一種基于聚乳酸-聚組氨酸的新型口服藥物遞送載體

易翠翠， 馬夢(mèng)雅， 吳超慧， 王金鳳， 張振中， 任雪玲

（鄭州大學(xué) 1. 藥物研究院; 2. 河南省腫瘤重大疾病靶向治療與診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450001）

化學(xué)藥物治療（簡(jiǎn)稱(chēng)化療）是目前腫瘤治療的主要手段[1]。盡管口服給藥具有攜帶和服用方便，患者順應(yīng)性好等優(yōu)點(diǎn)[2]，但是由于大多數(shù)抗腫瘤藥物屬于疏水性分子，不僅在水中溶解度低，而且在胃腸道環(huán)境中不穩(wěn)定，導(dǎo)致口服藥物后血藥濃度和生物利用度低，限制腫瘤治療效果。同時(shí)，化療藥物副作用強(qiáng)，容易產(chǎn)生耐藥性[3,4]。因此設(shè)計(jì)并構(gòu)建安全、高效的口服藥物遞送載體以提高化療藥物的溶解性和生物利用度，降低化療藥物毒副作用，提高化療藥物治療效率，對(duì)于腫瘤治療具有重要意義。

兩親性嵌段共聚物是由親水和疏水兩個(gè)不同鏈段組成的一類(lèi)高分子共聚物，在藥物遞送領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景[5]。一方面，這類(lèi)藥物載體可以在水溶液中自組裝，疏水性的內(nèi)核或?qū)訝罱Y(jié)構(gòu)可以高效包載疏水性藥物，從而有效改善藥物溶解性；另一方面，藥物載體可以降低機(jī)體對(duì)藥物的降解和清除作用，提高藥物的生物利用度[6]，通過(guò)改變共聚單體的線性長(zhǎng)度可調(diào)節(jié)藥物的釋放速率，延長(zhǎng)藥物作用時(shí)間，減少給藥次數(shù)[7]。但是，兩親性嵌段共聚物大多數(shù)應(yīng)用于靜脈給藥，在口服藥物遞送中因苛刻的胃腸道環(huán)境使其穩(wěn)定性下降[8]。因此，本文希望設(shè)計(jì)并制備一種新型的口服藥物遞送載體，以期增強(qiáng)化療藥物的生物利用度，減少給藥頻次，降低毒副作用，提高治療效果。

聚乳酸（PLA）是美國(guó)食品與藥品管理局批準(zhǔn)的生物降解醫(yī)用材料，也是兩親性嵌段共聚物常用的疏水性鏈段，具有無(wú)毒、無(wú)刺激性、可生物降解吸收的特點(diǎn)，常用于藥物載體之一[9,10]。PLA分子鏈中含有酯鍵，易水解產(chǎn)生乳酸、水和二氧化碳，導(dǎo)致載體所在微環(huán)境酸性增強(qiáng)，從而影響所載藥物的穩(wěn)定性[11,12]。為改善PLA作為載體材料存在的缺點(diǎn)，通常使用其他材料對(duì)其進(jìn)行改性。聚組氨酸（PLH）是一種具有良好生物相容性的高分子聚合物，在藥物遞送領(lǐng)域具有重要應(yīng)用前景[13]。PLH咪唑環(huán)的不飽和氮原子上有一對(duì)孤電子對(duì)，解離常數(shù)（pKa）為6.5，可通過(guò)質(zhì)子-脫質(zhì)子作用實(shí)現(xiàn)親疏水性的轉(zhuǎn)變而具有兩親性特征。在低于pKa條件下，PLH由疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性[14,15]，可作為藥物載體的親水端。目前，PLH常用作藥物載體的疏水端，而其作為親水端的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文設(shè)計(jì)了一種基于PLA-PLH的新型藥物遞送載體，對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征；然后以2-甲氧基雌二醇（2-ME）作為模型藥物，以結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26為腫瘤細(xì)胞模型考察PLA-PLH/2-ME納米粒的細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒性和細(xì)胞遷移；最后在動(dòng)物水平考察其口服后的體內(nèi)分布情況，探討其作為口服藥物遞送載體的可行性。結(jié)果表明：PLA與PLH通過(guò)酰胺鍵連接形成嵌段聚合物，在弱酸性條件下，PLA作為疏水端，PLH可作為親水端，自組裝形成納米粒子；同時(shí)PLH降解產(chǎn)生的小分子組氨酸能夠中和PLA載體降解所產(chǎn)生的酸性物質(zhì)，緩解單一PLA降解所導(dǎo)致的局部pH過(guò)低現(xiàn)象。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料和試劑

