FAM92A1-289對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、遷移能力的影響及其與Galectin-1的關(guān)系

吳慕禹，郭興榮，李東升

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北十堰442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院第二臨床學(xué)院)

FAM92A1-289對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、遷移能力的影響及其與Galectin-1的關(guān)系

吳慕禹1，2，郭興榮1，李東升1

(1湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院，湖北十堰442000；2湖北醫(yī)藥學(xué)院第二臨床學(xué)院)

目的探討FAM92A1-289對人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、遷移能力的影響及其與半乳糖凝集素1(Galectin-1)的關(guān)系。方法將CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至U251細胞中，通過嘌呤霉素篩選得到穩(wěn)定過表達FAM92A1-289基因的腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株。取腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞作為觀察組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的野生型U251細胞作為對照組，采用實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)檢測兩組培養(yǎng)24、48、72、96、120 h的細胞增殖能力(以光密度值表示)，采用Transwell小室試驗檢測兩組細胞遷移能力(以穿膜細胞數(shù)表示)。構(gòu)建PCS2-3Flag-Galectin-1質(zhì)粒，將人腦膠質(zhì)瘤U251細胞隨機分為FAM92A1-289組、Galectin-1組、共轉(zhuǎn)染組及空白對照組，F(xiàn)AM92A1-289組、Galectin-1組均采用Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒、PCS2-3Flag-Galectin-1質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染組同時轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒，空白對照組僅加入Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染試劑。采用免疫共沉淀實驗驗證FAM92A1-289與Galectin-1是否存在相互作用。結(jié)果兩組培養(yǎng)24 h光密度值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察組培養(yǎng)48、72、96、120 h光密度值均高于對照組(P<0.05或<0.01)。觀察組與對照組穿膜細胞數(shù)分別為(242.0±11.41)、(65.40±7.92)個，兩組比較P<0.01。共轉(zhuǎn)染組抗GFP蛋白相對表達量明顯高于FAM92A1-289組、Galectin-1組及空白對照組(P均<0.01)。結(jié)論過表達FAM92A1-289可提高人腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和遷移能力；FAM92A1-289與Galectin-1之間的相互作用可能為FAM92A1-289調(diào)控人腦膠質(zhì)瘤U251細胞惡性行為的作用機制。

腦膠質(zhì)瘤；U251細胞；FAM92A1-289；半乳糖凝集素1；細胞增殖；細胞遷移

腦膠質(zhì)瘤占顱腦腫瘤總數(shù)的一半以上，WHO根據(jù)組織病理學(xué)標準按照惡性程度將其分為Ⅰ～Ⅳ級[1]。Ⅳ級腦膠質(zhì)瘤又稱膠質(zhì)母細胞瘤，惡性程度最高、患者預(yù)后最差，患者經(jīng)手術(shù)切除以及放化療等綜合治療后的中位生存期僅14個月[2]。分子靶向治療是將患者腦膠質(zhì)瘤組織或瘤細胞中存在的某些特殊分子與相應(yīng)抗體結(jié)合，進一步發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生具有特異性的靶點，并通過該類特異性靶點有效殺死腦膠質(zhì)瘤細胞[3]。FAM92A1-289是從腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)并克隆的一個FAM92A1新轉(zhuǎn)錄變異體基因[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM92A1-289在增殖旺盛的腫瘤細胞、干細胞及癌組織中表達均較高，尤其在胚胎期腦組織中表達極高，而在正常腦組織中表達很低[5]，推測FAM92A1-289基因可能與腫瘤細胞增殖等惡性行為相關(guān)。半乳糖凝集素1(Galectin-1)是半乳糖凝集素(Galectins)家族蛋白中最先被發(fā)現(xiàn)的一員，其表達量與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正比[6]。Galectin-1可以通過與解聚素金屬蛋白酶15[7]、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9[8]及β1整合素[9]相互作用而提高腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移能力，通過促進血管內(nèi)皮生長因子分泌而提高腦膠質(zhì)瘤細胞的增殖能力[10]。故研究FAM92A1-289與Galectin-1之間的相互作用有助于加深理解FAM92A1-289對腦膠質(zhì)瘤細胞增殖、遷移能力影響的可能作用機制。2016年4月～2017年4月，本研究觀察了FAM92A1-289對膠質(zhì)瘤細胞增殖及遷移能力的影響，現(xiàn)分析結(jié)果并探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：人腦膠質(zhì)瘤U251細胞及人胚胎腎293T細胞均購自美國菌種典藏中心。主要試劑：DMEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液均購自美國Gibco公司，總RNA提取TRIzol試劑購自美國LifeTechnologies公司，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，F(xiàn)lag Beads購自美國Sigma公司，單克隆鼠抗人Flag、GAPDH抗體及單克隆兔抗人GFP抗體均購自北京蘭博利德商貿(mào)有限公司，青霉素、鏈霉素、胎牛血清、胰酶消化液、SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒、抗鼠及抗兔二抗均購自武漢碧云天生物技術(shù)有限公司。主要儀器：Transwell小室購自美國Corning公司，電轉(zhuǎn)儀購自日本NEPA GENE公司，電轉(zhuǎn)杯及凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 穩(wěn)定過表達FAM92A1-289基因的腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株構(gòu)建及鑒定

