北京妙峰山玫瑰花渣中黃酮類成分的UPLC/Q-TOF-MS分析△

王方方，康瑩，張權，齊夢蝶，劉永剛，高同雨，武雅娟，劉勇*

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102；2.北京市門頭溝區(qū)國家生態(tài)修復科技綜合示范基地，北京 102300)

北京妙峰山玫瑰花渣中黃酮類成分的UPLC/Q-TOF-MS分析△

王方方1，康瑩1，張權1，齊夢蝶1，劉永剛1，高同雨2，武雅娟2，劉勇1*

(1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100102；2.北京市門頭溝區(qū)國家生態(tài)修復科技綜合示范基地，北京 102300)

目的采用UPLC/Q-TOF-MS技術對玫瑰花渣中的黃酮類成分進行定性分析。方法采用Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫：40 ℃，洗脫系統(tǒng)為乙腈-0.1%甲酸水梯度洗脫；采用ESI離子源并在負離子模式下進行采集數(shù)據(jù)。結果通過UPLC的快速分離，根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)并結合文獻分析推測，鑒定了11種黃酮類化合物。結論采用UPLC/Q-TOF-MS技術，可有效地分析玫瑰花渣中黃酮類成分，為玫瑰花渣的回收利用提供了數(shù)據(jù)支持。

UPLC/Q-TOF-MS；玫瑰花渣；黃酮類化合物；北京妙峰山

玫瑰花為薔薇科植物玫瑰RosarugosaThunb.的干燥花蕾，具有行氣解郁、和血、止痛的功效，用于肝胃氣痛、食少嘔惡、月經(jīng)不調(diào)、跌補傷痛[1]。玫瑰花具有豐富的營養(yǎng)價值，包括人體所需的氨基酸和膳食纖維等，并且具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒等作用[2-3]。玫瑰花精油具有“液體黃金”之美譽，但是人們只注重玫瑰精油的研究卻很少重視玫瑰花渣的研究，造成玫瑰花資源的浪費[4]。有研究表明玫瑰花渣中總黃酮的含量達3.34%[5]。黃酮類化合物具有多種生物活性，對缺血性腦損傷有保護作用，具有抗腫瘤活性，并且具有較強的抗氧化自由基作用[6]。本實驗利用UPLC/Q-TOF-MS技術，對玫瑰花渣中黃酮類化學成分快速鑒定分析，有利于了解玫瑰花渣中化學成分，對玫瑰花渣的回收利用提供有效的依據(jù)。

1 儀器和試劑

1.1 儀器

Accele 600 pump高效液相色譜儀和LTQ QrbiTrap XL線性離子阱-串聯(lián)靜電軌道場質(zhì)譜(美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品)；BSA1245 型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Pacific T-Ⅱ型超純水儀(美國Thermo公司)；0.22 μm微孔濾膜。

1.2 試劑

對照品槲皮素(批號：117-39-5)、蘆丁(批號：153-18-4)、楊梅素(批號：529-44-2)，均購于上海源葉生物科技有限公司，純度均大于等于98%；甲醇、乙腈均為色譜級試劑，水為娃哈哈純凈水；玫瑰花采自北京妙峰山，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學劉勇教授鑒定為玫瑰RosarugosaThunb.的花。

2 方法

2.1色譜條件

色譜柱：Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，柱溫：25 ℃；體積流量：0.3 mL·min-1；流動相：色譜乙腈(A)、0.1%的甲酸水溶液(B)按程序梯度洗脫(0～4 min，5%～13%A；4～16 min，13%～29%A；16～21 min，29%～46%A；21～25 min，46%～59%A；25～27 min，59%～95%A；27～29 min，95%～95%A；29～30 min，95%～5%A)。

2.2 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜的離子源為電噴霧離子源，負離子模式掃描，質(zhì)譜掃描范圍：m/z100～800；離子源溫度：110 ℃；毛細管電壓：3000 V，錐孔電壓：30 V，鞘流氣溫度：400 ℃，鞘流氣氮氣的體積流量：9 L·min-1，碰撞能量：25～50 ℃。

2.3 供試品溶液制備

將曬干的玫瑰花粉碎，精確稱量玫瑰花2 g，加入甲醇50 mL，加熱回流2 h，放冷，過濾，收集濾液，重復3次，合并濾液，旋干，色譜甲醇溶解，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.4 對照品溶液的制備

精密稱取蘆丁、槲皮素、楊梅素適量，加入甲醇并稀釋成10 μg·mL-1的溶液，過0.22 μm微孔濾膜，備用。

3 結果與分析

3.1 玫瑰花渣中黃酮類化合物的鑒別

本實驗主要對玫瑰花渣中黃酮類化合物進行分析，由于在負離子模式下黃酮類化合物易形成相對穩(wěn)定的離子化合物，因此在此條件下對玫瑰花渣中黃酮類化合物進行分析[7]。通過高分辨質(zhì)譜及二級質(zhì)譜的碎片離子推測化合物的結構式，再根據(jù)對照品信息、相關文獻[8-17]及色譜峰來分析、鑒定玫瑰花渣中11種黃酮類化合物，結果見表1、圖1。

3.2 玫瑰花渣中黃酮類化合物結構解析

化合物1：槲皮素-7-O-鼠李糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、273、124、301[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，并結合文獻推測此化合物為槲皮素-7-O-鼠李糖苷。

表1 UPLC玫瑰花渣中化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)

圖1 玫瑰花渣提取液總離子流圖

化合物2：槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z477.10[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H18O13，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、124、301[M-H-176]-是母離子失去一分子葡萄糖醛酸，結合文獻推測此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷。