2-ME（純度≥99.5%）：鄭州大學(xué)藥物研究院提供；PLA（Mw=5×103）：濟(jì)南岱罡生物科技有限公司；L-組氨酸鹽酸鹽（His·HCl）、2,4-二硝基氟苯、氯甲酸芐酯（CBZ-Cl）、亞硫酰氯（SOCl2）、正己胺：分析純，上海麥克林試劑有限公司；四氫呋喃（THF）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）、1,4-二氧六環(huán)：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；β-巰基乙醇：分析純，美國(guó)Genview公司；異硫氰酸熒光素（FITC）：分析純，美國(guó)Sigma公司；熒光染料1,1'-二十八烷基-3,3,3'，3'-四甲基吲哚并花青碘化物（DIR）：北京中生瑞泰科技有限公司；氯仿、乙醚、N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亞砜（DMSO）、鹽酸（HCl）、氫氧化鈉（NaOH）、碳酸氫鈉（NaHCO3）：分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞株CT26：鄭州大學(xué)藥物研究院保存；BALB/c小鼠：（18±2） g，無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)，雌性，河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK（豫）2017-0001。

1.2 測(cè)試與表征

核磁共振分析儀（德國(guó)布魯克AVAVCE III型）；傅里葉變換紅外光譜儀（日本島津RF-5301pc型）：溴化鉀壓片，光譜掃描范圍500 ～4 000 cm-1；馬爾文納米粒度儀（英國(guó)馬爾文Nano-ZS90型）：溶液體積為1 mL，25 ℃，平行掃描3次；熒光顯微鏡（日本Nikon Eclipse 80i型）；酶標(biāo)儀（美國(guó)DYNEX Spectra MR型）：波長(zhǎng)490 nm；小動(dòng)物活體成像儀（德國(guó)布魯克In Vivo FX PRO型）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 PLA-PLH的制備 PLA-PLH的合成路線如圖1所示，首先采用文獻(xiàn)[16～18]報(bào)道的酸酐開(kāi)環(huán)反應(yīng)合成PLH，然后再與PLA縮合而成PLA-PLH。

圖1 PLA-PLH的合成路線Fig. 1 Synthetic route of PLA-PLH

cbz-His的合成：將 2.100 0 g His·HCl溶于 NaOH 溶液（25 mL，1 mol/L）中，0 ℃ 條件下，滴加 1.41 mL cbz-Cl，接著升至室溫繼續(xù)反應(yīng)2 h，然后向上述反應(yīng)體系中加入20 mL乙醚，反應(yīng)3 h后以鹽酸調(diào)節(jié)pH至產(chǎn)物析出，經(jīng)過(guò)濾、干燥得到白色固體cbz-His。

cbz-His（DNP）的合成：將0.500 0 g cbz-His與0.600 0 mg NaHCO3溶于10 mL蒸餾水中，在冰浴條件下，依次加入 NaOH 溶液（1.2 mL，0.5 mol/L），1 mL 2,4-二硝基氟苯（216 μL）的 1,4-二氧六環(huán)溶液，在 0 ℃ 攪拌反應(yīng) 8 h后，用鹽酸酸化析出沉淀，過(guò)濾、干燥得黃色固體cbz-His（DNP）。

His-NCA（DNP）的合成：將0.030 0 g cbz-His（DNP）溶于25 mL 無(wú)水THF 中，加入10 μL SOCl2，室溫反應(yīng)40 min后，加入過(guò)量無(wú)水乙醚以沉淀產(chǎn)物，經(jīng)過(guò)濾、真空干燥得到His-NCA（DNP）。

PLH（DNP）的合成：將 0.020 0 g His-NCA（DNP）溶于 30 mL 無(wú)水 DMF中，加入 5 μL 引發(fā)劑正己胺，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)72 h后，以鹽酸酸化析出沉淀，經(jīng)過(guò)濾、干燥得黃色固體PLH（DNP）。

PLA-PLH（DNP）的合成：將 1.000 0 g PLA 溶于 50 mL CHCl3中，加入 0.115 0 g NHS、0.192 0 g EDC·HCl，室溫、氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)4 h后，向上述反應(yīng)體系中加入0.756 0 g PLH（DNP），室溫反應(yīng)48 h后，反應(yīng)液先用DMSO透析3 d，再用超純水透析3 d，凍干即得產(chǎn)物PLA-PLH（DNP）。

