人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學研究

周開珩，黃 蕓

人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學研究

周開珩*，黃 蕓

目的研究人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學機制。方法采用PLM腺病毒轉染人參皂苷Rb3灌胃后大鼠的心肌細胞，Western blot檢測不同環(huán)境下人參皂苷Rb3對Ser68表達及細胞外調節(jié)蛋白激酶pERK1/2、凋亡抑制蛋白Survivin、MAPK通路p38，以及凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8表達的影響。結果人參皂苷Rb3在缺氧和低糖環(huán)境下，可降低Ser68磷酸化表達，提升心臟的收縮供血能力，抑制ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2，緩和pERK1/2對心肌細胞凋亡的加速作用。人參皂苷Rb3還可在缺氧環(huán)境下增強凋亡抑制蛋白Survivin的表達。此外，缺氧和低糖環(huán)境下，人參皂苷Rb3可以降低MAPK通路重要蛋白p38的表達，并抑制凋亡蛋白Caspase-3和Caspase-8的表達，改善心肌梗死。結論在缺氧和低糖環(huán)境下，人參皂苷Rb3對心肌梗死具有積極的治療作用。

人參皂苷Rb3；心肌梗死；離子通道調節(jié)蛋白；pERK1/2；凋亡抑制蛋白

0 引言

人參皂苷Rb3(Ginsenoside Rb3，G-Rb3)是從西洋參莖葉中提取的一種單體皂苷，具有改善神經功能缺損、縮小腦內梗死面積、緩解腦水腫的作用，還可以通過抗氧化損傷對各類缺血損傷進行保護[1]。人參皂苷Rb3還具有抗異丙腎上腺素誘導的大鼠急性心肌損傷及抗AngⅡ誘導的大鼠血管平滑肌細胞增殖的藥理作用[2-4]。另外，心肌在缺血再灌注過程的代償變化引起心室重構，嚴重時會導致心力衰竭，人參皂苷Rb3可能通過影響心肌梗死不同階段基質金屬蛋白酶的表達，進而抑制心?、?、Ⅲ型膠原纖維增生，從而對心肌梗死后心室重構有一定的防治作用。本研究主要探討人參皂苷Rb3治療心肌梗死的分子生物學機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠60只，由復旦大學實驗動物中心提供，體重180～220 g，正常飲食。

1.2 藥品與試劑 人參皂苷Rb3，98%純度，白色粉末狀，溶解于氯化鈉注射液中，濾膜濾除菌后使用。

1.3 動物分組、模型制備、給藥方法 60只大鼠隨機平均分成6組?？瞻捉M(Vehicle)：10只，氯化鈉注射液灌胃，PLM腺病毒轉染；缺氧空白組(UN-OD)：10只，空白氯化鈉注射液灌胃，缺氧環(huán)境，PLM腺病毒轉染；低糖空白組(UN-GD)：10只，空白氯化鈉注射液灌胃，低糖環(huán)境，PLM腺病毒轉染；給藥組(G-Rb3)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，PLM腺病毒轉染；缺氧給藥組(G-Rb3-OD)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，缺氧環(huán)境，PLM腺病毒轉染；低糖給藥組(G-Rb3-GD)：10只，人參皂苷Rb3氯化鈉注射液灌胃，低糖環(huán)境，PLM腺病毒轉染。

1.4 大鼠心肌細胞分離、培養(yǎng) 末次給藥后，10只空白組(Vehicle)和10只給藥組(G-Rb3)大鼠腹腔注射肝素鈉1 200 U，15 min后腹腔注射戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，待麻醉后行開胸術，迅速取出心臟，放入無鈣臺氏液中，經主動脈插管，再將心臟連于Langerdoff灌流裝置灌流(37 ℃、95% O2)。先用無鈣臺氏液灌流，10 min后換成含膠原酶Ⅱ(0.5 mg/mL)和牛血清白蛋白(1 mg/mL)的無鈣臺氏液灌流，至心臟膨脹變軟變白即停止灌流，取左心室游離壁心肌組織，充分剪碎、攪拌。將心肌細胞接種在覆蓋有Laminin的玻片上，2 h后更換細胞培養(yǎng)液，去掉不能貼壁的心肌細胞。按上述心肌細胞培養(yǎng)過程，在缺氧(OD)和低葡萄糖(GD)環(huán)境下培養(yǎng)UN-OD、UN-GD、G-Rb3-OD和G-Rb3-GD組大鼠，每組10只。