化合物3：槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z609.14[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O16，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、447、301、463[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，m/z301[M-H-146-162]-是母離子失去一分子鼠李糖后又失去一分子葡萄糖，結合文獻推測此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷。

化合物4：楊梅素-3-O-鼠李葡萄糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z625.13[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O17，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、317、463[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z317[M-H-162-146]-是母離子失去一分子葡萄糖再失去一分子鼠李糖，再將m/z317的碎片離子峰與對照品相比，發(fā)現(xiàn)其為楊梅素，故結合文獻推測此化合物為楊梅素-3-O-鼠李葡萄糖苷。

化合物5：槲皮素-3，7-O-二葡葡糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z625.13[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O17，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、301、124、463[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z301[M-H-162-162]-是母離子失去兩分子葡萄糖，結合文獻推測此化合物為槲皮素-3，7-O-二葡葡糖苷。

化合物6：蘆丁。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z609.14[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O16，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z463、301、463[M-H-146]-是母離子失去一分子鼠李糖，m/z301[M-H-146-162]-是母離子失去一分子鼠李糖后又失去一分子葡萄糖。故結合文獻推測此化合物為蘆丁。

化合物7：槲皮素-3-O-鼠李糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、300、273、124、301[M-H-146]-，是母離子失去一分子鼠李糖，結合文獻推測此化合物為槲皮素-3-O-鼠李糖苷。

化合物8：山柰酚-3-O-葡萄糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z447.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O11，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z285、227、159、285[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z285與山柰酚的母離子相同，又經(jīng)過碎片離子m/z227和159可以驗證為山柰酚，結合文獻推測此化合物為山奈酚-3-O-葡萄糖苷。

化合物9：山柰酚-3-O-蕓香糖。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z593.15[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C27H30O15，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z285、159、117、285[M-H-308]-是母離子失去一分子蕓香糖，又經(jīng)過m/z159和117可驗證為山柰酚的碎片離子，結合文獻推測此化合物為山奈酚-3-O-蕓香糖。

化合物10：槲皮素-3-O-葡萄糖苷。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z463.09[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C21H20O12，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z301、273、152、124。m/z301是槲皮素的母核離子，m/z301[M-H-162]-是母離子失去一分子葡萄糖，m/z273[M-H-162-28]-是母離子失去一分子葡萄糖后再失去一個CO，m/z152[M-H-162-149]-是母離子失去一分子葡萄糖后再進行A1.3裂解[18]，m/z124[M-H-162-149-28]-是A1.3裂解后再失去一個CO，并結合文獻推測此化合物為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。此譜圖中的槲皮素碎片離子與對照品中的槲皮素碎片離子相同。見圖2。

圖2 槲皮素-3-O-葡萄糖苷可能的裂解途徑

化合物11：櫻黃素。結合負離子模式下質(zhì)譜的分子離子峰m/z283.06[M-H]-，推斷此化合物的分子式為C16H12O5，再根據(jù)化合物分子式找出二級質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)譜圖中有碎片離子m/z268、152、135、268[M-H-15]-是母離子失去一分子甲基，m/z152和135是母離子在C環(huán)的O和3間的鍵斷裂所形成的碎片離子，結合文獻推測此化合物為櫻黃素。

4 討論

UPLC/Q-TOF-MS技術可快速、高效地得到玫瑰花渣提取液中化合物的質(zhì)譜碎片離子，并根據(jù)碎片離子可以快速分析其中化合物的結構。綜上所述玫瑰花渣中的黃酮類化合物主要以醇苷類成分存在，并且以槲皮素、山柰酚為苷元與葡萄糖基、鼠李糖基結合形成黃酮醇苷類化合物。玫瑰花渣中黃酮醇苷的裂解主要是先逐步失去糖類成分，黃酮苷元的裂解先是C環(huán)的RDA裂解，然后再失去小分子碎片，比如H2O、CO、CO2等。本實驗結合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，根據(jù)RDA裂解產(chǎn)生的碎片離子及A環(huán)和B環(huán)上的取代基種類對該碎片的豐度的影響來判定糖基和苷元的連接位置。

目前對玫瑰花渣的研究較少涉及到具體成分分析，本實驗通過UPLC/Q-TOF-MS技術得到玫瑰花渣中黃酮類化合物的成分，對今后玫瑰花渣的資源開發(fā)和回收利用提供數(shù)據(jù)支持。若要全面分析玫瑰花渣化合物成分，還需要進一步的實驗研究。

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AnalysisofFlavonoidsinRoseDregsofMiaofengMountaininBeijingbyUPLC/Q-TOF-MS

WANGFangfang1，KANGYing1，ZHANGQuan1，QIMengdie1，LIUYonggang1，GAOTongyu2，WUYajuan2，LIUYong1*

(1.BeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100102，China；2.BeijingMentougouNationalEcologicalRestorationTechnologyComprehensiveDemonstrationBase，Beijing102300，China)

Objective：The qualitative analysis of flavonoids in rose dregs was carried out by UPLC/Q-TOF-MS.MethodsThe separation was performed on a Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)with acetonitrile-0.1% formic acid in water by gradient elution.Electrospray ionization-(ESI)source was applied and operated in negative ion mode.Results11 flavonoids were identified by rapid separation of UPLC and based on mass spectrometry data and literature analysis.ConclusionThe use of UPLC/Q-TOF-MS technology can effectively analyze the flavonoids in rose dregs and provide data for the recovery of rose dregs.

UPLC/Q-TOF-MS；rose dregs；flavonoids；Miaofeng montain in Beijing

北京市科技計劃項目(Z151100001415009)

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劉勇，教授，研究方向：藥用植物親緣學、中藥質(zhì)量與開發(fā)；Tel：(010)84738656，E-mail：yliu0126@aliyun.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.011

2017-04-10)