PLA-PLH的合成：稱(chēng)取0.500 0 g PLA-PLH（DNP）溶于20 mL DMF中，加入7.5 mL β-巰基乙醇，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，室溫反應(yīng)24 h，將反應(yīng)液用超純水透析72 h，冷凍干燥即得目標(biāo)產(chǎn)物PLA-PLH，轉(zhuǎn)化率為26%，產(chǎn)率為17%。

1.3.2 PLA-PLH/2-ME的制備 將藥物2-ME（激發(fā)波長(zhǎng)為290 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為 318 nm）與藥物載體PLA-PLH以不同質(zhì)量比（0.2∶1、0.4∶1、0.6∶1、0.8∶1、1.0∶1）溶于 DMSO。隨后，在攪拌條件下，將上述混合溶液緩慢滴加到pH=6.5的超純水中。最后，經(jīng)透析、冷凍干燥得到PLA-PLH/2-ME，其制備示意圖如圖2所示。稱(chēng)取5 mg PLA-PLH/2-ME納米粒，用甲醇溶解，定容至25 mL，經(jīng)超聲裂解、超速離心分離得到上清液，采用熒光分光光度計(jì)測(cè)定熒光強(qiáng)度。按下列公式分別計(jì)算包封率（RE）與載藥量（RL）：

圖2 PLA-PLH在水溶液中的自組裝Fig. 2 Self-assembly of PLA-PLH in aqueous solution

1.3.3 PLA-PLH的體外細(xì)胞攝取 參照PLA-PLH/2-ME的制備方法制備PLA-PLH/FITC（FITC與PLA-PLH的質(zhì)量比為0.6∶1）。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞接種于12孔板中（每孔1.5×105個(gè)），常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，移除舊培養(yǎng)基，更換為含有PLA-PLH/FITC的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置FITC對(duì)照組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)8 h后，棄去上清液，磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次，采用熒光顯微鏡觀察熒光分布情況。

1.3.4 PLA-PLH/2-ME的細(xì)胞抑制率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（每孔5.0×103個(gè)）培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為80%，棄去原培養(yǎng)基，加入含有PLA-PLH/2-ME納米粒（2-ME濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160 μmol/L，2-ME與 PLA-PLH的質(zhì)量比為 0.6∶1）的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置 2-ME對(duì)照組，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48 h后，每孔加入20 μL噻唑藍(lán)（5 mg/mL），置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔再加入150 μL的DMSO，低速振蕩（1.0×102r/min）至孔內(nèi)紫色結(jié)晶溶解完全，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度[19]，計(jì)算細(xì)胞抑制率（RI）并進(jìn)行顯著性分析（**P＜0.01, ***P＜0.001）。

1.3.5 PLA-PLH/2-ME抑制細(xì)胞遷移 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CT26細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2.0×105個(gè)，培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度約為80%，用10 μL槍頭在細(xì)胞板底部劃出一條筆直的橫線，磷酸鹽緩沖溶液洗滌，除去漂浮細(xì)胞，加入含有PLA-PLH/2-ME（2-ME濃度為80 μmol/L，2-ME與PLA-PLH質(zhì)量比為0.6∶1）的培養(yǎng)基，同時(shí)設(shè)置2-ME對(duì)照組和NC對(duì)照組，置于CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)至特定時(shí)間（0、12、24、36 h）于顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.3.6 PLA-PLH的體內(nèi)組織分布 按照PLA-PLH/2-ME的制備方法制備PLA-PLH/DIR(m (DIR)/m (PLAPLH)=0.6∶1)，DIR載藥量為33.7%。分別將DIR、PLA-PLH/DIR（DIR質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL）按每只小鼠200 μL的劑量，經(jīng)口飼喂BALB/C小鼠，隨后在不同時(shí)間點(diǎn)（1、8、24 h）用小動(dòng)物活體成像儀拍照，并在24 h脫頸處死小鼠，解剖主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胸腺與結(jié)腸），觀察熒光分布情況。

