食管鱗癌細(xì)胞中LSD1通過與Notch靶基因啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)*

張幸麗，侯桂琴，凡 丞，劉襄艷，高 盼，田 菲，白一汝，趙 琦，魯照明

食管鱗癌細(xì)胞中LSD1通過與Notch靶基因啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)控Notch通路相關(guān)蛋白表達(dá)*

張幸麗，侯桂琴，凡 丞，劉襄艷，高 盼，田 菲，白一汝，趙 琦，魯照明#

食管鱗癌；LSD1；Notch；Hes1

目的：探討食管鱗癌細(xì)胞中LSD1對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制。方法Western blot法檢測(cè)5種食管鱗癌細(xì)胞KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706和TE-1中LSD1及Notch通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。用LSD1抑制劑TCP 處理KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞或用LSD1 siRNA處理Eca109細(xì)胞，Western blot檢測(cè)處理前后細(xì)胞中LSD1、組蛋白H3K4me2和Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果5種食管鱗癌細(xì)胞中均存在LSD1及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，且表達(dá)水平不同；TCP處理后，與未處理組相比，KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞中LSD1的表達(dá)水平均降低，組蛋白H3K4me2表達(dá)升高，Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)均降低(P<0.05)；LSD1 siRNA同樣使Eca109細(xì)胞中LSD1與Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)受到抑制(P<0.05)。結(jié)論食管鱗癌細(xì)胞中LSD1對(duì)Notch信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用，且LSD1可能是通過與Notch靶基因Hes1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合實(shí)現(xiàn)的。

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，根據(jù)其病理學(xué)特征分為食管鱗癌和食管腺癌兩種類型[1]。在中國(guó)常見的是食管鱗癌，其發(fā)病率在河南省最高。其侵襲性強(qiáng)、預(yù)后差、多伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且易復(fù)發(fā)的特點(diǎn)促使人們從分子水平上了解食管鱗癌的發(fā)生機(jī)制，以尋找有效的分子治療靶點(diǎn)。賴氨酸特異性去甲基化酶1(lysine specific demethylase 1，LSD1)是一個(gè)黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶，能夠特異性去除組蛋白H3第4位賴氨酸(H3K4)和第9位賴氨酸(H3K9)上的單雙甲基基團(tuán)[2]。研究[3]表明，LSD1參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等，并且在多種腫瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Notch信號(hào)通路是通過細(xì)胞間相互作用來調(diào)節(jié)生物體生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)十分保守的信號(hào)通路[4]。Notch信號(hào)的產(chǎn)生是通過相鄰細(xì)胞的Notch配體與受體相互作用，Notch蛋白經(jīng)過3次剪切，由胞內(nèi)區(qū)(NICD)釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，形成NICD/CSL轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合體，從而調(diào)控下游Hes1、DTX1等靶蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。Notch的異常表達(dá)常與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡等過程密切相關(guān)[5]。該研究從分子水平探討食管鱗癌中LSD1對(duì)Notch信號(hào)通路的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步了解食管鱗癌發(fā)生的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與材料食管鱗癌細(xì)胞株Eca109、EC9706和TE-1購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，KYSE450、KYSE790由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科李晟磊博士惠贈(zèng)；RPMI 1640培養(yǎng)基與胎牛血清均購(gòu)自以色列BI公司，LSD1抑制劑反苯環(huán)丙胺硫酸鹽(TCP)購(gòu)自美國(guó)Medchemexpress公司，LSD1 siRNA和siRNA-Mate均購(gòu)自上海吉瑪公司，抗體LSD1[普通和染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)級(jí)別]和Hes1均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，Notch3、Notch1、H3K4me2購(gòu)自美國(guó)CST公司，DTX1購(gòu)自美國(guó)GeneTex公司， ChIP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)Millipore公司，real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司，real-time PCR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。內(nèi)參GAPDH引物：上游5’-TACTAGCGGTTTTACGGGCG-3’，下游5’-TCGAA CAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。Hes1基因不同區(qū)域的擴(kuò)增引物共4對(duì)。引物1：上游5’-AGGTCACCCA GAGTCAGGAA-3’，下游5’-CAAGCGTCTTGTTTGAT GTG-3’；引物2：上游5’-CGTGTCTCCTCCTCCCATT-3’，下游5’-GAGAGGTAGACGGGGGATTC-3’；引物3：上游5’-TCAACACAGCACCGGATAAA-3’，下游5’-TCAGCT GGCTCAGACTTTCA-3’；引物4：上游5’-GGCTTTTG GTGGAATTTGAA-3’，下游5’-TCATGGAGGATTGGT GAAAAG-3’。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)食管癌細(xì)胞株均用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3不同處理方式食管鱗癌細(xì)胞中LSD1和Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的Westernblot檢測(cè)收集培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的5種食管鱗癌細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白；并且分別用0、10、50 μmol/L TCP處理KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞48 h，提取細(xì)胞總蛋白和組蛋白，Western blot法檢測(cè)5種食管鱗癌細(xì)胞中LSD1與Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況及TCP對(duì)上述各蛋白及組蛋白的影響。首先將蛋白用SDS-PAGE分離膠分離并濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，將膜用50 g/L脫脂牛奶室溫封閉2 h后，分別與一抗(LSD1、Notch1、DTX1、Hes1 和H3K4me2均按11 000稀釋)或β-actin、H3 內(nèi)參抗體4 ℃孵育過夜，PBST洗滌后再用相應(yīng)的二抗室溫孵育2 h，PBST洗滌后加ECL發(fā)光液孵育1 min，暗室顯影曝光。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行灰度分析。

