黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用

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(藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都 610052)

黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用

冉琳,何鋼*,梁立,邱露,楊晨,顏軍,茍小軍,劉嵬*

(藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所，四川成都 610052)

目的:以月桂酸4-硝基苯酯為底物,考察黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活性的抑制作用,確定最佳抑制條件、抑制類(lèi)型及抑制常數(shù)。方法:采用水提醇沉的方法制備黑木耳多糖,陰離子交換樹(shù)脂分離多糖,考察不同反應(yīng)條件(濃度、pH、溫度、時(shí)間)下黑木耳多糖各組分對(duì)胰脂肪酶活性的抑制效果;通過(guò)紫外吸收光譜研究黑木耳多糖與胰脂肪酶構(gòu)象之間的關(guān)系;測(cè)定不同濃度底物時(shí)的反應(yīng)吸光度值,初步確定黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶抑制作用的機(jī)理。結(jié)果:分離獲得6個(gè)組分,其中中性多糖組分a對(duì)胰脂肪酶抑制效果較好。當(dāng)pH為7.5、溫度37 ℃、反應(yīng)時(shí)間為60 min時(shí)抑制效果最佳,此時(shí)中性多糖組分a抑制率最高達(dá)到46.93%;反應(yīng)類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,米氏常數(shù)Km為17.68 mg/mL,最大反應(yīng)速率Vmax為1.43 μmol/min,抑制常數(shù)Ki為30.32 mg/mL。通過(guò)紫外吸收光譜測(cè)定,胰脂肪酶最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,說(shuō)明黑木耳多糖改變了胰脂肪酶的構(gòu)象,致使其酶催化活性受到抑制。結(jié)論:黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活性具有抑制作用,表明黑木耳多糖降血脂作用可能與胰脂肪酶的活性抑制有關(guān),為降血脂功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

黑木耳,多糖,胰脂肪酶,抑制作用

肥胖造成血脂異常,脂代謝紊亂，最終引起高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等一系列疾病日益嚴(yán)峻。哺乳動(dòng)物進(jìn)食的脂肪一般會(huì)通過(guò)胰脂肪酶(porcine pancreatic lipase,PPL)水解后消化吸收,胰脂肪酶是脂肪水解過(guò)程的關(guān)鍵酶,可以催化天然底物油脂水解為甘油和脂肪酸[1-2],抑制其活性可以有效抑制脂肪的水解和吸收,從而達(dá)到控制和治療肥胖的作用。

近年來(lái),胰脂肪酶抑制劑已經(jīng)用于肥胖病的臨床治療,如半合成的胰脂肪酶抑制劑類(lèi)藥物Orlistat,但患者服用后易產(chǎn)生腹脹、腹瀉、脂肪性大便等副作用[3-4]。天然無(wú)毒副作用的胰脂肪酶抑制劑是一類(lèi)重要的減肥物質(zhì),已被廣泛關(guān)注。已有研究表明黑木耳具有降血脂、降血糖等功能,多糖是黑木耳的主要功效成分,黑木耳多糖能夠顯著降低高血脂動(dòng)物體內(nèi)的甘油三脂、膽固醇的含量[5-7],但其作用機(jī)理還不清楚。為了進(jìn)一步研究黑木耳多糖降血脂活性的功效關(guān)系及有效防治肥胖問(wèn)題,本文以通江黑木耳為材料,提取分離純化黑木耳多糖,研究黑木耳多糖在不同條件下對(duì)胰脂肪酶活性的影響,通過(guò)紫外吸收光譜研究黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶構(gòu)象變化的影響。并闡述黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活性抑制的作用機(jī)理,對(duì)探討黑木耳多糖降血脂和治療肥胖病的機(jī)理具有重要意義,同時(shí)也為黑木耳多糖降血脂功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料與儀器

