陽極化納米管鈦加載慶大霉素抑制細(xì)菌生長及促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性研究

劉登輝，何崇儒，張 瑜，戰(zhàn) 策，劉忠堂

（1第113醫(yī)院骨科，浙江寧波315040；第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院：2關(guān)節(jié)骨病外科，3放射科，上海200433）

陽極化納米管鈦加載慶大霉素抑制細(xì)菌生長及促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性研究

劉登輝1，何崇儒2，張 瑜3，戰(zhàn) 策2，劉忠堂2

（1第113醫(yī)院骨科，浙江寧波315040；第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長海醫(yī)院：2關(guān)節(jié)骨病外科，3放射科，上海200433）

目的：研究陽極化納米管鈦加載慶大霉素能否抑制細(xì)菌生長，促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性．方法：陽極氧化法獲得陽極化納米管鈦（ANTTi）．共沉淀法在ANTTi表面加載慶大霉素（ANTTi-G），測定慶大霉素的釋放曲線．瓊脂平板抑菌實(shí)驗(yàn)檢測ANTTi-G的抑菌能力．通過檢測成骨細(xì)胞在材料表面的黏附、總蛋白含量、增殖、ALP活性及鈣結(jié)節(jié)來監(jiān)測ANTTi-G對成骨細(xì)胞活性的影響．結(jié)果：共沉淀法加載的抗生素隨著時間的延長逐漸釋放．ANTTi-G及Ti-G抑菌效果明顯強(qiáng)于ANTTi及Ti組．第7天時，ANTTi-G及ANTTi組成骨細(xì)胞的黏附、增殖、總蛋白含量、ALP 活性明顯高于 Ti及 Ti-G 組（P＜0．05）．第14天時，ANTTi-G及ANTTi組成骨細(xì)胞的黏附、總蛋白含量、ALP活性明顯高于Ti及 Ti-G 組（P＜0．05）．結(jié)論：與傳統(tǒng)的Ti或者ANTTi相比，ANTTi-G有更好的抑菌效果．同樣，與Ti或Ti-G相比，ANTTi-G與成骨細(xì)胞的的生物相容性更好．關(guān)節(jié)置換中，ANTTi-G可以作為一種潛在的預(yù)防局部感染的新材料應(yīng)用于臨床．

陽極化納米管鈦；慶大霉素；感染；無菌性松動；關(guān)節(jié)置換

0 引言

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是引起慢性關(guān)節(jié)疼痛和功能障礙的最常見病因［1-2］．全髖關(guān)節(jié)置換和全膝關(guān)節(jié)置換是治療晚期骨關(guān)節(jié)炎最行之有效的方法之一［3］．然而感染及無菌性松動是導(dǎo)致關(guān)節(jié)置換手術(shù)失敗的兩個最主要的原因［4］，關(guān)節(jié)置換的假體與周圍骨組織的生物相容性不佳及應(yīng)力遮擋是導(dǎo)致無菌性松動的主要原因．一旦關(guān)節(jié)置換發(fā)生感染或者無菌性松動，移植物的取出翻修是治療的主要方法，其手術(shù)費(fèi)用是初次置換的2～3倍［5］．因此提高移植物與骨組織的生物相容性及預(yù)防感染尤為重要．

鈦及鈦合金由于擁有良好的生物力學(xué)特性及生物相容性而被作為醫(yī)學(xué)材料得到廣泛應(yīng)用．鈦及鈦合金經(jīng)過納米技術(shù)處理后，進(jìn)一步強(qiáng)化了其生物相容性，并且能作為良好的載藥平臺，通過共沉淀的方法也能延長抗生素的釋放［6］．本研究的目的是通過共沉淀的方法在陽極化納米管鈦（anodized nanotubular titanium， ANTTi）上加載慶大霉素（ANTTi-gentamicin，ANTTi-G），通過體外實(shí)驗(yàn)研究證明ANTTi-G能否抑制細(xì)菌生長，促進(jìn)新骨形成．

1 材料和方法

1．1 陽極化納米管鈦的制備 實(shí)驗(yàn)中使用兩種移植材料：純鈦及ANTTi，兩種材料均由上海交通大學(xué)提供［7］．制備的ANTTi的實(shí)驗(yàn)條件：在電化學(xué)陽極氧化法制備ANTTi之前，用超聲在丙酮溶液中清洗99．5%的純鈦（1 cm×1 cm），以清除純鈦表面的油污．電化學(xué)陽極化法：Ti為陽極，Pt為陰極，0．09 M NH4F 的乙二醇／水（醇水比為 9 ∶1）作為電解液［7］，60 V 電壓下持續(xù)氧化30 min，獲得陽極化納米管鈦．采用掃面電子顯微鏡（scanning electronic microscopy，SEM）掃描分析ANTTi的表征．

1．2 共沉淀法加載慶大霉素及實(shí)驗(yàn)分組 10 mg／mL的硫酸慶大霉素（生工科技，A100304-0001）采用共沉淀的方法加載在兩種材料表面，材料與10 mg／mL的硫酸慶大霉素共同浸潤在1．5×的模擬體液中（simulated body fluid， SBF， 將 11．994 g NaCl， 0．525 g NaHCO3， 0．336 g KCl， 0．342 g K2HPO4·3H2O，0．458 g MgCl2·6H2O， 0．417 g 50CaCl2， 0．107 g Na2SO4及 9．086 g （CH2OH）3CNH2加入至1000 mL 雙蒸水中，pH 7．25），浸 潤時 間 為 3 d．實(shí) 驗(yàn) 分組：純 鈦（Titanium， Ti），純鈦加載慶大霉素（Ti-G），ANTTi，陽極化納米管鈦加載慶大霉素（ANTTi-G）．采用SEM分析ANTTi-G及ANTTi-G釋放抗生素8 d后的表面表征．

