青蒿琥酯對脂多糖誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)影響的分子機制研究

蔣 師，張興強

青蒿琥酯對脂多糖誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)影響的分子機制研究

蔣 師a，張興強b*

目的探討青蒿琥酯對脂多糖誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)的影響，并研究青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞炎癥治療作用的可能機制。方法體外原代培養(yǎng)人結(jié)腸上皮細胞，并分為空白對照組，LPS誘導(dǎo)組，青蒿琥酯低、中、高劑量組，CCK-8法檢測青蒿琥酯對人結(jié)腸細胞增殖的影響，ELISA法檢測青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞分泌IL-6和TNF-α炎癥因子的影響，Western blot檢測青蒿琥酯對Traf6/p65信號通路的影響。結(jié)果與LPS誘導(dǎo)組相比，青蒿琥酯能顯著改善LPS對人結(jié)腸上皮細胞增殖的抑制作用(P<0.05)；與LPS誘導(dǎo)組相比，各劑量青蒿琥酯均顯著降低了人結(jié)腸上皮細胞分泌的IL-6和TNF-α水平(P<0.05)；免疫印跡法檢測發(fā)現(xiàn)，各劑量青蒿琥酯組相對LPS誘導(dǎo)組細胞中Traf6和p-p65表達水平明顯降低(P<0.05)。結(jié)論青蒿琥酯可抑制人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)，進而改善炎癥對細胞增殖的抑制作用，其作用機制可能與下調(diào)Traf6/p65信號通路活化有關(guān)。

青蒿琥酯；人結(jié)腸上皮細胞；炎癥；信號通路

0 引言

青蒿琥酯(Artesunate)是青蒿素的一種半合成衍生物，對瘧疾的治療有顯著效果，還具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用[1]。青蒿琥酯能有效抑制自身免疫的發(fā)生，且其毒性較低，引起的不良反應(yīng)較少[2]。青蒿琥酯抑制關(guān)節(jié)炎癥主要通過抑制NF-κB信號通路傳導(dǎo)途徑中由LPS誘導(dǎo)的炎癥因子的分泌[3]。青蒿琥酯在炎癥治療中的研究越來越多，而其在消化系統(tǒng)中相關(guān)作用的研究較少。結(jié)腸炎是炎癥性腸病，主要病變位置在黏膜層與黏膜下層，多累及直腸與遠端結(jié)腸，甚至整個結(jié)腸，嚴重影響患者的生活質(zhì)量[4]。因此，筆者研究了青蒿琥酯對原代人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)的影響，并探討青蒿琥酯對介導(dǎo)炎癥反應(yīng)Traf6/p65信號通路活化的影響，以期對結(jié)腸炎的治療奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料及方法

1.1 試劑及儀器 青蒿琥酯(百靈威科技有限公司，批號：88495-63-0，≥98%)；HIEC培養(yǎng)基(美國ScienCell公司)、抗細菌/真菌溶液(美國ScienCell公司)、Ⅳ型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、Ⅰ型膠原酶溶液(美國Sigma公司)、胰蛋白酶(美國Sigma公司)；CCK-8試劑盒購自北京智杰方遠科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海谷歌生物有限公司，批號：P0012S-07)；ELISA試劑盒購自武漢華美生物有限公司；TBS粉末(武漢谷歌生物有限公司)；一抗稀釋液(上海吉諾公司，批號：C154855)；ECL顯色液(Sigma公司)；β-actin、Traf6、p65和p-p65一抗均購自美國Cell Signaling Technology；二抗羊抗兔IgG購自美國LI-COR Biosciences。單人超凈臺(北京六一儀器廠)；CB15C02細胞培養(yǎng)箱(北京六一儀器廠)；Victor3 1420 Multilable Counter酶標儀(美國BD，F(xiàn)ACS AriaⅢ)；HD-3000凝膠成像儀(上海上天精密儀器有限公司)。

1.2 青蒿琥酯儲備液制備 精密稱取青蒿琥酯10 mg于1.5 mL微量管中，加入40 μL DMSO后渦旋促使充分溶解，得到2.5×105μg/mL儲備液，置于-20 ℃冰箱冷凍儲存。