黑木耳子實(shí)體產(chǎn)地 四川通江,四川裕德源生態(tài)農(nóng)業(yè)科技有限公司提供;脂肪酶(豬胰) 酶活≥30000U/g,上海金穗生物科技有限公司;月桂酸4-硝基苯酯(4-Nitrophenyl Laurate) 東京化成工業(yè)株式會(huì)社;聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、無(wú)水葡萄糖、95%乙醇、乙酸鈉、濃硫酸、苯酚 均為分析純,成都科龍化學(xué)試劑公司。

陰離子交換柱料(DEAE-Sepharose Fast Flow) 美國(guó)GE Healthcare 公司;FA2004B分析天平 上海越平科學(xué)儀器有限公司;HH-4數(shù)星恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司;A560型雙光束紫外可見(jiàn)光分光光度 計(jì)翱藝儀器(上海)有限公司;YB-1000A型高速多功能粉碎機(jī) 永康市速鋒工貿(mào)有限公司;RT-600酶標(biāo)儀 深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司;GTISRT臺(tái)式離心機(jī)、H1650-W臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司;RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳多糖制備

1.2.1.1 黑木耳粗多糖提取 按照實(shí)驗(yàn)室前期建立的黑木耳多糖提取工藝,將黑木耳子實(shí)體烘干、粉碎2 min,過(guò)16目篩,按料液比1∶40(黑木耳粉末:純水,g/mL)沸水浸提2 h,冷卻后紗布過(guò)濾,10000 r/min離心10 min,取上清,殘?jiān)磸?fù)浸提2次,離心后合并上清,得多糖浸提液,60 ℃濃縮后加入4倍體積95%乙醇過(guò)夜沉淀多糖,10000 r/min離心10 min,收集沉淀,凍干,即得黑木耳粗多糖[8]。

1.2.1.2 黑木耳多糖分離 稱(chēng)取黑木耳多糖凍干粉末100 mg,加入10 mL水,60 ℃水浴溶解2 h,10000 r/min離心5 min,取上清液備用。采用陰離子交換柱(DEAE-Sepharose Fast Flow)靜態(tài)吸附分離黑木耳多糖,多糖溶液倒入柱料攪拌均勻,靜態(tài)吸附1 h后裝柱,棄去未吸附多糖溶液,再分別用蒸餾水及濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.5 mol/L的NaCl溶液各500 mL洗脫得到不同的多糖組分,依次命名為組分a、b、c、d、e、f,洗脫液濃縮至50 mL,透析24 h后,凍干備用。

1.2.2 多糖含量測(cè)定 按照文獻(xiàn)方法[9-10],配制0.4 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖母液,并稀釋成濃度為0.125、0.100、0.075、0.050、0.025 mg/mL的葡萄糖工作液,各取1 mL葡萄糖工作液于試管,再加入5 mL硫酸-苯酚顯色液,沸水浴1 h,冷卻后測(cè)定490 nm吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。分別稱(chēng)取黑木耳多糖樣品組分0.02 g于100 mL容量瓶中,按同樣方法測(cè)定吸光度,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即得待測(cè)樣品濃度。

1.2.3 胰脂肪酶活性的測(cè)定 胰脂肪酶酶活力單位定義為在37 ℃下保溫3 min,每分鐘釋放出1 μmol對(duì)硝基苯酚所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位,U;酶活力(藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川可直接用405 nm處的吸光度值表示。

胰脂肪酶活性的測(cè)定參照Gordon[18]等報(bào)道的方法,并稍加改進(jìn)。在試管中加入pH7.5(0.025 mol/L)的磷酸緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)350 μL、450 μL pNP Laurate底物、樣品溶液50 μL,37 ℃預(yù)熱10 min后加入150 μL胰脂肪酶(0.2 mg/mL),混勻,37 ℃避光反應(yīng)60 min,16000 r/min離心3 min,取上清于405 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度。對(duì)照組用緩沖溶液代替樣品液,每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,按公式(1)計(jì)算抑制率[11-14]。

抑制率(%)=(A1-A2)/A1

式(1)

