pH敏感聚合物膠束mPEG-GDE-OE的制備及其載藥性能

孫 慧，王 菲，汪云云，鞏 凱（江南大學(xué)藥學(xué)院，江蘇無錫214122）

由親水鏈段和疏水鏈段組成的兩親性聚合物能在選擇性溶劑中自組裝形成微觀聚集體，形成具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米膠束[1]。兩親性聚合物膠束粒徑小且分布窄，不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬，且能夠透過血管選擇性蓄積在腫瘤組織，起到被動(dòng)靶向的作用[2]。因此，聚合物膠束作為藥物傳遞載體，在腫瘤疾病的治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。兩親性聚合物不同親疏水基團(tuán)和結(jié)構(gòu)等對(duì)聚合物膠束的性能有重要影響。聚乙二醇（PEG）是一類重要的親水性高分子，具有良好的生物相容性，PEG基納米給藥系統(tǒng)可以避免粒子被內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)（RES）吞噬，從而在體內(nèi)具有長循環(huán)特性，在納米藥物遞送系統(tǒng)應(yīng)用廣泛[3-5]。從拓?fù)鋵W(xué)角度來說，兩親性聚合物分為線性、梳狀、刷狀等[6]，其合成方法有接枝法、自由基聚合法、開環(huán)聚合法等[7,8]。其中，刷狀聚合物是一種具有高支化的共聚物，能有效增強(qiáng)膠束核-殼層密度、表面的親水性以及抗蛋白和血小板吸附能力，提升膠束穩(wěn)定性，延長膠束的循環(huán)周期，從而改善載藥聚合物膠束體系的控釋性能[9]。楊友強(qiáng)等[10]通過自由基聚合和開環(huán)聚合法合成了一種具有無規(guī)疏水/pH響應(yīng)結(jié)構(gòu)的聚合物分子刷，疏水鏈段為接枝刷狀結(jié)構(gòu)，有利于提高膠束內(nèi)核的緊密度，將聚甲基丙烯酸(PMAA)固定在膠束內(nèi)核，有效避免因PMAA離子化使膠束內(nèi)核過度溶脹而導(dǎo)致的膠束解離，從而實(shí)現(xiàn)可控釋放。Wu等[11]采用開環(huán)聚合、酯化等多步反應(yīng)合成了具有聚縮醛骨架的聚合物分子刷，自組裝成棒狀載藥膠束，該膠束表現(xiàn)出良好的pH響應(yīng)性，能顯著提升藥物的細(xì)胞攝取量。

基于腫瘤組織微環(huán)境，環(huán)境敏感性（如pH、溫度或氧化還原等[12,13]）聚合物膠束應(yīng)運(yùn)而生，在物理或化學(xué)刺激作用下，聚合物膠束結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而達(dá)到控制藥物釋放的目的。與正常細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞吸收和代謝葡萄糖的速率較快，代謝過程會(huì)產(chǎn)生大量乳酸，這導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈酸性環(huán)境，pH低于正常組織細(xì)胞[14]。基于這一特性，構(gòu)建具有pH響應(yīng)性納米藥物載體可實(shí)現(xiàn)化療藥物靶向遞送或定位釋放于腫瘤組織[15]，其設(shè)計(jì)方式有兩種：一是利用pH敏感基團(tuán)構(gòu)建載體，如聚組氨酸、馬來酸衍生物、羧化聚縮水甘油等；二是利用pH敏感化學(xué)鍵構(gòu)建載體，如腙鍵、酰腙鍵、縮醛/酮鍵等[16]。Zhou等[17]采取可逆-加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移自由基聚合（RAFT）合成了兩親性聚合物，其結(jié)構(gòu)由聚甲基丙烯酰胺的骨架和2個(gè)原酸酯環(huán)的支鏈組成。當(dāng)pH=5.0時(shí)，原酸酯基團(tuán)在12h內(nèi)能完全分解，藥物釋放量達(dá)70%，噻唑藍(lán)（MTT）比色法驗(yàn)證了該材料無細(xì)胞毒性。Wang等[18,19]通過縮聚反應(yīng)合成了含原酸酯的三嵌段聚合物，其納米膠束具有良好的pH響應(yīng)性、低細(xì)胞毒性和優(yōu)良的抗腫瘤性。原酸酯基聚合物獨(dú)特的理化性質(zhì)引起眾多學(xué)者的研究興趣，成為科學(xué)家們的研究熱點(diǎn)之一。