1.4LSD1siRNA對(duì)Eca109細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Eca109細(xì)胞以1.5×105個(gè)/孔接種至6孔板，培養(yǎng)至融合度達(dá)30%～50%時(shí)，用LSD1 siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，具體步驟如下：將LSD1 siRNA或陰性對(duì)照siRNA溶液加入200 μL無血清培養(yǎng)基中，使其終濃度為150 nmol/L，輕輕混勻后室溫放置5 min，然后加入5 μL siRNA-Mate充分混勻，室溫放置10 min后逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)孔，輕輕混勻后繼續(xù)培養(yǎng)，6 h后熒光拍照，72 h后收集細(xì)胞并提取總蛋白，Western blot檢測(cè)LSD1與Notch3、Notch1、DTX1和Hes1的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5ChIP法檢測(cè)Eca109細(xì)胞中LSD1與Hes1基因啟動(dòng)子結(jié)合情況用100 nmol/L的TCP處理Eca109細(xì)胞，48 h后采用ChIP法檢測(cè)LSD1與Hes1基因啟動(dòng)子結(jié)合情況。主要步驟如下。①用體積分?jǐn)?shù)1%的甲醛溶液對(duì)細(xì)胞中蛋白-DNA進(jìn)行交聯(lián)，然后用SDS裂解緩沖液裂解細(xì)胞。②用細(xì)胞超聲破碎儀超聲斷裂細(xì)胞染色質(zhì)，然后4 ℃離心取上清。③免疫共沉淀。上清中加入蛋白G-瓊脂糖小珠，4 ℃振搖1 h后離心，取體積分?jǐn)?shù)1%蛋白裂解液上清作為對(duì)照，在剩余的上清中分別加入免疫共沉淀抗體，包括陽(yáng)性對(duì)照抗體、陰性對(duì)照抗體和LSD1抗體(ChIP級(jí)別)，4 ℃搖床孵育過夜后，向溶液中加入蛋白G-瓊脂糖小珠以吸附免疫沉淀復(fù)合物，離心去上清，依次用低鹽、高鹽、氯化鋰和TE緩沖液清洗蛋白G-瓊脂糖小珠。④用洗脫緩沖液洗脫免疫沉淀復(fù)合物，同時(shí)在裝有對(duì)照蛋白裂解液的管中加入相同體積的洗脫緩沖液。⑤依次用5 mol/L NaCl、RNase A、0.5 mol/L EDTA、1 mol/L Tis-HCl和蛋白酶K處理上述洗脫緩沖液，以使蛋白-DNA結(jié)合物解交聯(lián)，并用DNA純化柱回收DNA。⑥r(nóng)eal-time PCR分析LSD1蛋白與Notch靶基因Hes1啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。PCR反應(yīng)體系：10 μL Master Mix，上下游引物各1 μL，DNA模板2 μL，用滅菌雙蒸水補(bǔ)足20 μL。用三步法PCR反應(yīng)程序(預(yù)變性：95 ℃ 10 min；PCR反應(yīng)：95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，72 ℃ 10 s，共45個(gè)循環(huán)；溶解：95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s)進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果用ΔΔCt值進(jìn)行相對(duì)定量，分別計(jì)算Eca109細(xì)胞中Hes1基因不同結(jié)合區(qū)域擴(kuò)增片段的富集效率(代表特異性抗體所沉淀的目的蛋白水平)，分析LSD1與Hes1基因啟動(dòng)子不同區(qū)域的結(jié)合情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 21.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間LSD1及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較均采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；陰性對(duì)照組和LSD1 siRNA組LSD1及Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的比較，TCP處理前后Eca109細(xì)胞中Hes1基因不同結(jié)合區(qū)域擴(kuò)增片段的富集效率的比較，均采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 5種食管鱗癌細(xì)胞中LSD1與Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況結(jié)果見圖1。由圖1可以看出，Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白在不同食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)不同，LSD1在5種食管鱗癌細(xì)胞中表達(dá)均較高，尤其在Eca109和EC9706細(xì)胞中表達(dá)最高。

