；與NC-shRNA組比較，HIF-shRNA組p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低(P均<0.05)；各組PI3K、Akt蛋白表達(dá)比較P均>0.05。結(jié)論低氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)可促進(jìn)人鼻黏膜上皮細(xì)胞TGF-β1、VEGF、bFGF表達(dá)，干擾HIF-1α基因則抑制上述因子的表達(dá)；HIF-1α對上述因子的調(diào)控機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

鼻黏膜上皮細(xì)胞；低氧誘導(dǎo)因子1α；基因干擾；血管內(nèi)皮生長因子；PI3K/Akt信號通路；低氧環(huán)境

組織重塑是多數(shù)慢性炎性疾病的病理特征之一[1,2]，長期炎癥反應(yīng)會持續(xù)損傷組織，而組織會針對持續(xù)性損傷啟動自我修復(fù)機(jī)制。但這種自我修復(fù)機(jī)制屬于不完全修復(fù)，會導(dǎo)致不可逆性組織結(jié)構(gòu)異常，這也是變應(yīng)性鼻炎、鼻息肉等鼻腔疾病發(fā)病的病理基礎(chǔ)之一。感染、炎癥等外界刺激均可引起局部組織耗氧增多，繼而導(dǎo)致組織缺氧。機(jī)體為適應(yīng)這種缺氧狀態(tài)會激活一系列與缺氧有關(guān)的基因，以提高細(xì)胞對缺氧的適應(yīng)性。低氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)是介導(dǎo)機(jī)體缺氧調(diào)控的主要轉(zhuǎn)錄因子之一[3]。HIF-1α具有廣泛的生物學(xué)功能，如缺氧適應(yīng)、炎癥反應(yīng)、血管新生等[4，5]。楊浩等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在變應(yīng)性鼻炎組織中HIF-1α表達(dá)上調(diào)，并可介導(dǎo)呼吸道重塑。尹文華等[7]研究認(rèn)為，炎癥因子可誘導(dǎo)人鼻黏膜上皮細(xì)胞(HNEC)大量表達(dá)HIF-1α，并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生。但目前對HIF-1α調(diào)節(jié)HNEC的具體機(jī)制尚不完全清楚。2015年2月～2017年2月，本研究采用短發(fā)夾RNA(shRNA)技術(shù)干擾HNEC中HIF-1α基因表達(dá)，觀察其對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)表達(dá)的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 HNEC，廣州吉妮歐生物科技有限公司。綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的HIF-shRNA、無義寡核苷酸陰性對照(NC-shRNA)，上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)合成。LipofectamineTM2000脂質(zhì)體，美國Invitrogen公司；TRIzol，廣州碧云天生物技術(shù)研究所；RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Bio-Rad公司。鼠抗人HIF-1α抗體，美國Santa Cruz公司；兔抗人TGF-β1抗體、兔抗人VEGF抗體、兔抗人bFGF抗體、鼠抗人PI3K抗體、兔抗人Akt抗體、鼠抗人p-Akt抗體、GAPDH抗體，武漢博士德生物工程有限公司；鼠抗兔IgG-辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，美國Santa公司。

1.2 細(xì)胞分組處理 將HNEC接種于DEME培養(yǎng)基(含10% FBS、100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素)，37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，當(dāng)細(xì)胞貼壁且融合達(dá)75%時(shí)更換培養(yǎng)基，傳代培養(yǎng)。取傳3代對數(shù)生長期HNEC，制備細(xì)胞懸液并接種于6孔板，每孔1×104個。隨機(jī)將細(xì)胞分為空白對照組、NC-shRNA組、HIF-shRNA組和低氧誘導(dǎo)組?？瞻讓φ战M正常培養(yǎng)，不予任何處理；NC-shRNA組加入NC-shRNA 4 μg和LipofectamineTM2000 10 μL；HIF-shRNA組加入HIF-shRNA 4 μg和LipofectamineTM2000 10 μL；NC-shRNA組、HIF-shRNA組于轉(zhuǎn)染24 h后加入100 μmol/L CoCl2溶液誘導(dǎo)低氧環(huán)境；低氧誘導(dǎo)組僅加入100 μmol/L CoCl2溶液模擬低氧環(huán)境。各組繼續(xù)培養(yǎng)2 h后更換DEME培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)染48 h，取部分細(xì)胞，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、Western blotting法檢測HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)。結(jié)果見表1。低氧誘導(dǎo)組HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)明顯高于空白對照組，HIF-shRNA組HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于NC-shRNA組(P均<0.05)。表明低氧可誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，而干擾HIF-1α基因可抑制HIF-1α表達(dá)，該方法可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 各組HIF-1α mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與NC-shRNA組比較，△P<0.05；與HIF-shRNA組比較，#P<0.05。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察

