厄貝沙坦對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

樊霞，朱紅衛(wèi)，趙彥麗，郝巧，馬梅娟

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

厄貝沙坦對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響及其機(jī)制

樊霞，朱紅衛(wèi)，趙彥麗，郝巧，馬梅娟

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

目的觀察厄貝沙坦對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響，并探討其機(jī)制。方法將體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞分為厄貝沙坦組、血管緊張素Ⅱ組和對照組。厄貝沙坦組加入終濃度為10-7mol/L的血管緊張素Ⅱ和終濃度為10-5mol/L的厄貝沙坦，血管緊張素Ⅱ組加入終濃度為10-7mol/L的血管緊張素Ⅱ，對照組加入磷酸鹽緩沖液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集各組細(xì)胞，采用MTT法檢測各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D520表示)，采用免疫熒光法檢測各組血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)蛋白表達(dá)量，采用實時熒光定量PCR法檢測各組AT1R、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量。結(jié)果厄貝沙坦組、血管緊張素Ⅱ組、對照組OD520分別為5.51±1.13、7.83±1.58、4.30±0.82；血管緊張素Ⅱ組OD520高于對照組，厄貝沙坦組OD520低于血管緊張素Ⅱ組、高于對照組(P均<0.05)。血管緊張素Ⅱ組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)量及mRNA相對表達(dá)量均高于對照組(P均<0.05)；厄貝沙坦組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)量及mRNA表達(dá)量均低于血管緊張素Ⅱ組、高于對照組(P均<0.05)。結(jié)論厄貝沙坦可抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)后宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖能力；降低AT1R、VEGF、MMP-2表達(dá)可能是其作用機(jī)制。

宮頸癌；厄貝沙坦；血管緊張素Ⅱ；血管緊張素Ⅱ 1型受體；血管內(nèi)皮生長因子；基質(zhì)金屬蛋白酶2

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于乳腺癌，近年來發(fā)病率逐年增加，且患者發(fā)病年齡呈現(xiàn)年輕化趨勢[1]。目前治療宮頸癌的新藥多側(cè)重于預(yù)防，雖然傳統(tǒng)的放化療可部分提高宮頸癌患者的生存率，改善患者預(yù)后，但仍然無法降低宮頸癌的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥，亦無法降低宮頸癌患者的病死率[2，3]。腫瘤微血管的生成是腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥的必要條件，通過抑制腫瘤的血管生成可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[4～6]。文獻(xiàn)報道，腫瘤微環(huán)境中血管緊張素Ⅱ表達(dá)異常升高，并通過調(diào)控多種信號通路及下游分子，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[7～10]。厄貝沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑，目前主要用于治療高血壓，也可用于逆轉(zhuǎn)左心室肥厚、治療充血性心力衰竭和糖尿病腎病等[11]。筆者根據(jù)厄貝沙坦的作用機(jī)制推測厄貝沙坦可以抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的宮頸癌細(xì)胞增殖，但尚未見相關(guān)文獻(xiàn)報道。2016年2～12月，本研究觀察了厄貝沙坦對血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的宮頸癌HeLa細(xì)胞株增殖的影響，并探討血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1R)、VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)在其中發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 宮頸癌HeLa細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)。兔抗人AT1R、VEGF、MMP-2和GAPDH抗體(美國CST公司)，異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(武漢博士德生物工程有限公司)，TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)，RNA抽提試劑盒(美國Applied Biosystems公司)，TaqMan逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 (英國Life Technologies公司)，qSYBR-Green-containing PCR試劑盒(美國Qiagen公司)，血管緊張素Ⅱ、厄貝沙坦(美國Sigma公司)。Thermo Multiskan Ascent酶標(biāo)儀(型號413MBY042078，美國薩默飛世爾公司)，倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 細(xì)胞分組處理 將體外培養(yǎng)的人宮頸癌HeLa細(xì)胞分為厄貝沙坦組、血管緊張素Ⅱ組和對照組。厄貝沙坦組細(xì)胞加入終濃度為10-7mol/L的血管緊張素Ⅱ和終濃度為10-5mol/L的厄貝沙坦，血管緊張素Ⅱ組加入終濃度為10-7mol/L的血管緊張素Ⅱ，對照組加入PBS。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.3 細(xì)胞增殖情況觀察 采用MTT法。收集各組細(xì)胞接種于96孔板，每孔加入MTT 10 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 h，每孔加入10%十二烷基磺酸鈉100 μL，過夜。第二天取出細(xì)胞，振蕩10 min，于酶標(biāo)儀上檢測520 nm處的吸光度值(OD520)。實驗重復(fù)3 次，取平均值。