其中,A1、A2分別為對(duì)照組和不同樣品溶液在405 nm處的吸光度。

1.2.4 不同反應(yīng)條件下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

1.2.4.1 不同濃度的黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 參照1.2.2方法分別測(cè)定黑木耳多糖各分離組分溶液的多糖濃度,并進(jìn)行2倍稀釋法稀釋成6個(gè)濃度梯度。中性多糖組分a濃度為0.25、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 mg/mL;多糖組分b、e濃度為0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.64 mg/mL;多糖組分c、f濃度為0.016、0.032、0.064、0.128、0.256、0.512 mg/mL;多糖組分d濃度為0.022、0.044、0.088、0.176、0.352、0.704 mg/mL。按照1.2.3方法,在各反應(yīng)體系中加入50 μL多糖溶液,于pH7.5,反應(yīng)溫度37 ℃條件下,反應(yīng)60 min,測(cè)定各反應(yīng)溶液的吸光度值,計(jì)算抑制率。以濃度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制抑制曲線(xiàn)。

1.2.4.2 不同pH下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 按1.2.3方法并結(jié)合1.2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以濃度為0.40 mg/mL的中性多糖組分a、0.32 mg/mL組分b、0.256 mg/mL組分c、0.704 mg/mL組分d、0.32 mg/mL組分e、0.256 mg/mL組分f為樣品,各取50 μL分別加入各反應(yīng)體系中,在溫度為37 ℃,pH分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0條件下反應(yīng)時(shí)間60 min,測(cè)定各反應(yīng)溶液的吸光度值,計(jì)算抑制率。以pH為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制抑制曲線(xiàn)。

1.2.4.3 不同反應(yīng)溫度下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 按1.2.3方法并結(jié)合1.2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以濃度為0.40 mg/mL的中性多糖組分a、0.32 mg/mL組分b、0.256 mg/mL組分c、0.704 mg/mL組分d、0.32 mg/mL組分e、0.256 mg/mL組分f為樣品,各取50 μL分別加入各反應(yīng)體系中,在選擇的最佳pH和反應(yīng)時(shí)間條件下,分別在27、32、37、42、47 ℃的條件下反應(yīng)后,測(cè)定各反應(yīng)溶液的吸光度值,計(jì)算抑制率。以溫度為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制抑制曲線(xiàn)。

1.2.4.4 不同反應(yīng)時(shí)間下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 按1.2.3方法并結(jié)合1.2.4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以濃度為0.40 mg/mL的中性多糖組分a、0.32 mg/mL組分b、0.256 mg/mL組分c、0.704 mg/mL組分d、0.32 mg/mL組分e、0.256 mg/mL組分f為樣品,各取50 μL分別加入各反應(yīng)體系中,在選擇的最佳pH條件下,反應(yīng)溫度37 ℃,分別反應(yīng)15、30、45、60、75 min后,測(cè)定各反應(yīng)溶液的吸光度值,計(jì)算抑制率。以時(shí)間為橫坐標(biāo),抑制率為縱坐標(biāo),繪制抑制曲線(xiàn)。

1.2.5 抑制作用類(lèi)型的研究 根據(jù)抑制劑與酶結(jié)合的方式和特點(diǎn)不同,抑制類(lèi)型可分為可逆抑制和不可逆抑制兩種類(lèi)型,可逆性抑制分為競(jìng)爭(zhēng)性、非競(jìng)爭(zhēng)性、反競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

按1.2.3方法及1.2.4.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇最佳胰脂肪酶抑制率的條件(pH7.5,60 min,37 ℃),以0.40 mg/mL的中性黑木耳多糖a為多糖樣品,設(shè)置樣品組與對(duì)照組(不加樣品),測(cè)定在胰酶濃度為0.00、0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL時(shí)的吸光度值,導(dǎo)入Hyper 32軟件求得胰脂肪酶分解脂肪的反應(yīng)速度,以胰脂肪酶質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)作圖,以此推導(dǎo)抑制作用類(lèi)型。