1.3 原代人結(jié)腸上皮細胞培養(yǎng)[5]取結(jié)腸組織置于無菌培養(yǎng)皿中，加入抗細菌/真菌溶液清洗干凈，將組織剪成1 mm3組織塊。將組織塊放入離心管中，用PBS反復(fù)吹打、洗滌5次。靜置0.5 h，棄去PBS，加入0.1% Ⅳ型膠原酶溶液+0.1% Ⅰ型膠原酶溶液(1∶1)混合消化液，消化0.5 h。消化完畢，用吸管反復(fù)吹打5 min，靜置1 min，將上清移至另一離心管中。重復(fù)上述步驟2～3次，收集上清液，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入培養(yǎng)基吹打，再以1 000 r/min離心5 min，重復(fù)上一步驟5～6次后加入培養(yǎng)液，將細胞密度調(diào)節(jié)至(4～5)×104/mL，直接在培養(yǎng)瓶或板上種植。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2天換1次培養(yǎng)液，并在倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖情況 取對數(shù)生長期的原代人結(jié)腸上皮細胞，胰蛋白酶消化后，將細胞以5×103/孔接種至96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔，37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度青蒿琥酯(0.1、0.2、0.4 mmol/L)和LPS(1 μg/mL)處理細胞，每孔終體積為100 μL。培養(yǎng)24 h后，棄舊培養(yǎng)基，每孔加入含10 μL CCK-8試劑的新鮮培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后置于酶標儀中450 nm處測定吸光度OD值。并計算細胞的相對存活率，根據(jù)相對存活率確定青蒿琥酯的實驗濃度。

1.5 ELISA法檢測細胞上清中IL-6及TNF-α炎癥因子水平 取不同濃度青蒿琥酯(0.1、0.2、0.4 mmol/L)和LPS(1 μg/mL)共培養(yǎng)細胞的上清，收集于Ep管中離心20 min，轉(zhuǎn)速設(shè)定為1 000 r/min，取上清-20 ℃冷凍備用。IL-6及TNF-α水平的檢測按照ELISA試劑盒操作說明書進行。

1.6 Western blot檢測Traf6/p65信號通路活化情況 收集不同濃度青蒿琥酯(0.1、0.2、0.4 mmol/L)和LPS(1 μg/mL)共培養(yǎng)的細胞裂解液，BCA試劑檢測各組蛋白濃度，再加入蛋白上樣緩沖液，于100 ℃加熱煮沸10 min。每孔加入50 μg蛋白上樣，在12%的SDS-PAGE凝膠中電泳分離，濃縮膠電泳分離時電壓設(shè)置為70 V；分離膠電泳時電壓設(shè)置為120 V；分離完成后在275 mA電流轉(zhuǎn)膜60 min；再將NC膜用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；一抗孵育過夜后，在二抗常溫下孵育1 h，洗膜3次，顯色成像。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測細胞增殖情況 青蒿琥酯作用原代人結(jié)腸細胞24 h后，低、中、高劑量藥物對細胞相對存活率的影響與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，結(jié)果見圖1。青蒿琥酯對LPS誘導(dǎo)炎癥引起的細胞增殖情況如圖1所示，LPS誘導(dǎo)組細胞增殖率顯著低于空白對照組(P<0.05)；而經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯處理后，細胞相對存活率顯著高于LPS誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？梢婋S著青蒿琥酯濃度升高，細胞增值率顯著升高，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性影響LPS誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞炎癥導(dǎo)致增殖情況的變化。

2.2 ELISA法檢測IL-6及TNF-α分泌情況 青蒿琥酯作用原代人結(jié)腸細胞24 h后，低、中、高劑量藥物對細胞分泌IL-6及TNF-α的影響如表1所示。LPS誘導(dǎo)組細胞分泌的IL-6及TNF-α水平顯著高于空白對照組(P<0.05)；而經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯處理后，IL-6及TNF-α分泌水平顯著低于LPS誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？梢婋S著青蒿琥酯濃度上升，IL-6及TNF-α分泌水平顯著降低，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性影響LPS誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞炎癥反應(yīng)。

圖1 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞增殖的影響(n=6)注：與空白對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05。 1.空白對照組，2.LPS誘導(dǎo)組，3.LPS+低劑量青蒿琥酯組， 4.LPS+中劑量青蒿琥酯組，5.LPS+高劑量青蒿琥酯組 表1 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞分泌炎癥因子的影響(pg/mL，n=6)

組別IL-6TNF-α空白對照組624±12075±9LPS誘導(dǎo)組1820±340*184±34*LPS+低劑量青蒿琥酯組1260±257#167±25LPS+中劑量青蒿琥酯組1032±224#136±18#LPS+高劑量青蒿琥酯組840±184#106±12#

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05

2.3 Western blot法檢測Traf6/p65信號通路活化情況 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞中Traf6/p65信號通路活化情況的影響如圖2所示。結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)組中Traf6表達水平及p65磷酸化水平顯著高于空白對照組(P<0.05)，說明LPS可誘導(dǎo)Traf6/p65信號通路活化引起炎癥反應(yīng)。經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯作用后，Traf6表達水平及p65磷酸化水平顯著低于LPS誘導(dǎo)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?？梢婋S著青蒿琥酯濃度上升，Traf6表達水平及p65磷酸化水平顯著降低，說明青蒿琥酯呈濃度依賴性地影響LPS誘導(dǎo)人結(jié)腸上皮細胞中Traf6/p65信號通路活化。