2 結(jié)果與討論

2.1 PLA-PLH的結(jié)構(gòu)表征

反應(yīng)原料、中間體及目標(biāo)產(chǎn)物的FT-IR譜圖如圖3所示。與His·HCl相比，cbz-His的FT-IR譜圖中，3 412 cm-1處的氨基伸縮振動(dòng)峰消失，并新增了1 738 cm-1處的羰基伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明cbz-His制備成功。與cbz-His相比，cbz-His（DNP）的FT-IR譜圖在2 930 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰，說(shuō)明cbz-His（DNP）制備成功。與 cbz-His（DNP）相比，His-NCA（DNP）的譜圖出現(xiàn)了羰基峰（1 785 cm-1），證明 His-NCA（DNP）的合成。與 His-NCA（DNP）相比，在 PLH（DNP）的譜圖上觀察到酸酐羰基峰（1 785 cm-1）的消失，證明 PLH（DNP）的合成。與PLH（DNP）相比，PLA-PLH（DNP）的FT-IR譜圖中，在3 442 cm-1處出現(xiàn)了PLH（DNP）的氨基伸縮振動(dòng)峰，在1 631 cm-1處出現(xiàn)了苯環(huán)的伸縮振動(dòng)峰，且在 1 759 cm-1處出現(xiàn)了羰基伸縮振動(dòng)峰，證明PLA-PLH（DNP）合成成功。PLA-PLH的FT-IR譜圖與PLA-PLH（DNP）相比并沒(méi)有明顯變化，需要進(jìn)一步進(jìn)行核磁表征。

圖3 樣品的紅外光譜圖Fig. 3 FT-IR spectra of samples

樣品的1H-NMR表征結(jié)果如圖4所示。與PLA相比，PLA-PLH（DNP）在化學(xué)位移8～9處出現(xiàn)了新質(zhì)子峰，PLA-PLH（DNP）在4～5處出現(xiàn)了CH—NH—CO的質(zhì)子峰，表明成功合成PLA-PLH（DNP）。在PLA-PLH的1H-NMR譜圖中，可以明顯看到在8～9處2,4-二硝基氟苯基團(tuán)峰消失，證明脫保護(hù)成功。1H-NMR進(jìn)一步驗(yàn)證FT-IR結(jié)果，表明PLA-PLH成功合成。

2.2 PLA-PLH的粒徑與電位表征

PLA-PLH具有兩親性，因此理論上PLA-PLH在水溶液中會(huì)自組裝成親水性PLH在外、疏水性PLA在內(nèi)的結(jié)構(gòu)。利用動(dòng)態(tài)光散射法進(jìn)行粒徑與電位的測(cè)定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。PLA-PLH納米粒的粒徑為（224.93±13.05） nm，電位為（5.42±1.01） mV，表明 PLA-PLH 可以形成納米結(jié)構(gòu)，同時(shí) ζ-電位的電正性也進(jìn)一步驗(yàn)證了PLH在外的結(jié)構(gòu)特征，這是因?yàn)镻LH咪唑環(huán)的不飽和氮具有電正性。

2.3 PLA-PLH/2-ME納米粒的制備

圖4 樣品的1H-NMR譜圖Fig. 4 1H-NMR spectra of samples

圖5 PLA-PLH 的（a）粒徑與（b）電位Fig. 5 (a)Particle size and (b) potential of PLA-PLH

采用溶劑交換法制備得到的PLA-PLH/2-ME的載藥量與包封率如圖6（a）所示。隨著藥物與載體投料比的增加，PLA-PLH的載藥量逐漸增大。當(dāng)投料比為0.6∶1時(shí)，PLA-PLH的載藥量增加到（27.86±0.19）%，包封率達(dá)到最大（（64.38±0.50）%）；當(dāng)投料比繼續(xù)增加時(shí)，PLA-PLH的載藥量沒(méi)有明顯提高，包封率顯著降低。因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中投料比均為0.6∶1。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，PLA-PLH能夠有效負(fù)載2-ME。

PLA-PLH負(fù)載2-ME后粒徑與電位如圖6（b）所示，2-ME負(fù)載前后，PLA-PLH的粒徑與電位均沒(méi)有明顯變化，表明2-ME包裹至納米粒內(nèi)部，且PLA-PLH負(fù)載2-ME后，依然能夠維持良好的納米結(jié)構(gòu)。

2.4 PLA-PLH/2-ME的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究

采用PLA-PLH負(fù)載FITC考察CT26細(xì)胞對(duì)PLA-PLH的攝取情況，結(jié)果如圖7（a）所示。攝取8 h后，游離FITC組與PLA-PLH/FITC組的CT26細(xì)胞內(nèi)均能觀察到綠色熒光，但是與游離FITC組相比，PLA-PLH/FITC組細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，表明PLA-PLH納米粒能夠顯著提高CT26細(xì)胞對(duì)FITC的攝取效率。