本課題組在原酸酯基聚合物的合成及其藥物遞送系統(tǒng)中的應(yīng)用取得了初步成果，進(jìn)一步驗(yàn)證了原酸酯基聚合物具有獨(dú)特的理化特性和優(yōu)異的性能[20,21]。本文以甲氧基聚乙二醇胺（mPEG-NH2）、（2-十八烷氧基-1,3-二氧戊烷-4基）甲胺（OE）、十八烷基胺（OA）和乙二醇二縮水甘油醚（GDE）為單體，經(jīng)開環(huán)反應(yīng)一步法合成pH敏感聚合物mPEG-GDE-OE和非pH敏感聚合物mPEG-GDE-OA。采用溶劑揮發(fā)法制備了mPEG-GDEOE膠束和mPEG-GDE-OA膠束，以阿霉素（DOX）為模型藥物，探討聚合物膠束的載藥性能、體外釋放性能以及載藥聚合物膠束的細(xì)胞毒性與體外抗腫瘤活性。本文報(bào)道了一種兩親性聚合物mPEG-GDE-OE的綠色合成方法，該聚合物具有良好的pH響應(yīng)性和生物相容性，是一種有著重要應(yīng)用前景的藥物載體材料。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

三氟乙酸乙酯（CF3COOC2H5）、原甲酸三甲酯、3-氨基-1,2-丙二醇：分析純，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；二氯甲烷（DCM）、三乙胺、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、四氫呋喃（THF）、對(duì)甲苯磺酸（p-TSA）、十八烷醇、水合肼：化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲氧基聚乙二醇胺（mPEG-NH2，Mn=2000）、OA、GDE、對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽、對(duì)甲苯磺酰氯、鄰苯二甲酰亞胺、鹽酸阿霉素（DOX·HCl）：分析純，上海阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；二甲亞砜（DMSO）、DMEM培養(yǎng)基與RPMI-1640培養(yǎng)基（其中含10%胎牛血清、100IU/mL青霉素及100μg/mL鏈霉素）、MTT、雙抗（青霉素-鏈霉素）：美國Sigma公司；胰酶：上海生工生物工程有限公司；胎牛血清FBS：美國Gibco Invitrogen公司；人乳腺癌細(xì)胞（MCF-7）、人宮頸癌細(xì)胞（Hela）：中國科學(xué)院典型生物保藏中心細(xì)胞庫。

1.2 測(cè)試與表征

采用凝膠滲透色譜（GPC）儀（美國沃特世公司W(wǎng)aters1525型）測(cè)定聚合物的分子量及分子量分布，用DMF作為流動(dòng)相；采用核磁共振波譜儀（美國Bruker公司AvanceⅢ400MHz型）測(cè)試核磁共振氫譜（1HNMR）；采用納米粒度儀（英國馬爾文儀器有限公司Zetasizer Nano ZS型）檢測(cè)聚合物膠束的粒徑和粒徑多分散指數(shù)；采用紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)有限公司UV-1800型）測(cè)定包封率及載藥量；采用透射電子顯微鏡（日本JEOL公司JEM-2100型）觀察膠束粒子形態(tài)；采用酶標(biāo)儀（美國分子儀器公司Molecular Devices M2e型）測(cè)定吸光度；采用激光共聚焦掃描顯微鏡（CLSM，日本尼康公司Ti2-E型）觀察載藥聚合物膠束的細(xì)胞攝取情況；采用流式細(xì)胞儀（貝克曼庫爾特生物科技有限公司Cytoflex A00-1-1102型）檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物的攝取量。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1OE 的合成 首先，將 3-氨基-1,2-丙二醇（9.11g）溶解于 THF（60mL）中，在 N2保護(hù)和冰水浴下，緩慢滴加三氟乙酸乙酯（13.5mL），滴加完畢后，室溫下攪拌反應(yīng)6h后旋轉(zhuǎn)除去THF，向圓底燒瓶中加入乙酸乙酯（100mL），分別用飽和硫酸氫鈉水溶液（10mL×2）、飽和鹽水（10mL×2）洗滌，有機(jī)相用無水碳酸鉀干燥過夜，過濾旋蒸得到化合物1。

