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    高效液相色譜法測(cè)定垂盆草-柴胡藥對(duì)不同比例配伍中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量

    2017-12-11 02:12:55蔣志濤呂玲燕汪銅芳陳曉峰巫靜華
    中國(guó)現(xiàn)代中藥 2017年11期
    關(guān)鍵詞:異鼠李素槲皮素

    蔣志濤,呂玲燕,汪銅芳,2,陳曉峰,巫靜華*

    (1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院 江蘇省企業(yè)研究生工作站,江蘇 張家港 215600;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    高效液相色譜法測(cè)定垂盆草-柴胡藥對(duì)不同比例配伍中槲皮素、山柰素、異鼠李素的含量

    蔣志濤1,呂玲燕1,汪銅芳1,2,陳曉峰1,巫靜華1*

    (1.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院 江蘇省企業(yè)研究生工作站,江蘇 張家港 215600;2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,江蘇 南京 210023)

    目的考察垂盆草配伍柴胡后對(duì)總黃酮煎出量的影響。方法使用高效液相色譜法分別對(duì)單味垂盆草藥材的水煎液及不同比例垂盆草柴胡配伍后的單煎合液及合煎液中3種黃酮的總含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果不同比例垂盆草柴胡配伍的單煎合液中總黃酮的含量與垂盆草單煎液并無顯著性差異,合煎液中總黃酮的含量顯著增加。結(jié)論垂盆草配伍柴胡對(duì)總黃酮的煎出有促進(jìn)作用。

    垂盆草;柴胡;配伍;總黃酮

    垂盆草具有利濕退黃、清熱解毒的功能,可用于濕熱黃疸、小便不利、癰腫瘡瘍的治療,垂盆草與其他藥物配伍后可增強(qiáng)其疏肝健脾、利濕退黃的效果[1-3]。在中醫(yī)藥理論中,垂盆草配伍柴胡具有非常廣泛的應(yīng)用,如益肝樂顆粒,全方由垂盆草、柴胡、郁金等藥材組成,用于濕熱蘊(yùn)蒸、身目俱黃或兩脅痞滿、疼痛、體倦懶食、溲赤便溏、舌苔黃膩等,急、慢性肝炎屬上述證候者。垂盆草能利濕退黃、清熱解毒,柴胡則可疏肝解郁、升舉陽氣,兩藥配伍用有非常廣泛的藥理作用[4-6]。楊潔文等[7]通過使用不同劑量柴胡垂盆草湯灌胃對(duì)化療藥物(匹服平)所致的肝損傷小鼠的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)治療組與模型組血清學(xué)測(cè)試及病理學(xué)表現(xiàn)均存在顯著性差異。垂盆草配伍柴胡前期多注重藥理學(xué)方面的研究,對(duì)其化學(xué)成分的研究卻很少見[8-10],本文以高效液相色譜法觀察垂盆草與柴胡不同比例配伍對(duì)垂盆草有效成分槲皮素、山柰素、異鼠李素3種黃酮總含量煎出率的影響。

    1 儀器與材料

    1.1 儀器

    Waters e2695高效液相色譜儀、Waters 2998二極管陣列檢測(cè)器、Epower2化學(xué)工作站、分析天平(Shimadzu Aux220)。

    1.2 材料

    槲皮素對(duì)照品、山柰素對(duì)照品、異鼠李素對(duì)照品(成都曼斯特科技開發(fā)有限公司,批號(hào)分別為13122506、14010701、13053007);甲醇為色譜純(德國(guó)默克);水為娃哈哈純凈水;鹽酸為分析純。

    垂盆草、柴胡藥材飲片均來自張家港市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科,經(jīng)張家港市中醫(yī)醫(yī)院余輝副主任中藥師鑒定均符合2015版《中華人民共和國(guó)藥典》一部項(xiàng)下規(guī)定。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 樣品溶液的制備