3 討論

結(jié)腸炎分為特異性結(jié)腸炎和非特異性結(jié)腸炎，臨床以腹痛、腹瀉、黏液血便、里急后重、大便次數(shù)增多、不成形、糞質(zhì)稀薄遷延不愈超過3周和反復(fù)發(fā)作為特點。目前對結(jié)腸炎治療研究的分子機制較少，但中醫(yī)藥對慢性結(jié)腸炎的治療研究較為多見[6]。因此，本實驗從細胞水平研究了青蒿琥酯對結(jié)腸炎治療的分子機制，以期為后期的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。原代培養(yǎng)人結(jié)腸上皮細胞，采用LPS誘導(dǎo)構(gòu)建細胞炎癥模型[7]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS誘導(dǎo)組細胞增殖率顯著低于空白對照組，并且炎癥因子IL-6及TNF-α分泌水平顯著高于空白對照組，說明細胞炎癥模型構(gòu)建成功。利用低、中、高劑量青蒿琥酯與LPS共同孵育細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度青蒿琥酯均能顯著升高人結(jié)腸上皮細胞的相對存活率，并且降低細胞中炎癥因子IL-6及TNF-α的分泌，說明青蒿琥酯可以改善人結(jié)腸上皮細胞的炎癥反應(yīng)。

圖2 青蒿琥酯對人結(jié)腸上皮細胞Traf6/p65信號通路活化的影響(n=3)

注：與空白對照組比較，*P<0.05;與LPS誘導(dǎo)組比較，#P<0.05。

1.空白對照組，2.LPS誘導(dǎo)組，3.LPS+低劑量青蒿琥酯組，4.LPS+中劑量青蒿琥酯組，5.LPS+高劑量青蒿琥酯組

研究表明，革蘭陰性菌中的脂多糖(LPS)可通過與Toll樣受體4(TLR4)結(jié)合，從而激活多種炎癥通路[8]。NF-κB參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)，可通過調(diào)控炎癥基因的表達及細胞因子的生成來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[9-10]。Traf6銜接蛋白不僅可以傳導(dǎo)膜上TNF受體家族介導(dǎo)的信號，還可以傳導(dǎo)Toll/IL受體家族介導(dǎo)的信號。LPS刺激可引起Traf6的泛素化，與轉(zhuǎn)化生長因子β活化激酶1(TAK1)形成復(fù)合物，進一步激活I(lǐng)KKs，促使NF-κB向細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[11]。實驗發(fā)現(xiàn),LPS刺激人結(jié)腸上皮細胞后，Traf6表達水平及p65磷酸化水平顯著升高，而經(jīng)過低、中、高劑量青蒿琥酯處理細胞后，Traf6表達水平及p65磷酸化水平顯著降低。說明青蒿琥酯可通過抑制Traf6/p65信號通路的活化降低炎癥反應(yīng)的發(fā)生。

綜上所述，青蒿琥酯可通過抑制人結(jié)腸上皮細胞Traf6/p65信號通路的激活，從而抑制細胞炎癥因子的分泌，達到抗炎癥的效果。

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EffectsofartesunateoninflammatoryreactionofLPS-inducedhumancolonepithelialcellsanditsmolecularmechanism

JIANG Shia,ZHANG Xing-qiangb*

(a.Department of Gastroenterology,b.Department of Radiology,Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture,Enshi 445000,China)

ObjectiveTo explore the effects of artesunate on inflammatory reaction of lipopolysaccharide (LPS)-induced human colon epithelial (HCE) cells,and study the potential mechanism of artesunate treatment for HCEC inflammation.MethodsPrimary human colon epithelial cells were culturedinvitro,and HCE cells were divided into five groups,including control group,LPS-induced group,low-dose-,medium-dose-,and high-dose-artesunate groups.The effects of artesunate on the proliferation of HCE cells were observed using CCK-8 assay.ELISA was used to investigate the influence of artesunate on the secretory levels of inflammatory cytokine (IL-6 and TNF-α).Western blot was used to assess the impacts of artesunate on the Traf6/p65 signaling pathway.ResultsArtesunate could significantly improve the inhibitory effect on LPS-induced HCE cells proliferation (P<0.05).Varying concentrations of artesunate could significantly inhibit the secretion of IL-6 and TNF-α in HCE cells,compared with LPS-induced group (P<0.05).Western blot results showed that the expression levels of Traf6 and p-p65 in all artesunate groups were lower than those of LPS-induced group (P<0.05).ConclusionArtesunate can significantly inhibit the inflammatory reaction of HCE cells and its molecular mechanism may involve the down-regulation of activation of Traf6/p65 signaling pathway.

Artesunate;Human colon epithelial cells;Inflammation;Signaling pathway

2017-03-31

恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院a.消化內(nèi)科,b.放射科,湖北 恩施 445000

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711007