將化合物 1（9.356g）、原甲酸三甲酯（25.46g）溶于 DCM（60mL）中，加入 p-TSA（0.1g），于 N2保護(hù)下室溫反應(yīng)12h后，向反應(yīng)液中滴加幾滴三乙胺終止反應(yīng)，加入二氯甲烷（30mL）稀釋，分別用飽和NaHCO3水溶液（30mL×3）、飽和鹽水（30mL）洗滌，有機(jī)相用無水碳酸鉀干燥過夜，經(jīng)過濾旋蒸干燥得到化合物2。

向圓底燒瓶中加入化合物 2（4.58g）、十八烷醇（5.40g）、對(duì)甲苯磺酸吡啶鹽（0.05g），于 110℃ 真空條件下反應(yīng) 12h 后，加入 THF（40mL）溶解反應(yīng)物，于冰水浴下緩慢滴加NaOH 水溶液（w=4%，60mL），室溫下反應(yīng)4h后，用乙醚（200mL×3）萃取，合并有機(jī)相，用無水碳酸鉀干燥過夜，經(jīng)過濾旋蒸得到粗產(chǎn)物，經(jīng)層析柱得到產(chǎn)物OE，其合成路線如圖1所示。

圖1 單體 OE 的合成路線Fig.1 Synthetic routes of monomer OE

1H-NMR（400MHz，CDCl3）δ：0.88（t，J=6.8Hz，3H，CH3），1.25（s，32H，CH2（CH2）16CH3），1.60～1.57（m，2H，CH2CH2CH2），2.97～2.82（m,2H,NH2CH2CH），3.54～3.49（m，2H，OCH2CH2），3.82～3.73（m,1H,（CH2）2CHO），4.37～4.05（m，2H，OCH2CH），5.83（d，J=14.2Hz，1H，CH）。

1.3.2聚合物的合成 向圓底燒瓶中加入 OE（或 OA）、mPEG-NH2和 GDE（三者的物質(zhì)的量之比為 1∶1∶2）溶于干燥的 DMF（2mL）中，在 60℃ 反應(yīng) 48h 后，用透析袋（截留分子量為 3500）透析 2～3d，經(jīng)冷凍干燥得到聚合物mPEG-GDE-OE（或mPEG-GDE-OA），其合成路線如圖2所示。mPEG-GDE-OE：產(chǎn)率為81%，Mn=14136，Mw=16682，PDI=1.18；mPEG-GDE-OA：產(chǎn)率為 85%，Mn=13638，Mw=16398，PDI=1.20。

圖2 聚合物的合成路線Fig.2 Synthetic routes of polymers

1.3.3聚合物膠束的制備 稱取 mPEG-GDE-OE（或 mPEG-GDE-OA）10mg 溶于 THF（2mL）中，將其緩慢滴加到 10mL 磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH=7.4）中，配成 1mg/mL 的溶液。攪拌過夜，在冰水浴下超聲 10min（功率200W，工作 5s，間歇 5s）得到澄清的聚合物膠束。

1.3.4載藥聚合物膠束的制備 首先對(duì) DOX·HCl進(jìn)行脫鹽處理，稱取 DOX·HCl（10mg）溶于甲醇（10mL）中，加入適量三乙胺（10μL），室溫下避光攪拌過夜，真空干燥得到脫鹽阿霉素。稱取mPEG-GDE-OE（或mPEGGDE-OA）10mg 溶于 THF（2mL）中，將其緩慢滴加到 10mL 的 PBS（pH=7.4）中，配成1mg/mL 的溶液。充分?jǐn)嚢韬?，緩慢滴入DOX的THF溶液（2mL，質(zhì)量濃度約為1mg/mL），避光攪拌過夜，在冰水浴條件下超聲10min得到載藥聚合物膠束，其制備示意圖如圖3所示。

1.4 膠束的pH敏感性

用稀鹽酸（0.1mol/L）調(diào)節(jié)膠束的 pH 分別為 5.0 和 7.4，然后放置于搖床中（37℃，100r/min），在 0.5、2、6、12h取樣，測(cè)定膠束的粒徑。

1.5 聚合物膠束的載藥與體外釋放特性

利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定載藥聚合物膠束在480nm處的總阿霉素和游離阿霉素的吸光度，經(jīng)計(jì)算，DOX/mPEG-GDE-OE、DOX/mPEG-GDE-OA 載藥量分別為（9.4±1.3）%、（10.8±0.8）%，包封率分別為（94.3±1.9）%、（96.4±0.9）%，表明兩種聚合物具有較好的膠束化性能和良好的載藥性能。