    按表1規(guī)定處方量準(zhǔn)確稱取各味藥,充分混勻后分別置于1000 mL燒瓶中,加8倍量水,煮沸后1 h,用4層醫(yī)用紗布過濾,殘?jiān)?倍水重復(fù)以上過程,合并2次濾液,定容至藥材總重的20倍量,采取相同的加水倍數(shù)、煎煮次數(shù)及煎煮時(shí)間,分別煎煮,每組平行制備兩份。精密量取垂盆草及柴胡單煎液,配制成垂盆草與柴胡煎出液分別為2∶1、1∶1、1∶2的單煎合液適量。每組平行制備兩份即得1~8號(hào)樣品溶液。

    表1 不同藥物配比組成

    2.2 HPLC檢測(cè)

    以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,色譜柱為Hedera ODS-2(200 mm×4.6 mm,5 μm);以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑,選用不同比例的0.4%磷酸溶液(A)∶甲醇(B)為流動(dòng)相,梯度洗脫,條件見表2。

    2012年鎮(zhèn)江市積極采取措施進(jìn)行智慧城市建設(shè)并取得一定成效[2]。2016年在《鎮(zhèn)江市“十三五“規(guī)劃綱要》中,鎮(zhèn)江市人民政府明確提出要推進(jìn)“智慧鎮(zhèn)江”建設(shè),全面提升一體化基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)水平。2018年鎮(zhèn)江市榮獲“2018中歐綠色智慧城市獎(jiǎng)”。目前鎮(zhèn)江智慧城市建設(shè)已經(jīng)進(jìn)入發(fā)展新階段。揚(yáng)中市智慧城市建設(shè)一方面能夠?yàn)殒?zhèn)江下屬縣級(jí)市例如丹陽、句容、丹徒等提供建設(shè)樣本,以點(diǎn)帶面整體推進(jìn)鎮(zhèn)江全市范圍內(nèi)的智慧建設(shè);另一方面,揚(yáng)中市加強(qiáng)與鎮(zhèn)江產(chǎn)業(yè)合作創(chuàng)新,對(duì)傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)進(jìn)行升級(jí)轉(zhuǎn)型,促進(jìn)經(jīng)濟(jì)共享、資源共享、共同發(fā)展,為鎮(zhèn)江經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展貢獻(xiàn)力量,進(jìn)一步推動(dòng)“智慧鎮(zhèn)江”建設(shè)。

    表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

    2.3 溶液制備

    2.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取槲皮素、山柰素、異鼠李素19.20、5.01、5.25 mg,分別置于不同的10 mL容量瓶中,加適量甲醇溶解,并用甲醇定容至刻度,搖勻備用。分別取1 mL上述對(duì)照品溶液置于25 mL容量瓶中,用甲醇稀釋定容至刻度,制成每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對(duì)照品溶液。

    2.3.2 供試品溶液的制備 精密吸取上述樣品溶液20 mL,置于蒸發(fā)皿中,水浴鍋上蒸干,精密量取甲醇-25%鹽酸溶液(4∶1)混合溶液25 mL,稱定重量,加熱回流1 h,放冷,用上述混合溶液補(bǔ)足重量,搖勻,過0.45 μm微孔濾膜,取續(xù)濾液,即得。

    2.4 方法學(xué)考察

    2.4.1 系統(tǒng)適用性考察 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液和1號(hào)供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。色譜圖見圖1。結(jié)果顯示,在供試品溶液中槲皮素、山柰素、異鼠李素與對(duì)照品有相同的保留時(shí)間。

    2.4.2 專屬性試驗(yàn) 在與樣品測(cè)定完全相同的條件下,精密吸取2號(hào)供試品項(xiàng)下的柴胡水煎液10 μL,連續(xù)進(jìn)2針,發(fā)現(xiàn)陰性無干擾,色譜圖見圖1中C。說明垂盆草中槲皮素、山柰素、異鼠李素專屬性較強(qiáng)。

    注:A.混合對(duì)照品;B.供試品;C.陰性樣品;1.槲皮素;2.山柰素;3.異鼠李素。圖1 對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照溶液的HPLC圖