1.2.1 腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株構(gòu)建 將人腦膠質(zhì)瘤U251細胞以1.0×105個/孔的密度接種于含2 mL DMEM完全培養(yǎng)基的6孔板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，取處于對數(shù)生長期的生長狀態(tài)良好的細胞用于以下實驗。參照本課題組前期研究[11]的方法構(gòu)建帶綠色熒光蛋白(GFP)的CMV-SP6-TALEN-289質(zhì)粒，命名為CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒。將CMV-SP6-TALEN-289質(zhì)粒用電穿孔的方法轉(zhuǎn)染入人腦膠質(zhì)瘤U251細胞內(nèi)，并采用嘌呤霉素篩選出陽性細胞。方法如下：取1×106個人腦膠質(zhì)瘤U251細胞與8 μg CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒在Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中混勻，130 V電壓轉(zhuǎn)染后將混合液取出，加入完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育，對照孔加入未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的野生型人腦膠質(zhì)瘤U251細胞。加入4 μg/μL嘌呤霉素作用10～14天，直至對照孔的野生型細胞完全死亡。取出轉(zhuǎn)染CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞，置于200倍顯微鏡下觀察其生長情況。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒的人腦膠質(zhì)瘤U251細胞生長狀態(tài)良好，證實成功構(gòu)建腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株。

1.2.2 腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株鑒定 ①GFP表達：取1.2.1中嘌呤霉素篩選得到的陽性細胞株，置于100倍熒光顯微鏡下觀察GFP表達情況，結(jié)果顯示均呈現(xiàn)綠色熒光，表明均正確表達GFP。②FAM92A1-289 mRNA表達：采用RT-PCR法。取1.2.1中嘌呤霉素篩選得到的陽性細胞株作為觀察組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的野生型人腦膠質(zhì)瘤U251細胞作為對照組。加入細胞裂解液，采用TRIzol試劑提取細胞總RNA，按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。以cDNA作為模板進行PCR擴增。PCR引物：FAM92A1-289上游引物：5′-GACATTAACTGGCATTGTG-3′，下游引物：5′-GCTGTGACTGTGTAGA-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-ATGGCAACGGTCGACA-3′，下游引物：5′-GACGGCGACAACGCA-3′。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，共30個循環(huán)；72 ℃、10 min。采用Image Lab軟件測量積分光密度(IOD)，目的基因相對表達量以FAM92A1-289基因IOD與內(nèi)參β-actin IOD的比值表示。結(jié)果顯示，觀察組與對照組FAM92A1-289 mRNA相對表達量分別為0.596±0.026、0.059±0.006，兩組比較P<0.01。③FAM92A1-289蛋白表達：采用Western blotting法。參照②的方法進行分組，提取各組細胞總蛋白，以20 μL/孔上樣量進行10% SDS-PAGE蛋白分離，將電泳分離的蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；TBST洗滌3次，每次5 min；分別加入GFP抗體(1∶1 000稀釋)、GAPDH抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，每次5 min；加入堿性磷酸過氧化物酶標記的人抗兔及抗鼠二抗(1∶1 000稀釋)室溫孵育2 h；TBST洗滌3次，每次5 min；將PVDF膜顯影并在凝膠成像系統(tǒng)上成像，以GAPDH為內(nèi)參，參照②的方法計算目的蛋白相對表達量。結(jié)果顯示，觀察組與對照組GFP-FAM92A1-289蛋白相對表達量分別為0.602±0.036、0，兩組比較P<0.01。證實構(gòu)建的腦膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株可穩(wěn)定過表達FAM92A1-289基因。