采用動(dòng)態(tài)透析法考察載藥聚合物膠束的體外釋放行為。精確量取1mL載藥聚合物膠束DOX/mPEGGDE-OE、DOX/mPEG-GDE-OA置于透析袋（截留分子量為3500）中，分別放置于pH為7.4、6.8和5.0的20mL PBS中，并放置在37℃、100r/min的搖床中，于不同時(shí)間取樣1mL，同時(shí)補(bǔ)充相同體積和溫度的新鮮PBS釋放介質(zhì)。利用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定取樣樣品的紫外吸光度，計(jì)算累積釋放率，其藥物釋放示意圖如圖3所示。

圖3 載藥聚合物膠束的制備與藥物釋放示意圖Fig.3 Schematic representation of drug-loaded polymeric micelles’s formation and drug release

1.6 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.6.1細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn) 以MCF-7細(xì)胞和Hela細(xì)胞為模型，研究了膠束的細(xì)胞毒性。MCF-7細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，Hela細(xì)胞用RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。首先將培養(yǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以每孔1×104個(gè)的密度接種于96 孔板中，在 37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為 5% 的條件下培養(yǎng)24h；然后分別加入100μL 聚合物膠束（0.1～200μg/mL）、游離 DOX·HCl（0.01～20μg/mL）以及載藥聚合物膠束（0.01～20μg/mL）混懸液來替換原培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組。加藥培養(yǎng) 48h 后，棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入 100μL MTT 溶液（0.5mg/mL）孵育 4h，吸出 MTT 溶液，每孔加入100μL DMSO，用酶標(biāo)儀在570nm波長下測(cè)定每孔的吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率和半抑制濃度（IC50）值。

1.6.2細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 載藥聚合物膠束對(duì)Hela細(xì)胞在6孔板中以每孔3×105個(gè)的密度進(jìn)行接種，培養(yǎng)24h后，分別加入 2mL 游離 DOX·HCl、DOX/mPEG-GDE-OE 和 DOX/mPEG-GDE-OA（DOX 質(zhì)量濃度為 5μg/mL）孵育2h或4h后，棄去含藥培養(yǎng)基并用PBS洗滌3次，每孔加入200μL胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心并收集細(xì)胞，將細(xì)胞分散在300μL的PBS中，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞攝取情況。

將 Hela細(xì)胞接種于共聚焦皿（每個(gè)皿含有 8×104個(gè)細(xì)胞）培養(yǎng) 12h，加入 500μL 游離 DOX·HCl、DOX/mPEG-GDE-OE 和 DOX/mPEG-GDE-OA（DOX 質(zhì)量濃度為 5μg/mL）培養(yǎng) 1、2h或 4h后，棄去含藥培養(yǎng)基并用PBS洗滌3次；然后用200μL多聚甲醛溶液（w=4%）固定細(xì)胞20min，再用PBS洗滌3次；最后加入200μL的DAPI染色30min，并用PBS洗滌3次，利用CLSM進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 聚合物的表征

聚合物的核磁共振氫譜圖如圖4所示。在mPEG-GDE-OE的1H-NMR譜圖中，化學(xué)位移為0.88處為OE的CH3峰；1.49～1.20處為OE中烷基的CH2峰；5.82處為OE的CH特征峰，并含有mPEG-NH2的特征峰；3.5處為mPEG-NH2的OCH2CH2O特征峰。同樣，在mPEG-GDE-OA的1H-NMR譜圖中亦含有mPEG-NH2和OA的特征峰，由此可見，成功合成了聚合物mPEG-GDE-OE和mPEG-GDE-OA。

2.2 膠束的表征

聚合物膠束和載藥聚合物膠束的粒徑測(cè)定結(jié)果如圖5（a）所示。mPEG-GDE-OE、mPEG-GDE-OA膠束的平均粒徑分別為（168.2±4.6）nm、（157.5±3.4）nm，PDI分別為 0.223±0.013、0.234±0.049；前者比后者平均粒徑略大，可能是mPEG-GDE-OE中含五元環(huán)原酸酯的OE基團(tuán)比mPEG-GDE-OA中的直線型OA基團(tuán)略大造成的，OE基因受到空間位阻和氫鍵作用，使膠束的疏水內(nèi)核也有所增大。載藥聚合物膠束DOX/mPEG-GDEOE、DOX/mPEG-GDE-OA 的平均粒徑比相應(yīng)的聚合物膠束有所增大，分別為（191.6±6.7）nm、（182.8±5.2）nm，PDI分別為0.215±0.017、0.199±0.049，這是由于包載了疏水性藥物DOX所致。