    2.4.3 線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液各1、2、4、6、10、12 μL進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,以槲皮素、山柰素、異鼠李素的進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)X,以三者峰面積為縱坐標(biāo)Y,各自進(jìn)行線性回歸,槲皮素線性回歸方程:Y=3 072 031.2X-13 231.4,r=0.999 9;山柰素的線性回歸方程:Y=3 062 657.1X-6 241.3,r=0.999 8;異鼠李素的線性回歸方程:Y=2 583 461.7X-9 123.2,r=0.999 9。結(jié)果表明,槲皮素、山柰素、異鼠李素分別在0.076 8~1.92、0.020 04~0.501、0.021~0.525 μg線性關(guān)系良好。

    2.4.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對(duì)照品溶液,按照2.2項(xiàng)下色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行分析測(cè)定,進(jìn)樣量均為10 μL。分別測(cè)定槲皮素、山柰素、異鼠李素峰面積,結(jié)果計(jì)算得出槲皮素、山柰素、異鼠李素的峰面積的RSD分別為0.7%、0.8%、1.2%,表明精儀器的精密度良好,可用于進(jìn)一步試驗(yàn)分析。

    2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份樣品(垂盆草單煎液)按供試品溶液的制備方法,于室溫(20~25 ℃)下放置,分別于0、2、4、6、8、10 h進(jìn)樣,每次進(jìn)樣10 μL,按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,記錄6次峰面積,結(jié)果10 h內(nèi)RSD為0.98%,表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.4.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一份樣品(垂盆草單煎液),按供試品溶液的制備方法,共平行制備6份,分別精密吸取10 μL,按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果槲皮素、山柰素、異鼠李素的平均含量分別為1.14、0.32、0.48 mg·g-1,各成分含量的RSD分別為1.2%、1.1%、1.4%,均符合要求,結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

    2.4.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取同一份樣品(垂盆草單煎液)10 mL,共6份,分別精密加入一定量的槲皮素對(duì)照品溶液(1.92 mg·mL-1)、山柰素對(duì)照品溶液(0.501 mg·mL-1)、異鼠李素對(duì)照品溶液(0.525 mg·mL-1),上述溶液按2.1項(xiàng)下供試品溶液的制備方法分別制備6份,按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣,分析測(cè)定,測(cè)定方法的回收率。測(cè)定結(jié)果見表3~5。

    表3 槲皮素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    表4 山柰素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    表5 異鼠李素的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

    2.5 樣品測(cè)定

    精密吸取2.1項(xiàng)下表1中除柴胡單煎液外的各樣品溶液,按供試品溶液的制備方法,每個(gè)配比平行制備兩分,共14份,分別精密吸取每1 mL含槲皮素、山柰素、異鼠李素分別為0.076 8、0.020 04、0.021 mg的混合對(duì)照品溶液及各供試品溶液各10 μL,連續(xù)進(jìn)2針,采用隨行標(biāo)準(zhǔn),用外標(biāo)一點(diǎn)法測(cè)定,即得各個(gè)樣品3種黃酮成分的總含量,結(jié)果見表6。

    表6 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

    注:與垂盆草單煎液比較▲P< 0.01。

    精密吸取各樣品10 μL,分別進(jìn)樣3次,按外標(biāo)法計(jì)算3種黃酮類總含量,計(jì)算平均值,所得結(jié)果見表6。實(shí)驗(yàn)結(jié)束,采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理(P<0.01)組間差異采用Dunett-t檢驗(yàn)。

    3 討論

    藥理學(xué)研究證明,垂盆草中黃酮類成分具有抗肝組織纖維化、保肝降酶、保護(hù)肝細(xì)胞的作用[11-16]?!吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015版把槲皮素、山柰素、異鼠李素作為控制垂盆草藥材的質(zhì)量指標(biāo),因此,本實(shí)驗(yàn)研究以3種黃酮的總含量作為考察的指標(biāo)。垂盆草與柴胡相須為用,可增強(qiáng)保肝降酶、止痛之力。有研究表明,在垂盆草與柴胡配伍的諸多方劑中,兩者以1∶1配伍比例出現(xiàn)頻率最多。因此我們選擇2∶1、1∶1、1∶2的不同配伍比例進(jìn)行研究。