1～5：分別為KYSE450、KYSE790、Eca109、EC9706、TE-1細(xì)胞。圖1 5種食管鱗癌細(xì)胞中LSD1與Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)情況

2.2TCP對(duì)KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞中LSD1、H3K4me2和Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖2、3和表1～4?？芍?，不同濃度TCP處理3種細(xì)胞后，LSD1的表達(dá)均不同程度降低，組蛋白H3K4me2表達(dá)升高，Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白DTX1、Hes1的表達(dá)受到抑制。

1～3：分別為0、10、50 μmol/L TCP處理后細(xì)胞。圖2 TCP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中LSD1與組蛋白H3K4me2表達(dá)的影響

1～3：分別為0、10、50 μmol/L TCP處理后細(xì)胞。圖3 TCP對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

c(TCP)/(μmol·L-1)nKYSE450KYSE790Eca109031．457±0．0811．328±0．1021．278±0．0531030．689±0．140?0．956±0．0310．816±0．0825030．601±0．034?0．631±0．152?0．657±0．093?F13．33734．95412．770P0．006<0．0010．007

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

表3 不同濃度TCP對(duì)KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞中DTX1蛋白表達(dá)的影響

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

表4 不同濃度TCP對(duì)KYSE450、KYSE790和Eca109細(xì)胞中Hes1蛋白表達(dá)的影響

*：與0 μmol/L TCP組比較，P<0.05。

2.3LSD1siRNA對(duì)Eca109細(xì)胞中Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果(圖4、表5)顯示，與陰性對(duì)照組相比，LSD1 siRNA組細(xì)胞中LSD1表達(dá)降低，而Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白Notch3、Notch1、DTX1、Hes1表達(dá)也降低。

1：陰性對(duì)照組；2：LSD1 siRNA組。圖4 LSD1 siRNA對(duì)Eca109細(xì)胞中LSD1與Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別nLSD1Notch3Notch1DTX1Hes1陰性對(duì)照組30．792±0．0151．128±0．0290．672±0．0190．838±0．0120．494±0．017LSD1siRNA組30．061±0．0630．418±0．0880．517±0．0830．551±0．0730．427±0．037t39．45124．0207．0519．6057．001P0．0030．0080．0310．0360．042