按1.2.3方法及1.2.4.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇最佳胰脂肪酶抑制率的條件,以抑制率最高的多糖組分為例,pNP Laurate底物溶液的質(zhì)量濃度分別為4、8 mg/mL,測(cè)定黑木耳多糖濃度在0.2、0.8、1.6 mg/mL下胰脂肪酶分解底物的吸光度值,將吸光度值導(dǎo)入軟件Hyper 32得反應(yīng)速率,以反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo),以黑木耳多糖濃度為橫坐標(biāo),做Dixon圖,可得出抑制常數(shù)Ki;選擇最佳胰脂肪酶抑制率的條件,以抑制率最高的多糖組分及其最佳濃度為例,改變pNP Laurate底物溶液的質(zhì)量濃度(0、2、4、6、8 mg/mL),測(cè)定不同底物濃度下樣品組與對(duì)照組的吸光度值,將吸光度值及不同的底物濃度導(dǎo)入軟件Hyper32得最大反應(yīng)速率及米氏常數(shù)Km值,按Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法,以底物質(zhì)量濃度的倒數(shù)(1/[S])為橫坐標(biāo),反應(yīng)速率的倒數(shù)(1/v)為縱坐標(biāo),繪制雙倒數(shù)曲線(xiàn)圖。

1.2.6 黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶紫外吸收光譜的影響 取4 mL濃度為0.20 mg/mL的胰脂肪酶溶液,根據(jù)1.2.3方法及1.2.4.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,以0.40 mg/mL的中性黑木耳多糖a為多糖樣品,向胰酶中加入黑木耳多糖0、0.04、0.08、0.16、0.32 mL?；旌暇鶆蚝笥谑覝胤胖?0 min,檢測(cè)200～350 nm的吸光度[14-16]。

1.3數(shù)據(jù)處理

采用Hyper 32及Origin Pro8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1多糖含量測(cè)定

以標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo),490 nm處的吸光度為縱坐標(biāo),通過(guò)回歸處理得線(xiàn)性回歸方程y=4.72x+0.135,R2=0.9992。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

在490 nm處測(cè)得待測(cè)樣品吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y=4.72x+0.135得多糖組分a濃度為0.20 mg/mL,組分b為0.16 mg/mL,組分c為0.13 mg/mL,組分d為0.18 mg/mL,組分e為0.16 mg/mL,組分f為0.13 mg/mL。

2.2不同反應(yīng)條件下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

2.2.1 不同濃度的黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 由圖2可得出,在一定范圍內(nèi),黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制率隨著多糖濃度的增加而增加,當(dāng)濃度達(dá)到一定水平時(shí),抑制率變化不明顯,說(shuō)明此時(shí)兩者結(jié)合達(dá)到飽和。因此多糖組分a的最佳濃度為0.40 mg/mL,組分b的最佳濃度為0.32 mg/mL,組分c的最佳濃度為0.26 mg/mL,組分d的最佳濃度為0.70 mg/mL,組分e的最佳濃度為0.32 mg/mL,組分f的最佳濃度為0.26 mg/mL。

圖2 黑木耳多糖濃度對(duì)胰脂肪酶活性的影響

2.2.2 不同pH下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 pH能改變酶分子活性部位有關(guān)基團(tuán)的解離,在最適pH時(shí),酶分子部位活性基團(tuán)與最適底物結(jié)合,或低或高時(shí)則會(huì)改變酶構(gòu)象,使酶活性喪失。從圖3可知,抑制率隨著pH增大而增大,當(dāng)pH達(dá)到7.5時(shí),抑制率達(dá)到最大值,之后隨著pH增大而減小,因此最適pH為7.5。而人體腸道的pH為4.8～8.2,偏酸或偏堿都會(huì)影響黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制率。因此黑木耳多糖在人體腸道內(nèi)可以通過(guò)抑制機(jī)體內(nèi)胰脂肪酶的活性,減少對(duì)食物中脂類(lèi)物質(zhì)的消化吸收,從而降低肥胖病的風(fēng)險(xiǎn)。