    在本實(shí)驗(yàn)選定的色譜條件下,3種黃酮成分得到較好的分離,無雜峰干擾測(cè)定。垂盆草單煎液與柴胡-垂盆草配伍水煎液是按照傳統(tǒng)中藥煎煮方法平行操作制得,以此來考察煎煮過程中柴胡對(duì)垂盆草總黃酮的影響。單煎合液采用兩種藥材單獨(dú)煎煮后所得的煎液按比例混合,以此考察兩者簡(jiǎn)單混合時(shí)柴胡對(duì)垂盆草總黃酮煎出率的影響。兩種情況綜合考慮,研究單獨(dú)煎煮合并和合煎的合理性,據(jù)此研究柴胡-垂盆草配伍對(duì)3種黃酮類成分的影響是科學(xué)可行的。

    垂盆草單煎液中總黃酮煎出量為(1.964 7±0.468 3)mg·g-1,合煎液3種配比組成總黃酮煎出量依次為(2.107 3±0.004 1)、(2.136 0±0.019 4)、(2.249 2±0.003 2)mg·g-1,單煎合液不同配比總黃酮含量依次為(1.932 9±0.001 6)、(1.923 2±0.008 8)、(1.946 4±0.020 2)mg·g-1。由上可知,單煎合液與垂盆草單煎液相比,不存在顯著性差異(P>0.01),說明在混合的過程中,柴胡對(duì)垂盆草中的總黃酮無顯著影響。合煎液中總黃酮煎出量與垂盆草單煎液相比含量顯著增加(P<0.01),說明柴胡垂盆草合煎后對(duì)垂盆草中的總黃酮溶出有促進(jìn)作用,不同配比之間沒有明顯的規(guī)律。故筆者推測(cè)垂盆草和柴胡配伍可能是在煎煮過程中通過影響總黃酮的含量來影響藥效的,而兩者單獨(dú)煎煮后混合并無顯著影響,也就是說兩者配伍不能簡(jiǎn)單地混合,必須共同煎煮才可行。中藥成分復(fù)雜,不能根據(jù)某一種或幾種有效成分的含量來判斷藥效,因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究中應(yīng)盡可能選取多指標(biāo)成分進(jìn)行研究,結(jié)合化學(xué)指標(biāo)和藥效學(xué)指標(biāo)進(jìn)行綜合考察。

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    DeterminationofContentofQuercetin,KaempferideandIsorhamnetininDrugPairHerbaSediSarmentosiandRadixBupleuriofDifferentProportionsbyHPLC

    JIANGZhitao1,LYULingyan1,WANGTongfang1,2,CHENXiaofeng1,WUJinghua1*

    (1.ZhangjiagangHospitalofTraditionalChineseMedicine,AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofChineseMedicine;GraduateworkstationofenterprisesinJiangsuProvince,Zhangjiagang215600,China,2.NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing210023,China)

    Objective:To examine the effect of drug pair Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions on extract amount of quercetin,kaempferide and isorhamnetin.MethodsThe contents of quercetin,kaempferide and isorhamnetin in decoctions of Herba Sedi Sarmentosi,Radix Bupleuri as well as Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportions were determined by HPLC,respectively.ResultsThere was no significant difference in flavonoids content of separated decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri in different proportion,and Herba Sedi Sarmentosi decoction.The total flavonoid content in together decocted Herba Sedi Sarmentosi and Radix Bupleuri increased significantly.ConclusionRadix Bupleuri enhances the extraction of total flavonoid in Herba Sedi Sarmentosi decoction.

    Herba Sedi Sarmentosi;Radix Bupleuri;compatibility;total flavonoids

    蘇州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(SYSD2017161,SYSD2015165)

    *

    巫靜華,主管中藥師,研究方向:中藥制劑及質(zhì)量分析研究;Tel:(0512)56380621;E-mail:334582090@qq.com

    10.13313/j.issn.1673-4890.2017.11.028

    2017-02-11)

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