1.4 細(xì)胞AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)檢測 采用免疫熒光法。收集各組細(xì)胞，加入4%多聚甲醛固定20 min，1%牛血清白蛋白封閉0.5 h，分別加入兔抗人AT1R、VEGF和MMP-2的一抗，4 ℃孵育過夜，經(jīng)異硫氰酸熒光素標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗室溫避光孵育1.5 h，熒光顯微鏡下拍片，采用顯微鏡自帶ImagePlus7.0軟件計算各組熒光強度，以此表示AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞AT1R、VEGF、MMP-2 mRNA表達(dá)檢測 采用實時熒光定量PCR法。收集各組細(xì)胞，采用TRIzol提取總RNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。以上述提取的細(xì)胞總RNA為模板，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行操作，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。以cDNA為模板，按qSYBR-Green-containing PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，在BioRad IQTM5 Multicolor實時熒光定量系統(tǒng)上檢測各組Ct值。AT1R、VEGF、MMP-2引物采用Invitrogen公司生產(chǎn)的AT1R、VEGF、MMP-2探針，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-ΔΔCt法計算AT1R、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖情況比較 厄貝沙坦組、血管緊張素Ⅱ組、對照組OD520分別為5.51±1.13、7.83±1.58、4.30±0.82；血管緊張素Ⅱ組OD520高于對照組，厄貝沙坦組OD520低于血管緊張素Ⅱ組、高于對照組(P均<0.05)。

2.2 各組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)量比較 見表1。

表1 各組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與血管緊張素Ⅱ組比較，#P<0.05。

2.3 各組AT1R、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量比較 見表2。

表2 各組AT1R、VEGF、MMP-2 mRNA相對表達(dá)量比較

注：與對照組比較，*P<0.05;與血管緊張素Ⅱ組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著研究的深入和治療手段不斷完善，宮頸癌的診斷及治療已取得極大進(jìn)步，但其病死率并未從本質(zhì)上得到改善[12]。腫瘤微血管的生成是腫瘤發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和治療耐藥的根本原因，通過抑制腫瘤的血管生成可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[13，14]。因此尋找可直接或間接抑制宮頸癌腫瘤微血管生成的藥物是防治其復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的有效策略。

