miR-199a-3p對(duì)Eca109和KYSE450細(xì)胞周期和遷移的影響*

劉襄艷，侯桂琴，高 盼，凡 丞，張幸麗，師瑩瑩，魯照明

miR-199a-3p對(duì)Eca109和KYSE450細(xì)胞周期和遷移的影響*

劉襄艷，侯桂琴，高 盼，凡 丞，張幸麗，師瑩瑩，魯照明#

miR-199a-3p；食管鱗癌；細(xì)胞周期；細(xì)胞遷移；Eca109；KYSE450

目的：觀察miR-199a-3p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期及遷移能力的影響，并探討其分子機(jī)制。方法常規(guī)培養(yǎng)Eca109和KYSE450細(xì)胞，分別轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control(陰性對(duì)照)。采用qRT-PCR法檢測(cè)3組細(xì)胞中miR-199a-3p的表達(dá)水平，并用流式細(xì)胞術(shù)及劃痕實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞遷移能力，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞中mTORC2信號(hào)通路相關(guān)蛋白[mTOR、Rictor、PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)]的表達(dá)。結(jié)果與陰性對(duì)照相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics后，Eca109和KYSE450細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)量增加； G1期細(xì)胞增多，細(xì)胞相對(duì)遷移率降低，mTOR和Rictor蛋白的表達(dá)水平降低，而PI3K、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)蛋白的表達(dá)水平升高(P均<0.05)。結(jié)論miR-199a-3p可能通過(guò)調(diào)控mTORC2信號(hào)通路來(lái)影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞遷移。

microRNA是一類長(zhǎng)度約為22 nt的非編碼RNA(ncRNA)，其分布廣泛且功能幾乎涉及與腫瘤相關(guān)的所有過(guò)程，包括增殖、分化、凋亡、轉(zhuǎn)移、血管生成、 免疫應(yīng)答等[1]。microRNA的作用機(jī)制較為單一，其通過(guò)完全或部分互補(bǔ)的原則結(jié)合到靶基因mRNA 3’端非翻譯區(qū)，以降解或抑制mRNA翻譯的方式調(diào)控靶基因的表達(dá)。microRNA-199a-3p(miR-199a-3p)是眾多microRNA中的一種，已有研究[2-4]觀察了其在肝癌、卵巢癌、骨肉瘤中的作用，但其在食管癌中的研究很少。mTOR是雷帕霉素的靶分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，根據(jù)與其結(jié)合的物質(zhì)不同，在體內(nèi)主要以兩種復(fù)合物的形式存在，即mTORC1和mTORC2。mTOR與Raptor等蛋白構(gòu)成mTORC1，與Rictor等蛋白構(gòu)成mTORC2，不同形式的mTOR產(chǎn)生的生理作用不同[5]。有報(bào)道[2]顯示，miR-199a-3p對(duì)mTOR具有靶向調(diào)控作用，但具體調(diào)控機(jī)制仍不清楚。因此，該研究擬以食管鱗癌細(xì)胞為研究對(duì)象，探討miR-199a-3p對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期和遷移能力的影響，并探討其對(duì)mTORC2信號(hào)通路的影響，為進(jìn)一步探討miR-199a-3p在食管鱗癌發(fā)生中的作用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與主要試劑Eca109細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物所細(xì)胞庫(kù)，KYSE450細(xì)胞由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院惠贈(zèng)。RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自以色列BI公司，細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，抗體PI3K(#13666)、p-Akt(S473)(#4060)、p-Akt(T308)(#13038)、mTOR(#2983)、Rictor(#2114)及GAPDH(#5174)均購(gòu)自美國(guó)CST公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司，轉(zhuǎn)染試劑siRNA-MateTM購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司，miR-199a-3p mimics序列、miR-199a-3p mimics negative control序列以及U6內(nèi)參引物序列也由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染Eca109和KYSE450細(xì)胞加入含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Eca109和KYSE450細(xì)胞分別接種于6孔板(5×105個(gè)/孔)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到30%～50%時(shí)，按照siRNA-MateTM說(shuō)明書轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics或miR-199a-3p mimics negative control(陰性對(duì)照)，并于轉(zhuǎn)染6 h后在熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照。