1.3 細胞增殖能力檢測 采用實時無標記動態(tài)細胞分析技術(shù)。取兩組細胞，均以3×103個/孔的密度接種于含DMEM完全培養(yǎng)基的12孔板中。將兩組細胞同時置于實時無標記動態(tài)細胞分析儀器中，設(shè)置每孔所含細胞量、細胞量監(jiān)測頻率及總監(jiān)測時長等參數(shù)，待儀器校準后開始實時監(jiān)測。記錄兩組細胞培養(yǎng)24、48、72、96、120 h的光密度(OD)值，以此表示細胞增殖能力。每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.4 細胞遷移能力檢測 采用Transwell小室試驗。取兩組細胞，均計數(shù)5×104個細胞加入Transwell小室上室中，用無血清培養(yǎng)基正常培養(yǎng)，小室下加入含10%FBS的完全培養(yǎng)基。作用24 h，將小室取出用PBS沖洗，95%乙醇固定30 min，0.2%結(jié)晶紫染液染色1 h。顯微鏡下觀察并拍照，隨機選取5個視野計數(shù)穿膜細胞數(shù)，以此表示細胞遷移能力。每組設(shè)3個復(fù)孔，取平均值。

1.5 FAM92A1-289與Galectin-1的相互作用驗證

1.5.1 PCS2-3Flag-Galectin-1真核表達質(zhì)粒構(gòu)建 在美國國立生物技術(shù)信息中心中查詢Galectin-1基因的CDS區(qū)，設(shè)計上下游兩條引物并擴增其全長序列。利用AscⅠ、FseⅠ酶對PCS2-3Flag載體和Galectin-1全長cDNA片段進行雙酶切，將得到的純化DNA片段進行連接、轉(zhuǎn)化，搖菌擴大培養(yǎng)后，提取PCS2-3Flag-Galectin-1真核表達質(zhì)粒進行質(zhì)粒堿基序列測序，檢測其是否存在堿基的缺失、突變等情況。雙酶切及質(zhì)粒堿基序列測序結(jié)果顯示，質(zhì)粒雙酶切后分為載體和目的基因兩條線性條帶，各條帶大小與預(yù)期相符；質(zhì)粒沒有任何堿基的缺失和突變，堿基序列完全正確。

1.5.2 PCS2-3Flag-Galectin-1真核表達質(zhì)粒鑒定 取對數(shù)生長期的人胚胎腎293T細胞，分別轉(zhuǎn)染或未轉(zhuǎn)染PCS2-3Flag-Galectin-1質(zhì)粒，作用24 h后提取細胞總蛋白，F(xiàn)lag抗體按1∶1 000稀釋，Western blotting過程及目的蛋白相對表達量計算均參照1.2.2中③的方法。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染和未轉(zhuǎn)染PCS2-3Flag-Galectin-1質(zhì)粒的293T細胞3Flag-Galectin-1蛋白相對表達量分別為1.678±0.065、0，兩組比較P<0.01。

1.5.3 免疫共沉淀驗證 將人腦膠質(zhì)瘤U251細胞接種到6孔板中，待細胞長至70%～80%時，隨機分為FAM92A1-289組、Galectin-1組、共轉(zhuǎn)染組及空白對照組。FAM92A1-289組、Galectin-1組均采用Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染法分別轉(zhuǎn)染CMV-SP6-TALEN-GFP-289質(zhì)粒、PCS2-3Flag-Galectin-1質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)染組共轉(zhuǎn)染上述兩種質(zhì)粒，空白對照組僅加入Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染試劑。作用24 h收集各組細胞，置于250 μL含1% TritonX-100的蛋白裂解液冰上裂解，離心后取30 μL上清加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃作用10 min作為Input。將7 μL含F(xiàn)lag抗體的Beads顆粒分別加入剩余上清中，4 ℃搖床上過夜孵育，次日去除上清，在沉淀的Beads顆粒中加入蛋白上樣緩沖液，100 ℃作用15 min作為IP。將Input和IP分別進行10% SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗4 ℃搖床孵育過夜，加入二抗室溫搖床孵育2 h后AP顯影成像，記錄各組蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 兩組細胞增殖能力比較 兩組培養(yǎng)24 h時OD值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；觀察組培養(yǎng)48、72、96、120 h時OD值均高于對照組(P<0.05或<0.01)。見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較