1.3.1 TGF-β1、VEGF、bFGF mRNA和蛋白表達(dá) ①VEGF、TGF-β1、bFGF mRNA表達(dá)：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法。取各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA在260、280 nm波長處的吸光度(A)值，A260/A280為1.8～2.0，表明提取的總RNA純度合格。按PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：VEGF上游引物：5′-AGGGCAGAATCATGAGCAAGT-3′，下游引物：5′-AGGGTCTGCATTGGATGGCA-3′；TGF-β1上游引物：5′-CTAATGGTGGAAACCCAGAAGC-3′，下游引物：

5′-TATGCGGACGAATTGTTGCTG-3′；bFGF上游引物：5′-AGTGTCTGCTAACCGTTAGCT-3′，下游引物：5′-ACTGCCCAGTTCGTTTCAGTG-3′；GAPDH上游引物：5′-CACCATTGGCAATGAGGGGTTC-3′，下游引物：5′-AGGTCTTTGCGGATGTCCACGT-3′。PCR反應(yīng)體系共20 μL：上下游引物各0.2 μL，SYBR Green Ⅰ premix 12 μL，雙蒸水5.6 μL，cDNA 2 μL；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s共40個循環(huán)，最后72 ℃ 2 min。以GAPDH作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。②VEGF、TGF-β1、bFGF蛋白表達(dá)：采用Western blotting法。取各組繼續(xù)培養(yǎng)48 h細(xì)胞，RIPA裂解，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，提取總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白樣品與上樣緩沖液混勻，100 ℃水浴5 min變性；取變性的蛋白樣品50 μg，80 V電壓下進(jìn)行SDS-PAGE，待樣品進(jìn)入分離膠后改為120 V電壓，至溴酚藍(lán)跑至凝膠邊緣時(shí)終止電泳；常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h；分別加入VEGF、TGF-β1、bFGF一抗，4 ℃孵育24 h；再加入辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG二抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗3次，洗膜、顯影、曝光。按照ECL化學(xué)發(fā)光顯影試劑盒顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，Image Lab軟件分析蛋白電泳條帶的灰度值。以GAPDH作為內(nèi)參照，以目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參蛋白電泳條帶灰度值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

1.3.2 PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。一抗分別為PI3K(1∶300)、p-PI3K(1∶300)、Akt(1:200)、p-Akt(1∶200)、GAPDH(1∶100)，二抗辣根過氧化酶標(biāo)記的鼠抗兔IgG(1∶100)，其余步驟同上。

2 結(jié)果

2.1 各組VEGF、TGF-β1、bFGF mRNA和蛋白表達(dá)比較 見表2。

表2 各組VEGF、TGF-β1、bFGF mRNA和蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與NC-shRNA組比較，△P<0.05；與HIF-shRNA組比較，#P<0.05。

2.2 各組PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較 見表3。

表3 各組PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白相對表達(dá)量比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與NC-shRNA組比較，△P<0.05；與HIF-shRNA組比較，#P<0.05。