1.3qRT-PCR分別提取轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics、miR-199a-3p mimics negative control 48 h及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。miR-199a-3p引物序列為上游5’-GCCGAACAGTAGTCTGCACAT-3’，下游5’-TATGGTTTTGACGACTGTGTGAT-3’；U6引物序列為上游5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中SYBR?Premix Ex Taq?(TliRNaseH Plus)10 μL，上、下游引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 6.4 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃ 5 s，62 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。按2-ΔΔCt計(jì)算miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞周期檢測(cè)收集轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 48 h的Eca109和KYSE450細(xì)胞，用PBS洗2遍后加入體積分?jǐn)?shù)70%預(yù)冷乙醇固定，混勻后4 ℃保存至少24 h。測(cè)定前1 000 r/min離心5 min以除去固定液，用PBS洗3遍后重懸細(xì)胞并加入適量RNaseA，37 ℃水浴30 min，之后加入適量的PI染液，混勻，4 ℃避光30 min。最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)G1期、S期、G2期細(xì)胞比例。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5劃痕實(shí)驗(yàn)收集轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 24 h的Eca109和KYSE450細(xì)胞，分別用10 μL的槍頭垂直劃痕；棄去培養(yǎng)基，并用PBS洗3遍，之后加入無(wú)血清培養(yǎng)基，分別于0、24 h置于倒置顯微鏡下拍照，并記錄劃痕寬度。應(yīng)用Image J圖像處理軟件對(duì)劃痕寬度進(jìn)行分析，以陰性對(duì)照組作為標(biāo)準(zhǔn)控制組，計(jì)算相對(duì)遷移率。遷移距離=0 h寬度-24 h寬度；相對(duì)遷移率(%)=遷移距離/陰性對(duì)照組平均遷移距離×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Westernblot收集轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics及miR-199a-3p mimics negative control 48 h及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Eca109和KYSE450細(xì)胞并分別提取總蛋白，Western blot檢測(cè)mTORC2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平。蛋白上樣量為20 μg。mTOR、Rictor、 PI3K、p-Akt(T308)、p-Akt(S473)和GAPDH一抗的稀釋比例均為11 000，二抗的稀釋比例均為110 000。電泳后用濕轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上，轉(zhuǎn)膜條件為300 mA，2 h；將NC膜用50 g/L脫脂牛奶封閉，置于搖床上輕搖2 h；加一抗4 ℃過(guò)夜；PBS洗3遍，加入二抗置于搖床上輕搖2 h；PBS洗3遍后將ECL發(fā)光液加在NC膜上，于暗室進(jìn)行曝光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析。以目的蛋白與GAPDH灰度值的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用單因素方差分析比較未轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics組食管癌細(xì)胞miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量及mTORC2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的差異，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)比較陰性對(duì)照組及轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics組食管癌細(xì)胞周期分布和相對(duì)遷移率的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染miR-199a-3pmimics對(duì)食管鱗癌細(xì)胞中miR-199a-3p表達(dá)的影響Eca109和KYSE450細(xì)胞在轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics及其陰性對(duì)照6 h后，在熒光顯微鏡下均可看到較強(qiáng)的綠色熒光；轉(zhuǎn)染48 h后qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與其他2組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics組中miR-199a-3p的表達(dá)升高，而陰性對(duì)照組則沒(méi)有明顯變化，見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中miR-199a-3p的相對(duì)表達(dá)量(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.001。

2.2轉(zhuǎn)染miR-199a-3pmimics對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，與陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics 的Eca109和KYSE450細(xì)胞中G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低，見(jiàn)表2、3。

表2 Eca109不同分組細(xì)胞周期分布情況(n=3) %

表3 KYSE450不同分組細(xì)胞周期分布情況(n=3) %

2.3轉(zhuǎn)染miR-199a-3pmimics對(duì)食管鱗癌細(xì)胞遷移能力的影響Eca109和KYSE450細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics的細(xì)胞相對(duì)遷移率低于陰性對(duì)照組，見(jiàn)表4。

表4 各組細(xì)胞的相對(duì)遷移率(n=3) %

2.4轉(zhuǎn)染miR-199a-3pmimics對(duì)食管鱗癌細(xì)胞mTORC2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Western blot結(jié)果證實(shí)，與未轉(zhuǎn)染組及陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-199a-3p mimics的Eca109和KYSE450細(xì)胞中mTOR和Rictor蛋白的表達(dá)水平降低，而p-Akt(T308)、p-Akt(S473)和PI3K的表達(dá)水平升高(圖1，表5、6)。

上圖：Eca109；下圖：KYSE450。圖1 miR-199a-3p mimics轉(zhuǎn)染對(duì)Eca109和KYSE450細(xì)胞mTORC2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

組別mTORRictorp?Akt(S473)PI3Kp?Akt(T308)未轉(zhuǎn)染組0．763±0．0120．923±0．0490．807±0．0290．673±0．0740．620±0．160陰性對(duì)照組0．783±0．0210．927±0．1000．850±0．0440．693±0．0960．850±0．137轉(zhuǎn)染miR?199a?3pmimics組0．613±0．025?0．390±0．072?1．067±0．076?1．103±0．083?1．147±0．110?F64．75048．60620．62624．54211．098P<0．001<0．0010．0020．0010．010

*：與其他2組比較，P<0.01。

表6 KYSE450各組細(xì)胞中相關(guān)蛋白表達(dá)的比較(n=3)