2.4LSD1蛋白在Notch靶基因Hes1基因啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合情況引物序列擴(kuò)增片段在Hes1基因的位置見圖5。Eca109細(xì)胞中Hes1基因不同結(jié)合區(qū)域擴(kuò)增片段的富集效率見表6。從表6可以看出，與未處理細(xì)胞相比，TCP處理后細(xì)胞中LSD1蛋白在Hes1基因1和4區(qū)域擴(kuò)增片段的富集效率明顯降低。

TSS：轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。圖5 引物序列擴(kuò)增片段在Hes1基因的位置

c(TCP)/(μmol·L-1)nHes1基因結(jié)合區(qū)域1區(qū)2區(qū)3區(qū)4區(qū)030．011±0．0010．007±0．0010．006±0．0010．014±0．00110030．004±0．0010．008±0．0010．007±0．0130．011±0．001t593．2512．4191．61521．208P<0．0010．1950．2730．010

3 討論

腫瘤的發(fā)生發(fā)展不僅取決于遺傳因素，同時(shí)也受到表觀遺傳修飾如DNA甲基化的影響[6]。現(xiàn)代研究[7]認(rèn)為，組蛋白的甲基化失衡和腫瘤發(fā)生存在著密切聯(lián)系。LSD1是第一個(gè)被確定的組蛋白去甲基化酶，它催化H3K4me1/2和H3K9me1/2的去甲基化[8-9]。LSD1定位于細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的激活和抑制，被譽(yù)為細(xì)胞深處的基因“開關(guān)”，在胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生的過程中起著重要的作用。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞的分化發(fā)育、腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有著重要作用[10-11]。

LSD1與Notch信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生中均起到非常重要的作用，二者是否互相影響、共同調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展，目前此方面的研究報(bào)道甚少。有報(bào)道[6]顯示：在果蠅發(fā)育中SIRT1和LSD1直接相互作用，并在H4K16脫乙?；虷3K4脫甲基化中發(fā)揮保守和協(xié)同作用，以抑制由Notch信號(hào)通路調(diào)節(jié)的基因。在T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病中證實(shí)，組蛋白修飾即LSD1對(duì)組蛋白的去甲基化在Notch1信號(hào)通路中起重要作用[12]。并且LSD1能和其他蛋白形成復(fù)合體，調(diào)節(jié)Notch1信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。另外，與LSD1形成復(fù)合體的蛋白不同，LSD1發(fā)揮的功能也不同，即LSD1在Notch1信號(hào)通路中可能發(fā)揮雙重作用。由于食管鱗癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，尤其是河南省食管鱗癌的發(fā)生率和病死率均很高[13-14]，因此，探討食管鱗癌中LSD1是否對(duì)Notch通路具有調(diào)控作用具有重要意義。該研究結(jié)果顯示：在食管鱗癌細(xì)胞中，用LSD1抑制劑TCP或LSD1 siRNA干預(yù)均能抑制LSD1的表達(dá)，并影響其功能；而LSD1功能受抑制后，Notch信號(hào)通路也受到抑制，表明LSD1可能調(diào)控Notch信號(hào)通路。ChIP結(jié)果顯示，LSD1能與Notch通路靶基因Hes1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合。

綜上所述，在食管鱗癌細(xì)胞中LSD1可能通過與Notch通路靶基因Hes1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，從而調(diào)控Notch通路。

[1] ENZINGER PC,MAYER RJ.Esophageal cancer[J].N Engl J Med,2003,349(23):2241

[2] SHI Y,LAN F,MATSON C,et al.Histone demethylation mediated by the nuclear amine oxidase homolog LSD1[J].Cell,2004,119(7):941

[3] 馬佳萍,韓劍,張金龍.組蛋白去甲基化酶的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2017,15(12):46