由mPEG-GDE-OE膠束的TEM圖（圖5（b））可知，該膠束呈球形，且大小均一，粒徑約120nm，比DLS法測(cè)定粒徑小，這是因?yàn)橥干潆婄R的樣品需經(jīng)干燥預(yù)處理，膠束的親水外殼和疏水內(nèi)核因受熱脫水導(dǎo)致其發(fā)生收縮。

圖4 聚合物的1H-NMR 譜圖Fig.4 1H-NMR spectra of polymers

圖5 （a）膠束的粒徑分布；（b）mPEG-GDE-OE 膠束的 TEM 圖；（c）當(dāng) pH=5.0 時(shí)，mPEG-GDE-OE 膠束的粒徑分布圖；（d）不同pH條件下膠束的粒徑變化Fig.5 （a）Size distribution of micelles;（b）TEM image of mPEG-GDE-OE micelles;（c）Size distribution of mPEG-GDE-OE micelle at pH=5.0;（d）Size changes of micelles at different pH values

將制備好的mPEG-GDE-OE膠束分別加入pH=5.0的PBS中，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定膠束的粒徑變化結(jié)果如圖5（c）所示。由圖5（c）可知，mPEG-GDE-OE膠束的粒徑隨著時(shí)間增加而變大，0.5h取樣時(shí)，膠束粒徑?jīng)]有明顯變化；2h 時(shí)，粒徑為（232.4±3.8）nm，粒徑分布變寬，說明膠束開始發(fā)生溶脹；6h 時(shí)，膠束粒徑進(jìn)一步變大，分布變寬，并開始有小粒子出現(xiàn)，說明少部分膠束開始解體；12h時(shí)膠束粒徑繼續(xù)增大，并出現(xiàn)2個(gè)峰，說明有一部分膠束分解。

將聚合物膠束分別加入不同pH的PBS中，在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定膠束的粒徑變化情況，結(jié)果如圖5（d）所示。由圖5（d）可知，mPEG-GDE-OA膠束在pH=7.4和pH=5.0的PBS中，膠束粒徑?jīng)]有明顯變化；mPEGGDE-OE膠束在pH=7.4的PBS中呈現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，而在pH=5.0的PBS中，隨著時(shí)間延長粒徑變化較大，進(jìn)一步說明了mPEG-GDE-OE膠束具有pH響應(yīng)性。

2.3 聚合物膠束的載藥與體外釋放性能

載藥聚合物膠束的體外釋放曲線如圖6所示。由圖6可知，DOX/mPEG-GDE-OA膠束在不同pH下的釋放速率差別不大，累積釋放率也變化不大。DOX/mPEG-GDE-OE膠束在pH=7.4時(shí)，釋放速率平緩，72h累積釋放率約50%；當(dāng)pH=6.8時(shí)，在釋放初期，釋放速率略有加快，但72h后累積釋放率變化不大；當(dāng)pH=5.0時(shí)，釋放速率明顯變快，累積釋放率繼續(xù)增加，72h累積釋放率約80%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步說明了DOX/mPEG-GDEOE膠束具有明顯的pH響應(yīng)性，其原因主要是在酸性環(huán)境中原酸酯基團(tuán)的水解使載藥聚合物膠束解離，從而加快了藥物釋放速率，提高其藥物累積釋放率。

圖6 膠束的體外藥物釋放曲線Fig.6 In vitrodrug release profiles of micelles

2.4 細(xì)胞毒性研究

聚合物膠束的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，MCF-7細(xì)胞及Hela細(xì)胞在聚合物膠束（聚合物質(zhì)量濃度為200μg/mL）束中孵育48h后，細(xì)胞的存活率在85%以上，說明聚合物膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞和Hela細(xì)胞的毒性較低，安全性良好，可作為藥物的傳遞材料。