3 討論

目前已證實(shí)，HIF-1是細(xì)胞低氧反應(yīng)的核心調(diào)控因子。HIF-1由兩個亞基組成，即HIF-1α、HIF-1β，HIF-1α是其活性亞基。既往研究顯示，長期呼吸道的變應(yīng)性炎癥會引起呼吸道黏膜發(fā)生不可逆的組織結(jié)構(gòu)重塑，導(dǎo)致局部缺氧加重[9,10]。靳春杰等[11]報(bào)道稱易感個體受體變應(yīng)原刺激后，導(dǎo)致Th2細(xì)胞活化，誘發(fā)趨化因子和細(xì)胞因子釋放，肥大細(xì)胞脫顆粒和嗜酸性粒細(xì)胞聚集，氣道炎癥反應(yīng)加重；而鼻腔局部的炎癥反應(yīng)又會進(jìn)一步刺激HIF-1誘表達(dá)上調(diào)。Watcharasit等[12]研究亦證實(shí)，在炎性因子、低氧等因素刺激下，鼻黏膜上皮細(xì)胞能夠產(chǎn)生HIF-1α和VEGF，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生。此外，HIF-1α還會誘導(dǎo)細(xì)胞分泌誘導(dǎo)型一氧化氮合酶，促進(jìn)炎性組織通過血管壁進(jìn)入組織，最終導(dǎo)致組織重塑而加重缺氧[13]。但目前對于HNEC中HIF-1α表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，特別是其在相應(yīng)信號通路中的作用鮮見報(bào)道。

生長因子如TGF-β1、VEGF、bFGF等，均與氣道重塑、炎性反應(yīng)等密切相關(guān)。TGF-β1是重要的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控因子，在組織重塑方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。VEGF可增加血管壁通透性，導(dǎo)致炎性因子滲透入血管外間隙，加重炎癥反應(yīng)。bFGF參與形成細(xì)胞外基質(zhì)和血管生成，在組織損傷修復(fù)、纖維化和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過程中起重要作用。RNA干擾技術(shù)是近年興起的一種基因干擾技術(shù)，具有高效性、高特異性、易操作等特點(diǎn)，已廣泛用于基因功能研究。本研究采用RNA干擾技術(shù)干擾HNEC HIF-1α基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺氧模擬劑CoCl2能夠誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)，HIF-1α表達(dá)上調(diào)的HNEC中TGF-β1、VEGF、bFGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高，而干擾HIF-1α基因的HNEC中TGF-β1、VEGF、bFGF mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低。說明HIF-1α可能通過調(diào)控TGF-β1、VEGF、bFGF參與鼻黏膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng)和組織重塑。

目前，關(guān)于缺氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)的調(diào)控機(jī)制研究較少。有學(xué)者認(rèn)為，缺氧能夠激活PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)HIF-1α發(fā)生磷酸化，并調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，提高細(xì)胞對微環(huán)境的適應(yīng)性改變[14]。Wang等[15]采用LY294002(PI3K阻斷劑)抑制嗜酸性粒細(xì)胞PI3K/Akt通路，細(xì)胞HIF-1α及下游靶基因VEGF表達(dá)明顯減少，提示HIF-1α表達(dá)可能與PI3K/Akt信號通路有關(guān)。Li等[16]報(bào)道顯示，HIF-1α活化能夠誘導(dǎo)Akt和PI3K磷酸化，使HIF-1α降解減少和HIF-1α表達(dá)增加。此外，Akt磷酸化還能激活mTOR基因表達(dá)，從而促進(jìn)VEGF轉(zhuǎn)錄。本研究結(jié)果顯示，低氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)上調(diào)，可以促進(jìn)p-PI3K、p-Akt蛋白表達(dá)增加，從而激活PI3K/Akt信號通路；而干擾HIF-1α表達(dá)則抑制PI3K/Akt信號通路。因此認(rèn)為，HIF-1α介導(dǎo)的VEGF、TGF-β1、bFGF表達(dá)變化可能是通過PI3K/Akt信號通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，低氧誘導(dǎo)HIF-1α表達(dá)可促進(jìn)人鼻黏膜上皮細(xì)胞TGF-β1、VEGF、bFGF表達(dá)，干擾HIF-1α基因則抑制上述因子表達(dá)；HIF-1α的調(diào)控機(jī)制可能與其抑制PI3K/Akt信號通路有關(guān)。

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黑龍江省自然科學(xué)基金青年基金資助項(xiàng)目(QC2010076)。

王維峰(E-mail: dr_wwf@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.012

R765.2

A

1002-266X(2017)44-0042-04

2017-06-24)