[4] KESSLER M,HOFFMANN K,BRINKMANN V,et al.The Notch and Wnt pathways regulate stemness and differentiation in human fallopian tube organoids[J].Nat Commun,2015,6(4):231

[5] GARCIA A,KANDEL JJ.Notch: a key regulator of tumor angiogenesis and metastasis[J].Histol Histopathol,2012,27(2):151

[6] MULLIGAN P,YANG FJ,DI STEFANO L,et al.A SIRT1-LSD1 corepressor complex regulates Notch target gene expression and development[J].Mol Cell,2011,42(5):689

[7] MAIQUES-DIAZ A,SOMERVAILLE TC.LSD1: biologic roles and therapeutic targeting[J].Epigenomics,2016,8(8):1103

[8] HIRANO K,NAMIHIRA M.LSD1 mediates neuronal differentiation of human fetal neural stem cells by controlling the expression of a novel target gene,HEYL[J].Stem Cells,2016,34(7):1872

[9] CHEN Y,KIM J,ZHANG R,et al.Histone demethylase LSD1 promotes adipocyte differentiation through repressing Wnt signaling[J].Cell Chem Biol,2016,23(10):1228

[10]HALES EC,TAUB JW,MATHERLY LH.New insights into Notch1 regulation of the PI3K-AKT-mTOR1 signaling axis:targeted therapy of γ-secretase inhibitor resistant T-cell acute lymphoblastic leukemia[J].Cell Signal,2014,26(1):149

[11]LOPEZ CI,SAUD KE,AGUILAR R,et al.The chromatin modifying complex CoREST/LSD1 negatively regulates notch pathway during cerebral cortex development[J].Dev Neurobiol,2016,76(12):1360

[12]YATIM A,BENNE C,SOBHIAN BA,et al.NOTCH1 nuclear interactome reveals key regulators of its transcriptional activity and oncogenic function[J].Mol Cell,2012,48(3):445

[13]PARKIN DM,PISANI P,FERLAY J.Estimates of the worldwide incidence of 25 major cancers in 1990[J].Int J Cancer,1999,80(6):827

[14]LE BRAS GF,FAROOQ MH,FALK GW,et al.Esophageal cancer:the latest on chemoprevention and state of the art therapies[J].Pharmacol Res,2016,113(Pt A):236

(2016-12-08收稿 責(zé)任編輯姜春霞)

LSD1 regulates expression of related proteins of Notch pathway through combining promotor of target gene of Notch in esophageal squamous cell carcinoma cells

ZHANGXingli,HOUGuiqin,FANCheng,LIUXiangyan,GAOPan,TIANFei,BAIYiru,ZHAOQi,LUZhaoming

CollegeofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

esophageal squamous cell carcinoma;LSD1;Notch;Hes1

Aim: To explore the regulation effects and mechanism of LSD1 on Notch signaling pathway in esophageal squamous cell carcinoma(ESCC) cells.MethodsThe expressions of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins in five ESCC cell lines KYSE450, KYSE790, Eca109, EC9706 and TE-1 were investigated by Western blot. After ESCC cells were treated with TCP or LSD1 siRNA, respectively, the expressions of LSD1, histone H3K4me2 and the related proteins of Notch signaling pathway were detected by Western blot.ResultsThere were different expression levels of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins in five ESCC cell lines. After KYSE450, KYSE790 and Eca109 cells were treated with TCP, the expression of LSD1 was down-regulated while H3K4me2 was up-regulated, and those of Notch signaling pathway-related proteins were decreased(P<0.05). Similarly, LSD1 siRNA also down-regulated the expressions of LSD1 and Notch signaling pathway-related proteins(P<0.05).ConclusionLSD1 could regulate the Notch signaling pathway in ESCC by binding with the Hes1 promoter of Notch target gene.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.003

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者，男，1966 年11月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

R735.1

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助重點(diǎn)項(xiàng)目 81430085；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 162300410122