*：與其他2組比較，P<0.05。

3 討論

研究[6-7]發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物基因組中，只有不到2%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有蛋白編碼功能，其余98%均為ncRNA，其中microRNA是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶剪切加工而得到的長(zhǎng)度較短的一類ncRNA。近幾年的功能學(xué)研究[8]表明，microRNA既可以作為促癌基因參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，也可作為抑癌基因控制惡性腫瘤的形成。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)miR-199a-3p可以調(diào)節(jié)體細(xì)胞的細(xì)胞重構(gòu)，其過(guò)表達(dá)可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制細(xì)胞的增殖。此外,肝癌中miR-199a-3p不僅可以影響細(xì)胞周期進(jìn)程，而且可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的侵襲能力[2]。作者的研究結(jié)果也證實(shí)，在兩種食管鱗癌細(xì)胞中miR-199a-3p過(guò)表達(dá)均可影響食管鱗癌細(xì)胞的周期進(jìn)程，并將細(xì)胞阻滯于G1期，同時(shí)對(duì)細(xì)胞遷移也有明顯的抑制作用。

研究[10]發(fā)現(xiàn)，與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的多種生理過(guò)程如細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞遷移等都受到mTOR信號(hào)通路的調(diào)控，許多腫瘤都伴有mTOR信號(hào)通路的異常。其中mTORC2信號(hào)通路可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞的遷移能力[11-12]。Fornari等[2]在肝癌中證實(shí)miR-199a-3p對(duì)mTOR具有靶向調(diào)節(jié)作用，但其對(duì)mTORC2信號(hào)通路具體的調(diào)節(jié)作用還不清楚。該研究結(jié)果證實(shí)，miR-199a-3p能抑制mTORC2信號(hào)通路中mTOR和Rictor蛋白的表達(dá)，因此在食管鱗癌中miR-199a-3p或許可以通過(guò)調(diào)節(jié)mTORC2信號(hào)通路進(jìn)而影響食管鱗癌細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞遷移能力。但是在實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，miR-199a-3p促進(jìn)了PI3K、p-Akt(S473)和p-Akt(T308)蛋白的表達(dá)，這可能因?yàn)閙iR-199a-3p在對(duì)mTORC2調(diào)控的同時(shí)使PI3K-Akt信號(hào)通路負(fù)反饋激活，而Akt的激活會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的存活、增殖和生長(zhǎng)，這一點(diǎn)與mTOR抑制劑對(duì)Akt產(chǎn)生的負(fù)反饋?zhàn)饔妙愃?，也因此可能?dǎo)致癌細(xì)胞對(duì)mTOR抑制劑產(chǎn)生耐藥性，這也是mTOR抑制劑用于臨床治療腫瘤時(shí)出現(xiàn)的一個(gè)違背人們意愿的結(jié)果[13-14]。miR-199a-3p對(duì)Akt的激活或許會(huì)減弱其對(duì)食管鱗癌細(xì)胞周期和遷移的作用，若能與Akt通路抑制劑聯(lián)用或許會(huì)有更好的效果，作者在這方面的研究正在進(jìn)行中。該研究探討了miR-199a-3p在食管鱗癌細(xì)胞中的作用及作用機(jī)制，為進(jìn)一步探討食管鱗癌分子發(fā)生發(fā)展機(jī)制及尋找分子治療靶點(diǎn)和治療方法提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

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(2016-12-03收稿 責(zé)任編輯徐春燕)

Effects of miR-199a-3p on cell cycle and migration of Eca109 and KYSE450 cells

LIUXiangyan,HOUGuiqin,GAOPan,FANCheng,ZHANGXingli,SHIYingying,LUZhaoming

SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001

miR-199a-3p; esophageal squamous cell carcinoma; cell cycle; cell migration；Eca109；KYSE450

Aim: To study the effects and molecular mechanism of miR-199a-3p on cell cycle and migration in esophageal squamous cell carcinoma.MethodsmiR-199a-3p mimics and miR-199a-3p mimics negative control were transfected into Eca109 and KYSE450 cells,and the expression level of miR-199a-3p in cells was detected by qRT-PCR.The cell cycle and migration were investigated by flow cytometry and wound healing assay, and the mTORC2 signaling pathway-related proteins such as mTOR,Rictor,PI3K,p-Akt(T308), and p-Akt(S473) were detected by Western blot.ResultsThe expression of miR-199a-3p was significantly increased in two cell lines after transfected with miR-199a-3p mimics(P<0.001). The results of cell cycle and wound healing assay showed that in cells transfected with miR-199a-3p mimics,the percentage of G1 phase cells was higher and the rate of cell migration was lower compared with those transfected with miR-199a-3p mimics negative control(P<0.05).Western blot results confirmed that the expression levels of mTOR and Rictor were obviously reduced, while those of PI3K,p-Akt(T308) and p-Akt(S473) were obviously increased in cells transfected with miR-199a-3p mimics than those transfected with miR-199a-3p mimics negative control(P<0.05).ConclusionmiR-199a-3p may affect the cell cycle and migration of esophageal squamous cell carcinoma cells through regulating the mTORC2 signaling pathway.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.06.002

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目 30901778;河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目 162300410122

鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州 450001

#通信作者，男，1966年11月生，博士，副教授，研究方向：腫瘤細(xì)胞分子生物學(xué)，E-mail:lzm310@zzu.edu.cn

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