注：與對照組比較，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 兩組細胞遷移能力比較 觀察組與對照組穿膜細胞數(shù)分別為(242.0±11.41)、(65.40±7.92)個，兩組比較P<0.01。

2.3 FAM92A1-289與Galectin-1的相互作用 Input中1、2號條帶結(jié)果顯示GFP-FAM92A1-289與3Flag-Galectin-1均得到正確表達，表示兩種質(zhì)粒的單轉(zhuǎn)染與共轉(zhuǎn)染均成功。IP中3號條帶為Flag Beads骨架，為IP的內(nèi)參；5號條帶結(jié)果顯示3Flag-Galectin-1成功結(jié)合到Flag Beads顆粒上；4號條帶結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染組抗GFP蛋白相對表達量為0.317±0.010，F(xiàn)AM92A1-289組、Galectin-1組及空白對照組均為0。見圖1。

注：A為空白對照組；B為FAM92A1-289組；C為Galectin-1組；D為共轉(zhuǎn)染組。

圖1FAM92A1-289與Galectin-1蛋白相互作用的免疫共沉淀驗證結(jié)果

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，具有高發(fā)病率、高致死率[1]。腦膠質(zhì)瘤具有細胞結(jié)構(gòu)混雜、增殖能力及侵襲力強、高耐藥性等特性，給該疾病的臨床治療帶來了巨大的挑戰(zhàn)[2]。FAM92A1是一個高度保守的基因，目前發(fā)現(xiàn)其有10個轉(zhuǎn)錄變異體，編碼一組小分子的核蛋白[4]。FAM92A1-289是Ruan等[4]2007年從腫瘤細胞中發(fā)現(xiàn)并克隆的一個FAM92A1新轉(zhuǎn)錄變異體基因，同時也是其最大的一個變異體，編碼289個氨基酸核蛋白。EST分析顯示，F(xiàn)AM92A1-289在人體發(fā)育各個階段、多種正常組織及癌組織中均有表達[5]。而且FAM92A1-289在增殖旺盛的腫瘤細胞、干細胞及癌組織中表達較高，尤其在胚胎期腦組織中表達極高，而在正常腦組織表達很低[6]。因此，我們推斷FAM92A1-289可能調(diào)控腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。目前FAM92A1-289的功能仍不明確，已知的功能主要包括：①抑制腫瘤細胞增殖：采用RNAi技術(shù)下調(diào)FAM92A1-289表達可改變HeLa細胞周期分布，可使細胞阻滯于S期，表明FAM92A1-289可能通過調(diào)控細胞周期抑制腫瘤細胞增殖[13,14]；②促進腫瘤細胞增殖：腎癌OS-RC-2細胞過表達FAM92A1-289，其單克隆形成能力及裸鼠成瘤能力均顯著提高[15]；白血病患者預(yù)后與該基因表達呈負相關(guān)，表明FAM92A1-289基因具有促進腫瘤增殖作用[16]。以上研究結(jié)果說明，F(xiàn)AM92A1-289基因可能在細胞增殖調(diào)控中發(fā)揮重要作用，但該基因是促進還是抑制細胞增殖目前還存在爭議。

目前關(guān)于FAM92A1-289基因在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用鮮見報道。本研究通過體外轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、嘌呤霉素篩選及mRNA、蛋白兩個水平的分子鑒定，最終成功構(gòu)建了穩(wěn)定過表達FAM92A1-289的膠質(zhì)瘤U251/289++細胞株，并觀察其對膠質(zhì)瘤細胞增殖和侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，觀察組培養(yǎng)48、72、96、120 h OD值均高于對照組，觀察組穿膜細胞數(shù)高于對照組；表明穩(wěn)定過表達FAM92A1-289能明顯促進膠質(zhì)瘤U251細胞的增殖及遷移能力，提示FAM92A1-289是一個促進腦膠質(zhì)瘤細胞增殖與遷移的基因。