圖3 不同pH下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

2.2.3 不同反應(yīng)溫度下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 溫血?jiǎng)游飦?lái)源的酶最適溫度一般為 35～40 ℃,接近體溫,如高于最適溫度,繼續(xù)提高溫度則會(huì)引起酶分子構(gòu)象改變,致使酶催化活性大幅度下降。由圖4可知,當(dāng)反應(yīng)溫度在27～37 ℃時(shí),抑制率隨著溫度的升高而增大,當(dāng)溫度高于37 ℃時(shí),抑制率逐漸下降。此時(shí)隨著溫度的升高酶分子的構(gòu)象改變,使酶催化活力大幅度下降。因此反應(yīng)的最佳溫度為37 ℃。

圖4 不同反應(yīng)溫度下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

2.2.4 不同反應(yīng)時(shí)間下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用 由圖5可知,黑木耳多糖與胰脂肪酶反應(yīng)初期抑制率增長(zhǎng)幅度較快,隨著反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)而增加。反應(yīng)時(shí)間為60 min 時(shí),抑制率達(dá)到最大,進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)間后,多糖與胰脂肪酶的作用趨于飽和狀態(tài),其抑制率呈下降趨勢(shì)。其中中性多糖組分a抑制率最高達(dá)到46.93%。

圖5 不同反應(yīng)時(shí)間下黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶活力的抑制作用

2.3抑制作用類(lèi)型的測(cè)定

根據(jù)2.2.1的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,中性多糖組分a抑制效果最好,其最佳抑制濃度為0.40 mg/mL。當(dāng)反應(yīng)體系中加入中性多糖組分a時(shí),其速率直線(xiàn)通過(guò)原點(diǎn),如圖6所示,為可逆抑制的作用特點(diǎn)。由此可推斷黑木耳多糖作為可逆性抑制劑抑制胰脂肪酶的活性[17]。

圖6 黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型

圖7 黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶的雙倒數(shù)曲線(xiàn)圖

以1/[S]和1/V進(jìn)行雙倒數(shù)作圖,由圖7的Lineweaver-Burk圖可知,兩直線(xiàn)交于橫軸,為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用的特點(diǎn),因此判斷該反應(yīng)的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制,多糖和底物可以隨機(jī)同胰脂肪酶結(jié)合,不存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[18],通過(guò)軟件Hyper 32得出黑木耳多糖的Vmax為1.43 μmoL/min,Km為17.68 mg/mL;以黑木耳多糖濃度為橫坐標(biāo),1/V為縱坐標(biāo)進(jìn)行Dixon作圖,由圖8所示,兩條直線(xiàn)延長(zhǎng)線(xiàn)的橫坐標(biāo)交點(diǎn)即為Ki值30.32 mg/mL。由此推斷黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制。

圖8 黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶抑制 Dixon 圖

2.4黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶紫外吸收光譜的影響

不同濃度的中性黑木耳多糖a作用于胰脂肪酶的紫外吸收?qǐng)D譜如圖9。由圖可知,胰脂肪酶蛋白質(zhì)分子在 220 nm 左右有一個(gè)強(qiáng)吸收峰,是由于肽鍵的 C=N 的π-π*躍遷引起的,與蛋白質(zhì)的α-螺旋含量有關(guān)。隨著中性多糖組分a含量的增加,最大吸收光譜向右移動(dòng),即發(fā)生紅移,說(shuō)明黑木耳多糖能使胰脂肪酶的構(gòu)象發(fā)生改變,從而抑制酶的活性[19]。