研究顯示，血管緊張素Ⅱ可通過AT1R誘導(dǎo)心血管效應(yīng)，而臨床上AT1R抑制劑主要用于高血壓的治療[15]，常用的AT1R抑制劑有纈沙坦、坎地沙坦和厄貝沙坦等，其中抗高血壓效果最為顯著、不良反應(yīng)最小的是厄貝沙坦[16]。ATR1在多種惡性腫瘤中存在過表達(dá)現(xiàn)象，如子宮內(nèi)膜腺癌[17]、甲狀腺乳頭狀癌[18]和腎癌[19]等。本研究結(jié)果顯示，血管緊張素Ⅱ組細(xì)胞增殖活性明顯強于對照組，說明血管緊張素Ⅱ可以增強宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的能力。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素Ⅱ組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白和mRNA表達(dá)均高于對照組，說明血管緊張素Ⅱ可能通過提高AT1R、VEGF、MMP-2蛋白和mRNA表達(dá)而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖。AT1R、VEGF、MMP-2三種蛋白變化趨勢一致，說明三者協(xié)同參與了宮頸癌細(xì)胞的增殖調(diào)控過程。VEGF是腫瘤細(xì)胞分泌的重要的血管生成刺激因子，同時VEGF表達(dá)與多種惡性腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或預(yù)后不良密切相關(guān)，其中就包括宮頸癌[20]。研究顯示，血管緊張素Ⅱ可通過誘導(dǎo)VEGF的表達(dá)，并通過AT1R介導(dǎo)的多種信號通路來刺激和促進(jìn)毛細(xì)血管的形成[21，22]，該研究結(jié)果也可以用來解釋為什么本研究中各組AT1R和VEGF的表達(dá)改變會保持一致。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是一個涉及多基因和多步驟的復(fù)雜過程，其中腫瘤的基底膜被破壞、腫瘤細(xì)胞外基質(zhì)被降解是腫瘤開始發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志，而該過程依賴于多種蛋白酶系統(tǒng)的參與，基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)就是其中最重要且龐大的一個細(xì)胞酶系，MMP-2也屬于該家族。其中MMPs可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)中的不同成分，啟動或促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程。有文獻(xiàn)報道，AT1R可促進(jìn)胃癌的惡性進(jìn)展，而該過程可能與AT1R促進(jìn)MMP-2和MMP-9表達(dá)上調(diào)，并促進(jìn)血管生成有關(guān)[23]。宮頸癌細(xì)胞中AT1R與MMP-2表達(dá)之間可能也有某種調(diào)控關(guān)系，共同促進(jìn)血管的新生。因此，AT1R、VEGF和MMP-2在腫瘤的血管生成中發(fā)揮重要作用[24,25]。

本研究結(jié)果顯示，厄貝沙坦組細(xì)胞增殖活性明顯低于血管緊張素Ⅱ組，說明厄貝沙坦可以抑制血管緊張素Ⅱ?qū)m頸癌細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，厄貝沙坦組AT1R、VEGF、MMP-2蛋白和mRNA表達(dá)較血管緊張素Ⅱ組下降，這與厄貝沙坦的作用機(jī)制是相符合的。目前尋找抑制腫瘤血管生成的藥物已成為新藥研發(fā)或藥物適應(yīng)證拓展的一個重要策略，且已有許多此類抑制腫瘤血管生成的藥物已被用于臨床。本研究結(jié)果提示厄貝沙坦可能有治療宮頸癌的潛力，但仍需要進(jìn)一步研究證實。

[1] Shi JF, Canfell K, Lew JB, et al. The burden of cervical cancer in china synthesis of the evidence[J]. Br J cancer, 2012,130(3):641-652.

[2] Eskander RN, Tewari KS. Chemotherapy in the treatment of metastatic, persistent, and recurrent cervical cancer[J]. Curr Opin Obstet Gynecol, 2014,26(4):314-321.

[3] 劉煥芝.宮頸癌的治療進(jìn)展[J].中國當(dāng)代醫(yī)藥,2010,17(25):19-20.

[4] 欒寧,王雪峰.VEGF-C與腫瘤轉(zhuǎn)移的研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué),2009,17(09):1805-1807.

[5] Pezzolo A, Parodi F, Corrias MV, et al. Tumor origin of endothelial cells in human neuroblastoma[J]. J Clin Oncol, 2007,25(4):376-383.

[6] Lowy CM, Oskarsson T. Tenascin C in metastasis: a view from the invasive front[J]. Cell Adh Migr, 2015,9(1-2):112-124.

[7] Meng YC, Ding ZY, Wang HQ, et al. Effect of microRNA-155 on angiogenesis after cerebral infarction of rats through AT1R/VEGFR2 pathway[J]. Asian Pac J Trop Med, 2015,8(10):829-835.

[8] Walter A, Etienne-Selloum N, Sarr M, et al. Angiotensin Ⅱ induces the vascular expression of VEGF and MMP-2 in vivo: preventive effect of red wine polyphenols[J]. J Vasc Res, 2008,45(5):386-394.

[9] Choke E, Cockerill GW, Dawson J, et al. Vascular endothelial growth factor enhances angiotensin Ⅱ-induced aneurysm formation in apolipoprotein E-deficient mice[J]. J Vasc Surg, 2010,52(1):159-166.