圖6 PLA-PLH/2-ME的（a）載藥量與包封率以及（b）粒徑與電位Fig. 6 (a)Drug loading and encapsulation efficacy,(b)particle size and potential of PLA-PLH/2-ME

圖7 （a）CT26細(xì)胞攝取成像（200×）；（b）PLA-PLH對(duì) CT26 細(xì)胞的細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果；（c）2-ME 和 PLA-PLH/2-ME 對(duì) CT26 細(xì)胞的細(xì)胞抑制率測(cè)定結(jié)果Fig. 7 (a)Cell uptake imaging of CT26 cells (200×);(b)Cytotoxicity results of CT26 cells with PLA-PLH;(c)Cell inhibition results of CT26 cells with 2-ME and PLA-PLH/2-ME

藥物載體PLA-PLH的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖7（b）所示。當(dāng)作用時(shí)間為24 h或48 h時(shí)，隨著PLA-PLH質(zhì)量濃度的不斷增加，CT26細(xì)胞的存活率有所下降；然而，即使PLA-PLH的質(zhì)量濃度增加到160 μg/mL，CT26腫瘤細(xì)胞的存活率仍然高于85%。表明空白載體PLA-PLH對(duì)CT26細(xì)胞增殖率的影響具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性，但未表現(xiàn)出明顯的增殖抑制作用。PLA-PLH/2-ME的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7（c）所示。當(dāng)作用48 h后，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，游離藥物2-ME與PLA-PLH/2-ME對(duì)CT26細(xì)胞的增殖均具有抑制作用，且具有濃度依賴(lài)性。與2-ME組相比，PLA-PLH/2-ME組CT26細(xì)胞的抑制率顯著增加，表明PLA-PLH可以提高2-ME對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，增強(qiáng)2-ME的抗腫瘤活性。

利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)考察納米粒PLA-PLH/2-ME對(duì)CT26細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組CT26細(xì)胞均逐漸向劃痕間隙遷移。與NC組和2-ME組相比，PLA-PLH/2-ME組的細(xì)胞遷移顯著減慢，說(shuō)明PLA-PLH能夠顯著提高2-ME對(duì)細(xì)胞遷移的抑制作用。

圖8 PLA-PLH/2-ME抑制CT26細(xì)胞遷移情況Fig. 8 PLA-PLH/2-ME suppressed the migration of CT26 cells

2.5 PLA-PLH的體內(nèi)組織分布

用DIR染料作為熒光標(biāo)記物，使用活體成像對(duì)口服灌胃后的DIR、PLA-PLH/DIR體內(nèi)分布情況進(jìn)行考察，結(jié)果如圖9（a）所示。經(jīng)口給藥后，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，DIR組與PLA-PLH/DIR組小鼠體內(nèi)總熒光強(qiáng)度均不斷降低。但是與游離DIR組相比，PLA-PLH/DIR組小鼠體內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著增加?？诜o藥24 h后，脫頸處死小鼠，解剖主要臟器進(jìn)行熒光成像，結(jié)果見(jiàn)圖9（b），相比于DIR組在各臟器均有熒光分布，PLA-PLH/DIR組的熒光主要集中于結(jié)腸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PLA-PLH可以顯著延長(zhǎng)DIR在小鼠體內(nèi)的滯留時(shí)間。更為重要的是，PLA-PLH/DIR可以高效進(jìn)入小鼠腸組織，說(shuō)明PLA-PLH是一種高效的口服遞送載體，可以降低機(jī)體對(duì)DIR的降解和清除作用，提高DIR的生物利用度。

圖9 DIR與PLA-PLH/DIR的體內(nèi)分布Fig. 9 Distribution of DIR and PLA-PLH/DIR in vivo

3 結(jié) 論

（1）基于聚組氨酸與聚乳酸成功構(gòu)建了兩親性嵌段共聚物PLA-PLH，并將其作為納米藥物載體。

（2）PLA-PLH納米粒可以提高藥物的細(xì)胞攝取，增強(qiáng)藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖與遷移的抑制作用。

（3）PLA-PLH可以降低藥物在胃腸道的降解，提高藥物的生物利用度。