前期研究中酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM92A1-289可能與Galectin-1存在相互作用[12]。Galectin-1屬于Galectin家族蛋白，廣泛存在于人體組織及細胞內(nèi)，可與半乳糖苷特異性結(jié)合，在細胞黏附、增殖、凋亡等多種病理生理過程中發(fā)揮重要作用[17]。大量研究發(fā)現(xiàn)，Galectin-1在許多腫瘤組織中表達明顯上調(diào)，并且其表達量的改變與腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲性能力有關(guān)[18～22]。為了進一步探討FAM92A1-289調(diào)控U251細胞增殖和遷移能力的作用機制，我們利用免疫共沉淀驗證Galectin-1與FAM92A1-289是否存在相互作用。結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染組抗GFP蛋白相對表達量明顯高于FAM92A1-289組、Galectin-1組及對照組，證實Galectin-1存在時FAM92A1-289才能被共沉淀，表明FAM92A1-289與Galectin-1在真核細胞內(nèi)存在相互作用。

綜上所述，過表達FAM92A1-289可提高腦膠質(zhì)瘤U251細胞增殖和遷移能力，F(xiàn)AM92A1-289與Galectin-1之間的相互作用可能是FAM92A1-289調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細胞惡性行為的作用機制。

[1] Lefranc F, Brotchi J, Kiss R. Possible future issues in the treatment of glioblastomas: special emphasis on cell migration and the resistance of migrating glioblastoma cells to apoptosis[J]. J Clin Oncol, 2005,23(10):2411-2422.

[2] Chen YP, Zhang Y, Lv JW, et al. Genomic analysis of tumor microenvironment immune types across 14 solid cancer types: immunotherapeutic implications[J]. Theranostics, 2017,7(14):3585-3594.

[3] 杜春霞,楊林,周愛萍,等.重組人血管內(nèi)皮抑素聯(lián)合一線化療治療晚期結(jié)直腸癌的臨床觀察[J].中國腫瘤臨床與康復(fù),2015,23(9):1029-1033.

[4] Ruan XZ, Yan F, Zhao XY, et al. Identification and characterization of two novel variants of the DUF1208 protein FAM92A1[J]. Mol Cells, 2007,23(3):391-397.

[5] Ruan XZ, Yang HS, Yao SH, et al. Isolation and characterization of a novelXenopus gene (xVAP019) encoding a DUF1208 domain containing protein[J]. Mol Reprod Dev, 2007,74(12):1505-1513.

[6]Gunnersen JM, Spirkoska V, Smith PE, et al. Growth and migration markers of rat C6 glioma cells identified by serial analysis of gene expression[J]. Glia, 2000,32(2):146-154.

[7] Camby I, Decaestecker C, Lefranc F, et al. Galectin-1 knocking down in human U87 glioblastoma cells alters their gene expression pattern[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005,335(1):27-35.

[8] Chiang WF, Liu SY, Fang LY, et al. Overexpression of galectin-1 at the tumor invasion front is associated with poor prognosis in early-stage oral squamous cell carcinoma[J]. Oral Oncol, 2008,44(4):325-334.

[9] Fortin S, Le Mercier M, Camby I, et al. Galectin-1 is implicated in the protein Kinase C epsilon/Vimentin-controlled trafficking of integrin-beta1 in Glioblastoma cells[J]. Brain Pathol， 2008，35(3):2-3.

[10] Fischer I, Gagner JP, Law M, et al.Angiogenesis in gliomas: biology and molecular pathophysiology[J]. Brain Pathol， 2005，15:297-310.

[11] Gui H, Guo XR, Fang J, et al. The tumor-promoting effects of FAM92A1-289 in cervical carcinoma cells[J]. Anticancer Res, 2016,36(10):5197-5204.

[12] 沈君豪,方娟,郭興榮,等.酵母雙雜交技術(shù)篩選宮頸癌HeLa細胞cDNA文庫中FAM92A1-289關(guān)聯(lián)蛋白[J].山東醫(yī)藥,2016,56(19):1-4.

[13] 陳潔,李瑞明,方娟,等.siRNA-FAM92A1-289對HeLa細胞增殖的影響[J].湖北醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報,2011,30(2):105-108.

[14] Liau LM, Black KL, Prins RM, et al. Treatment of intracranial gliomas with bone marrow-derived dendritic cells pulsed with tumor antigens[J]. J Neurosurg, 1999,90(6):1115-1124.

[15] Zappasodi R, Pupa SM, Ghedini GC, et al. Improved clinical outcome in indolent B-Cell lymphoma patients vaccinated with autologous tumor cells experiencing immunogenic death[J]. Cancer Res, 2010,70(22):9062-9072.