1.5 PLM腺病毒載體的制備 將全長PLM-cDNA亞克隆至帶有綠色熒光蛋白(GFP)的pAdTrack-CMV載體質粒。PLM-cDNA與pAdTrack-CMV載體質粒有相同的限制性內切酶位點HindⅢ和EcoRⅠ，PCR反應連接酶切產物，轉化感受態(tài)大腸桿菌stb13。將轉化菌在含有氨芐青霉素和瘟菌素的LA平皿中克隆，挑取單菌落擴增，再行限制性內切酶譜分析、PCR擴增和基因測序鑒定。構建成功后，將重組載體(PLM-pAdtract)轉染到心肌細胞中進行后續(xù)實驗。

1.6 Western blot檢測 PLM腺病毒載體轉染72 h后(轉染效率約為30%)，收集心肌細胞，溶解于細胞裂解液中，并提取總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再將凝膠上的蛋白轉印到PVDF膜上；封閉液封閉2 h，一抗孵育過夜(4 ℃)，TBST洗滌10 min，連續(xù)洗滌3次，二抗孵育1 h(室溫)，TBST洗滌10 min，連續(xù)洗滌3次；ECL試劑盒顯色，圖像分析軟件(Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA)定量分析蛋白條帶。

2 結果

2.1 G-Rb3對PLM磷酸化的影響 人參皂苷Rb3對Ser68磷酸化的影響不明顯，空白組與給藥組磷酸化Ser68表達差異不明顯，表達程度與空白組相當。缺氧和低糖環(huán)境下磷酸化Ser68表達較空白組顯著增強，而人參皂苷Rb3給藥后磷酸化Ser68被有效抑制。見圖1。

圖1 G-Rb3對心肌細胞PLM磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05;#與UN組比較，P<0.05

2.2 G-Rb3對ERK1/2磷酸化的影響 磷酸化細胞外調節(jié)蛋白激酶pERK1/2的蛋白質印跡表征以及人參皂苷Rb3對心肌細胞pERK1/2磷酸化的影響如圖2所示，通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯，且與控制組相當。缺氧和低糖環(huán)境下空白組pERK1/2表達增強，而人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達有所降低，其影響效果與磷酸化Ser68相似。

圖2 G-Rb3對心肌細胞ERK1/2磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05;#與UN組比較，P<0.05

2.3 G-Rb3對Survivin磷酸化、p38、Caspase-3和Caspase-8表達的影響 凋亡抑制蛋白Survivin蛋白質印跡表征人參皂苷Rb3對心肌細胞Survivin磷酸化的影響如圖3所示。在正常和低糖環(huán)境中，空白組和人參皂苷Rb3給藥組Survivin幾乎沒有表達，而在缺氧狀態(tài)下Survivin開始表達，人參皂苷Rb3給藥組Survivin表達進一步增強。

P38MAPK是細胞內一種重要的信號酶，參與多種胞內信息傳遞過程，能對廣泛的細胞外刺激發(fā)生反應。人參皂苷Rb3對心肌細胞p38的影響如圖4所示。通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組p38表達差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯，且與空白組相當。缺氧和低糖環(huán)境下空白組p38表達增強，而人參皂苷Rb3給藥組p38表達有所降低。

Caspase-3、Caspase-8作為Caspase家族中2個重要的成員，是細胞凋亡過程中的關鍵因子。Caspase-8參與凋亡執(zhí)行，并誘導Caspase-3的激活，啟動細胞凋亡程序。Caspase-3、Caspase-8在缺氧和低糖環(huán)境下蛋白表達增強，而人參皂苷Rb3給藥組可使其表達降低。見圖5、圖6。