圖9 黑木耳中性多糖對(duì)胰脂肪酶的紫外吸收光譜影響

3 結(jié)論

本文提取并分離純化出黑木耳多糖組分,研究了各多糖組分對(duì)胰脂肪酶活性的影響以及初步探討多糖對(duì)胰脂肪酶的抑制作用機(jī)制。結(jié)果表明黑木耳多糖對(duì)胰脂肪酶具有抑制作用;抑制作用類(lèi)型為非競(jìng)爭(zhēng)性可逆抑制,即黑木耳多糖和底物能隨機(jī)同胰脂肪酶結(jié)合從而抑制胰脂肪酶的活性。紫外吸收光譜分析,發(fā)現(xiàn)最大吸收光譜向右移動(dòng),即發(fā)生紅移,初步推測(cè)黑木耳多糖能使胰脂肪酶的構(gòu)象發(fā)生改變,從而抑制或降低其活性,為黑木耳多糖的降血脂作用機(jī)理補(bǔ)充數(shù)據(jù)。而胰脂肪酶在生物體消化吸收脂肪的過(guò)程中起著非常重要的作用,因此,黑木耳多糖作為胰脂肪酶抑制劑開(kāi)發(fā)為保健食品或者藥品的前景較大,它可通過(guò)影響人體脂肪代謝調(diào)節(jié),從而可能在肥胖、高血脂等領(lǐng)域起到較大作用。

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InhibitoryeffectofAuriculariaauriculapolysaccharidesonpancreaticlipaseactivity

RANLin,HEGang*,LIANGLi,QIULu,YANGChen,YANJun,GOUXiao-jun,LIUWei*

(The Key Laboratory of Medicinal and Edible Plants Resources Development of Sichuan Education Department,Sichuan Industrial Institute of Antibiotics,Chengdu University,Chengdu 610052,China)

Objective:The inhibitory effect ofAuriculariaauriculapolysaccharides on the activity of pancreatic lipase was investigated.4-nitrophenyl laurate was used as a substrate. To screening optimum conditions ofAuriculariaauriculapolysaccharides inhibited of the pancreatic lipaseactivity,the types of inhibition and inhibition of constant. Methods:Auriculariaauriculapolysaccharides were obtained through hot water extraction and alcohol precipitation. Polysaccharides were separated by anion exchange resin. The effects ofAuriculariaauriculapolysaccharides were studied under different conditions(concentrate,pH,temperature,time)on pancreatic lipase activity. The relation betweenAuriculariaauricularpolysaccharides and conformation of pancreatic lipase were researched through ultraviolet absorption spectrometry. The reaction mechanism of betweenAuriculariaauriculapolysaccharides and pancreatic lipase through testing absorbance values was ensured when added different concentrate substrates. Results:Six components were obtained,and the neutral polysaccharide had the best suppression effect. When the pH was 7.5,temperature was 37 ℃,and time was 60 minutes,the inhibition rate reached the maximum value 46.93%. And the reaction was a noncompetitive inhibition. The Michaelis constant was 17.68 mg/mL. The maximum reaction rate was 1.43 μmol/min. The Ki was 30.32 mg/mL. By ultraviolet absorption spectrometry it showed that pancreatic lipase maximum absorption wavelength ultraviolet absorption spectrum redshift,which meant theAuriculariaauriculapolysaccharide changed the conformation of pancreatic lipase,leading to the restriction of enzyme catalytic activity. Conclusion:Auriculariaauriculapolysaccharides had suppression effect on pancreatic lipase activity. It indicated that the antihyperlipidemic effect ofAuriculariaauriculapolysaccharide was related with the inhibiton of the activity of pancreatic lipase,which lay a theoretical foundation for the development of the functional products of reducing blood lipid.

Auriculariaauricula;polysaccharides;pancreatic lipase;inhibition

2017-04-28

冉琳(1995-)，女，碩士研究生，研究方向：多糖生物化學(xué)，E-mail：1783441838@qq.com。

*

劉嵬(1974-)，女，碩士，副研究員，研究方向：多糖生物化學(xué)，E-mail：liuwei@cdu.edu.cn。

何鋼(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：多糖生物化學(xué)，E-mail：hegang@cdu.edu.cn。

四川省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(2015JY0117)；四川省教育廳基礎(chǔ)計(jì)劃項(xiàng)目(17ZA0089)；四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(10Y201501)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)22-0056-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.22.012