[16] Qin EY, Cooper DD, Abbott KL, et al. Neural precursor-derived pleiotrophin mediates subventricular zone invasion by glioma[J]. Cell, 2017,170(5):845-859.

[17] Camby I, Belot N, Rorive S, et al. Galectins are differentially expressed in supratentorial pilocytic astrocytomas, astrocytomas, anaplastic astrocytomas and glioblastomas, and significantly modulate tumor astrocyte migration[J]. Brain Pathol, 2001,11(1):12-26.

[18] Camby I, Belot N, Lefranc F, et al. Galectin-1 modulates human glioblastoma cell migration into the brain through modifications to the actin cytoskeleton and levels of expression of small GTPases[J]. J Neuropathol Exp Neurol, 2002,61(7):585-596.

[19] Camby I, Le Mercier M, Lefranc F, et al. Galectin-1: a small protein with major functions[J]. Glycobiology, 2006,16(11):137-157.

[20] Cárcamo C, Pardo E, Oyanadel C, et al. Galectin-8 binds specific β1integrins and induces polarized spreading highlighted by asymmetric lamellipodia in Jurkat T cells[J]. Exp Cell Res, 2006,312(4):374-386.

[21] D′Abaco GM, Kaye AH. Integrins: molecular determinants of glioma invasion[J]. J Clini Neurosci, 2007,4(11):1041-1048.

[22] Schulz H, Schmoeckel E, Kuhn C, et al. Galectins-1, -3, and -7 are prognostic markers for survival of ovarian cancer patients[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(6):1230.

EffectsofFAM92A1-289onproliferationandmigrationofgliomacellsU251anditsrelationshipwithgalectin-1

WUMuyu1,GUOXingrong,LIDongsheng

(1TaiheHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442000,China)

ObjectiveTo explore the function of FAM92A1-289 in regulating the proliferation and migration of glioma cells U251 and its relationship with galectin-1.MethodsWe transfected the plasmid CMV-SP6-TALEN-GFP-289 into U251 cells, and used puromycin to get the stable cell line U251/289++with over-expression of FAM92A1-289 gene. We took U251/289++cells as the observation group, and U251 cells without transfection as the control group. The real-time cell analysis (RTCA) technology was used to detect the cell proliferation ability of the two groups (expressed by the optical density value) at 24, 48, 72, 96, and 120 h; Transwell test was used to detect the cell migration ability of the two groups (expressed by the number of cells crossing the trans-well chamber). We constructed the PCS2-3Flag-Galectin-1 plasmid, and the U251 cells were randomly divided into FAM92A1-289 group, the Galectin-1 group, co-transfection group, and control group. In the FAM92A1-289 group and Galectin-1 group, we used the Lipofactamine 3000 transfection method to transfect CMV-SP6-TALEN-GFP-289 and PCS2-3Flag-Galectin-1 plasmids, respectively. The cells in the co-transfection group were transfected with the two plasmids, and in the control group we only added Lipofactamine 3000 transfection reagent. The interaction between FAM92A1-289 and Galectin-1 protein was verified by Co-Immunoprecipitation.ResultsThere was no statistically significant difference between the two groups cells at 24 h (P>0.05). The optical density value at 48, 72, 96 and 120 h was significantly higher than that in the control group (P<0.05 orP< 0.01). The number of cells crossing the chamber in the observation group and the control group were 242.0±11.41 and 65.40±7.92, respectively (P<0.01). The relative expression of GFP in co-transfection group was significantly higher than that in the FAM92A1-289 group, Galectin-1 group, and control group (P<0.01).ConclusionThe over-expression of FAM92A1-289 can improve the proliferation and migration of U251 cells, and the interaction between FAM92A1-289 and galectin-1 is used to provide evidence for the role of FAM92A1-289 in regulating the malignant behavior of glioma cells.

glioma; U251 cells; FAM92A1-289; galectin-1; cell proliferation; cell migration

國家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項目(81641028)；湖北省自然科學(xué)基金面上項目(2016CFB408)。

吳慕禹(1992-)，男，碩士在讀，研究方向為腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)和臨床。E-mail： 315971175@qq.com

李東升(1960-)，男，教授，研究方向為腦膠質(zhì)瘤的基礎(chǔ)和臨床。E-mail： dsli1698@126.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.44.003

R739.41

A

1002-266X(2017)44-0009-05

2017-05-15)