圖3 G-Rb3對心肌細胞Survivin磷酸化的影響注：*與空白組比較，P<0.05

圖4 G-Rb3對心肌細胞p38蛋白表達的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

圖5 G-Rb3對心肌細胞Caspase-3蛋白表達的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

圖6 G-Rb3對心肌細胞Caspase-8蛋白表達的影響注：*與空白組比較，P<0.05；#與UN組比較，P<0.05

3 討論

2000年Sweadner等[5]首次描述了一組離子通道調節(jié)蛋白，該組蛋白因N末端都含有PFXYD序列而命名為FXYD蛋白?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的此類蛋白共有12種，F(xiàn)XYD蛋白主要分布在調節(jié)溶質和體液的組織器官中，如腎臟、腸道、乳腺、胰腺、肝臟，也分布在具有電活動特性的組織器官中，如心肌、骨骼肌、腦。組成FXYD蛋白的氨基酸中至少含有1個絲氨酸或蘇氨酸，表明FXYD蛋白具有潛在的磷酸化位點。Phospholemman(PLM)，即FXYD1，是由72個氨基酸組成的跨膜磷酸蛋白[6]，其膜外N末端含有17個氨基酸，膜內C末端含有35個氨基酸，跨膜片段含有20個氨基酸，而PFXYD序列位于膜外8～12號位上。PLM廣泛分布在心肌細胞膜上，是心肌細胞主要的磷酸化底物，其膜內C末端含有4個磷酸化位點，即62、63、68號位絲氨酸(Ser62/Ser63/Ser68)和69號位蘇氨酸(Thr69)[7]。PLM可以被β腎上腺素受體激動劑磷酸化[8-10]，同時，它可以調節(jié)參與心肌興奮收縮偶聯(lián)的多個離子通道，使得其可能成為治療心臟疾病的一個分子靶點[11-15]，目前人參皂苷Rb3對PLM過表達的研究還未見報道。

本文采用PLM腺病毒轉染人參皂苷Rb3灌胃后大鼠的心肌細胞作為模型[16-17]，用Western blot法檢測不同環(huán)境下人參皂苷Rb3對Ser68、細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK1/2、凋亡抑制蛋白Survivin、MAPK通路p38及凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-8表達的影響狀況。

研究發(fā)現(xiàn)，PLM可與心肌細胞膜上鈉鉀ATP酶(Na+-K+-ATPase,NKA)相連并調節(jié)其動力學特性，表現(xiàn)為：PLM通過降低細胞內Na+與NKA親和力來抑制NKA，使細胞內Na+濃度增加，鈉鈣交換體(Na+/Ca2+exchanger,NCX)前向轉運(Ca2+外流)減弱而逆向轉運(Ca2+內流)增強，從而導致細胞內Ca2+濃度增加，心肌細胞收縮力增強。而Ser68磷酸化可使PLM與NKA分離，從而解除PLM對NKA的抑制作用。

PLM對離子通道的調節(jié)受生理環(huán)境和各種藥物的影響。通常環(huán)境下人參皂苷Rb3影響Ser68磷酸化效果不明顯，空白組與給藥組磷酸化Ser68表達差異不明顯。缺氧和低糖環(huán)境下空白組磷酸化Ser68表達顯著增強，使PLM對NKA的抑制減弱，NKA活性增加，導致細胞內Na+濃度降低，NCX前向轉運(Ca2+外流)增強，細胞內Ca2+濃度減少，心肌細胞收縮力減弱。而人參皂苷Rb3給藥后磷酸化Ser68被有效抑制，可提升心臟的收縮供血能力。