載藥聚合物膠束對(duì)MCF-7細(xì)胞、Hela細(xì)胞體外的殺傷性能實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖8所示。MCF-7細(xì)胞和Hela細(xì)胞的存活率隨著膠束中DOX濃度的升高而降低，對(duì)于MCF-7細(xì)胞，游離DOX·HCl、DOX/mPEG-GDE-OE、DOX/mPEG-GDE-OA 的 IC50值分別為（2.22±0.08）、（2.45±0.21）μg/mL 和（4.26±0.23）μg/mL；而對(duì)于 Hela細(xì)胞，三者的 IC50值分別為（1.83±0.12）、（2.08±0.16）μg/mL 和（3.9±0.27）μg/mL。由此可知，DOX/mPEG-GDE-OA的IC50值最大，而游離DOX·HCl和DOX/mPEG-GDE-OE的IC50值差別不大，說明聚合物膠束及載藥聚合物膠束對(duì)兩種細(xì)胞生長有一定影響，DOX/mPEG-GDE-OE對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力與游離DOX相當(dāng)。

2.5 細(xì)胞攝取研究

利用細(xì)胞攝取DOX而產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度來描述細(xì)胞對(duì)DOX/mPEG-GDE-OE膠束、DOX/mPEG-GDE-OA膠束和游離DOX·HCl的攝取情況，結(jié)果如圖9所示。隨著孵育時(shí)間延長，細(xì)胞培養(yǎng)孔板中的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，表明細(xì)胞對(duì)DOX的攝取具有時(shí)間依賴性。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，DOX/mPEG-GDE-OE膠束的細(xì)胞攝取量均高于DOX/mPEG-GDE-OA膠束和游離DOX·HCl的細(xì)胞攝取量，由此可見，DOX/mPEG-GDE-OE膠束有利于提高細(xì)胞對(duì)DOX的攝取，并能可控藥物釋放，提高抗腫瘤性能。

圖7 聚合物膠束對(duì) MCF-7 細(xì)胞和（a）Hela細(xì)胞（b）的體外毒性Fig.7 In vitrocytotoxicity of polymer micelles against（a）MCF-7cells and（b）Hela cells

圖8 載藥聚合物膠束對(duì)（a）MCF-7 細(xì)胞和（b）Hela細(xì)胞的體外毒性Fig.8 In vitrocytotoxicity of drug-loaded polymer micelles against（a）MCF-7cells and（b）Hela cells

圖9 載藥膠束在 Hela 細(xì)胞的（a）熒光強(qiáng)度分布和（b）平均熒光強(qiáng)度Fig.9 （a）Fluorescence intensity distribution and（b）average fluorescence intensity of drug-loaded micelles in Hela cells

為了進(jìn)一步確定DOX/mPEG-GDE-OE膠束、DOX/mPEG-GDE-OA膠束和游離DOX·HCl被細(xì)胞攝取的情況及在細(xì)胞內(nèi)的分布情況，通過CLSM對(duì)細(xì)胞進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖10所示。當(dāng)培養(yǎng)1h時(shí)，游離DOX·HCl進(jìn)入細(xì)胞核，而DOX/mPEG-GDE-OE膠束、DOX/mPEG-GDE-OA膠束開始進(jìn)入細(xì)胞，分布在細(xì)胞質(zhì)中；當(dāng)培養(yǎng)2h時(shí)，DOX/mPEG-GDE-OE膠束集中分布在細(xì)胞核，有部分DOX/mPEG-GDE-OA膠束被攝取到細(xì)胞核中；當(dāng)培養(yǎng)4h時(shí)，DOX/mPEG-GDE-OE膠束進(jìn)一步在細(xì)胞核聚集，DOX/mPEG-GDE-OA膠束被攝取到細(xì)胞核中的量比前者少，還有部分分布在細(xì)胞質(zhì)中，說明了DOX/mPEG-GDE-OE膠束能較好地進(jìn)入細(xì)胞核，并可控釋放DOX，從而有效抑制腫瘤細(xì)胞生長。

圖10 DOX/mPEG-GDE-OE、DOX/mPEG-GDE-OA 膠束在 Hela 細(xì)胞中的共聚焦掃描顯微鏡圖Fig.10 CLSM images of DOX/mPEG-GDE-OE and DOX/mPEG-GDE-OA micelles in Hela cells

3 結(jié) 論

（1）通過開環(huán)聚合反應(yīng)一步法合成了pH敏感聚合物mPEG-GDE-OE和非pH敏感聚合物mPEG-GDEOA，采用溶劑揮發(fā)法制備了相應(yīng)的聚合物膠束及載藥聚合物膠束，其形貌呈球形、粒徑分布均勻，具有良好的載藥性能和包封率。

（2）與mPEG-GDE-OA膠束相比，mPEG-GDE-OE膠束能有效控制藥物釋放速率，并具有良好的抗腫瘤活性，且聚合物材料具有良好的細(xì)胞相容性。