[10] Mansour MA, Al-Ismaeel H, Al-Rikabi AC, et al. Comparison of angiotensin converting enzyme inhibitors and angiotensin Ⅱ type 1 receptor blockade for the prevention of premalignant changes in the liver[J]. Life Sci, 2011,89(5-6):188-194.

[11] 常世忠,方薇,梅友健.厄貝沙坦臨床應(yīng)用研究[J].安徽醫(yī)藥,2003,7(6):463-464.

[12] Shostka KG, Pavlenko AN, Fokina AV, et al. Immediate and long-term results of treatment after pelvic exenteration for locally advanced cervical cancer[J]. Vopr Onkol, 2014,60(3):319-322.

[13] Liu WT, Jing YY, Yu GF, et al. Toll like receptor 4 facilitates invasion and migration as a cancer stem cell marker in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2015,358(2):136-143.

[14] Feng LH, Dong H, Lau WY, et al. Novel microvascular invasion-based prognostic nomograms to predict survival outcomes in patients after R0 resection for hepatocellular carcinoma[J]. J Cancer Res Clin Oncol, 2017,143(2):293-303.

[15] Miyajima A, Kosaka T, Asano T, et al. Angiotensin Ⅱ type Ⅰ antagonist prevents pulmonary metastasis of murine renal cancer by inhibiting tumor angiogenesis[J]. Cancer Res, 2002,62(15):4176-4179.

[16] Ismail B, deKemp RA, Hadizad T, et al. Decreased renal AT1 receptor binding in rats after subtotal nephrectomy: PET study with[(18)F]FPyKYNE-losartan[J]. EJNMMI Res, 2016,6(1):55.

[17] 趙萬成,楊清,王玉.AngⅡ及AT1R在子宮內(nèi)膜腺癌的表達(dá)及臨床意義[J].現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展,2011,20(2):109-112.

[18] 張志宇,張會娟,王俊宏.甲狀腺乳頭狀癌組織中ANG-Ⅱ,AT1R,VEGF表達(dá)及意義[J].山東醫(yī)藥,2009,49(7):89-90.

[19] 郭剛,施國海,張帆,等.血管緊張素系統(tǒng)抑制劑與舒尼替尼治療晚期腎癌患者療效的相關(guān)性研究[J].臨床泌尿外科雜志,2015,30(4):294-298.

[20] Rader JS, Sill MW, Beumer JH, et al. A stratified randomized double-blind phase Ⅱ trial of celecoxib for treating patients with cervical intraepithelial neoplasia: the potential predictive value of VEGF serum levels: an NRG Oncology/Gynecologic Oncology Group study[J]. Gynecol Oncol, 2017,145(2):291-297.

[21] Wang X, Bai YP, Hong D, et al. Ang Ⅱ induces capillary formation from endothelial cells via the AT1R-dependent inositol requiring enzyme 1 pathway[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013,434(3):552-558.

[22] Zhou L, Luo Y, Sato S, et al. Role of two types of angiotensin Ⅱ receptors in colorectal carcinoma progression[J]. Pathobiology, 2014,81(4):169-175.

[23] Huang W, Yu LF, Zhong J, et al. Angiotensin Ⅱ type 1 receptor expression in human gastric cancer and induces MMP2 and MMP9 expression in MKN-28 cells[J]. Dig Dis Sci, 2008,53(1):163-168.

[24] Gorman JL, Liu ST, Slopack D, et al. Angiotensin Ⅱ evokes angiogenic signals within skeletal muscle through co-ordinated effects on skeletal myocytes and endothelial cells[J]. PLoS One, 2014,9(1):85537.

[25] Tanaka N, Miyajima A, Kosaka T, et al. Cis-dichlorodiammineplatinum upregulates angiotensin Ⅱ type 1 receptors through reactive oxygen species generation and enhances VEGF production in bladder cancer[J]. Mol Cancer Ther, 2010,9(11):2982-2992.

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2017-09-15)