細胞外調節(jié)蛋白激酶ERK1/2是一種重要的細胞凋亡調節(jié)因子。當ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2時，抗凋亡活性蛋白失去ERK1/2的磷酸化激活而活性降低,從而加速凋亡過程的發(fā)生。通常環(huán)境下空白組和人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達差異較小，人參皂苷Rb3在正常環(huán)境下作用不明顯。缺氧和低糖環(huán)境下空白組pERK1/2表達增強，使得心肌細胞加速凋亡。而人參皂苷Rb3給藥組pERK1/2表達有所降低，一定程度上可減緩細胞凋亡，對心肌細胞起到一定保護作用。因此，人參皂苷Rb3是在惡劣的條件下應對心肌壞死的有效藥物。

另一種激素蛋白，凋亡抑制蛋白Survivin，起到和pERK1/2相反的效果。具有非常重要的抗凋亡作用。在正常和低糖環(huán)境中，空白組和人參皂苷Rb3給藥組Survivin幾乎沒有表達，而在缺氧狀態(tài)下Survivin發(fā)揮抗凋亡作用，人參皂苷Rb3給藥組Survivin表達進一步增強，說明人參皂苷Rb3對缺氧引起的心臟病有積極的治療作用。有研究認為，在各種應激因素作用下，p38參與心肌梗死后心肌細胞的凋亡過程。本實驗發(fā)現(xiàn)，在缺氧和低糖狀態(tài)下，p38開始高表達，人參皂苷Rb3給藥組可以抑制其表達水平。另外，在缺氧和低糖狀態(tài)下，Caspase-3和Caspase-8開始高表達，人參皂苷Rb3給藥組可以顯著降低缺氧及低糖誘導的Caspase-3和Caspase-8活性升高。

綜上所述，人參皂苷Rb3在缺氧和低糖環(huán)境下，可降低Ser68磷酸化表達，提升心臟的收縮供血能力；并抑制ERK1/2通過磷酸化形成pERK1/2，緩和pERK1/2對心肌細胞凋亡的加速作用。人參皂苷Rb3還可以在缺氧環(huán)境下增強凋亡抑制蛋白Survivin的表達，顯著抑制缺氧及低糖誘導的p38、Caspase-3和Caspase-8活性升高，保護心肌細胞。以上結果表明，人參皂苷Rb3對心肌梗死具有積極的治療作用。然而，由于條件所限，本研究僅通過Western blot法對結果進行了驗證，方法單一，后續(xù)需進行進一步的驗證。

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MolecularbiologicalmechanismofginsenosideRb3inthetreatmentofmyocardialinfarction

ZHOU Kai-heng1*,HUANG Yun

(Department of Pharmacy,Ningbo City Medical Treatment Center Lihuili Hospital,Ningbo 315040,China)

ObjectiveTo explore the molecular biological mechanism of ginsenoside Rb3 in the treatment of myocardial infarction.MethodsThe cardiac muscle cells from rats with intragastric administration of ginsenoside Rb3 were cultured in different environments and then transfected by PLM-pAdtract.Western blot was used to detect the effects of ginsenoside Rb3 on the expression of Ser68,the extracellular regulated protein kinase pERK1/2,Survivin,p38,Caspase-3 and Caspase-8 in different environments.ResultsGinsenoside Rb3 in the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions could reduce the expression of phosphorylated Ser68,improve cardiac systolic blood capacity,inhibit ERK1/2 phosphorylation into pERK1/2,relax the acceleration of pERK1/2 on myocardial cell apoptosis.Ginsenoside Rb3 could also enhance the expression of apoptosis inhibitory protein Survivin in the oxygen deprivation condition.In addition,in the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions,ginsenoside Rb3 could reduce the expression of the important protein p38 in MAPK pathway,inhibit the expression of apoptotic proteins Caspase-3 and Caspase-8,and improve myocardial infarction.ConclusionIn the oxygen deprivation and glucose deprivation conditions,ginsenoside Rb3 has a positive therapeutic effect on myocardial infarction.

Ginsenoside Rb3;Myocardical infarction;PLM;pERK1/2;Survivin

2017-04-08

寧波醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院藥劑科，浙江 寧波 315040

寧波市醫(yī)學科技計劃(2016A31)

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10.14053/j.cnki.ppcr.201711002