1．3 ANTTi-G及Ti-G的慶大霉素釋放曲線測定將每個樣本置于15 mL離心管內(nèi)，加入7 mL PBS，37℃培養(yǎng)．1 h， 2 h，4 h，8 h，12 h，和24 h，48 h，72 h，8 d后，溶液渦旋搖動，取 20 μL 樣本，加 180 μL PBS．樣本-20℃儲存，用高效液相色譜法測定慶大霉素濃度．

1．4 細(xì)菌培養(yǎng)及細(xì)菌瓊脂平板實(shí)驗(yàn) 本研究選用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923），將凍存金黃色葡萄球菌細(xì)菌株用新鮮培養(yǎng)基復(fù)蘇后，細(xì)菌在瓊脂平板上培養(yǎng)3 d，然后接種到胰酶大豆肉湯中．在細(xì)菌接種前1天，應(yīng)用消毒的10 μL接種環(huán)從平板上取回細(xì)菌，接種到含3 mL胰酶大豆肉湯離心管中，過夜培養(yǎng)．取100 μL懸液轉(zhuǎn)移至3 mL的無菌離心管中，在37℃搖床中培育16 h．用胰酶大豆肉湯進(jìn)一步稀釋到最終濃度109個細(xì)菌／mL．將實(shí)驗(yàn)菌均勻接種于瓊脂培養(yǎng)基表面，分別將四組材料置于金黃色葡萄球菌的瓊脂平板上，37℃恒溫箱孵育24 h，通過判斷抑菌圈直徑（mm）來分析慶大霉素的抗菌活性．

1．5 成骨細(xì)胞培養(yǎng) 中國科學(xué)院細(xì)胞庫獲取MC3T3-E1細(xì)胞株，在含10%胎牛血清（Gibico）的α-MEM培養(yǎng)基 （Hyclone），100 U／mL 青霉素和100 μg／mL鏈霉素（Invitrogen） 5%CO2于孵育箱內(nèi)37℃條件下培養(yǎng)．2～3 d更換培養(yǎng)液，采用胰蛋白酶消化法進(jìn)行細(xì)胞傳代．

1．6 成骨細(xì)胞粘附和增殖 研究MC3T3-E1對Ti、Ti-G、ANTTi和ANTTi-G反應(yīng)．四組材料置于培養(yǎng)皿中，紫外線照射1 h．隨后將4組材料置于12孔板中，12孔板中加入的細(xì)胞濃度為500 000／孔．2～3 d換液一次，培養(yǎng)第7天，通過DAPI核染和纖黏蛋白免疫熒光的方法研究成骨細(xì)胞在四組材料表面的粘附情況．第3、7天通過CCK-8法檢測成骨細(xì)胞增殖情況（C0038碧云天），具體實(shí)驗(yàn)步驟見產(chǎn)品說明書．

1．7 細(xì)胞內(nèi)總蛋白質(zhì)含量、堿性磷酸酶活性測定及茜素紅染色 為了釋放細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)的4循環(huán)凍融法在去離子水中將樣本上的粘附細(xì)胞溶解．用BCA（Bicinchoninic酸化驗(yàn)）含量測定試劑盒測定總蛋白質(zhì)含量（P0012碧云天）．用4循環(huán)凍融方法獲得裂解液，用比色測定法測定ALP活性（A059-1南京建成），用分光光度計(jì)在波長590 nm測定溶液的吸光度．對培養(yǎng)14 d后的MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行茜素紅試劑盒染色 （HL80046．3上海哈靈生物科技有限公司）．具體實(shí)驗(yàn)步驟見產(chǎn)品說明書．

1．8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16．0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析．經(jīng)檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計(jì)數(shù)資料用±s表示．4組成骨細(xì)胞的增殖、總蛋白含量、ALP活性均采用單因素方差分析，組間對比采用LSD-t檢驗(yàn)．P＜0．05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義．

2 結(jié)果

2．1 陽極化納米管鈦的表征 通過掃面電鏡掃描ANTTi，ANTTi-G及ANTTi-G釋放完抗生素后獲取SEM圖．將純鈦陽極化氧化法處理完后，可以看到獨(dú)立生長整齊的納米管，其內(nèi)徑為125～131 nm，外徑約為 170 nm（圖 1A），管長在 1．5 μm 左右（圖 1B）．采用共沉淀法加載慶大霉素后，ANTTi表面納米管基本被覆蓋，幾乎看不出納米管的存在（圖1C），當(dāng)釋放慶大霉素8 d后，可以看出材料表面仍然存有抗生素，且可以看到納米管的存在（圖1D）．

2．2 載慶大霉素TiO2納米管覆層藥物緩釋曲線通過共沉淀法加載慶大霉素后，對慶大霉素的釋放進(jìn)行檢測，可知ANTTi-G及Ti-G加載的慶大霉素均隨時間的延長逐漸釋放，而非爆發(fā)式釋放．隨著釋放時間的延長，慶大霉素的濃度逐漸降低．此外，在1～192 h期間，ANTTi-G的慶大霉素釋放的濃度均高于 Ti-G（表1）．

圖1 ANTTi，ANTTi-G及ANTTi-G釋放抗生素8 d后的表征

表1 ANTTi-G及Ti-G加載的慶大霉素在不同時間釋放的慶大霉素的濃度 （mg／L）

2．3 細(xì)菌瓊脂平板抑菌實(shí)驗(yàn) 通過瓊脂平板抑菌實(shí)驗(yàn)檢測四組材料的抑菌效果，ANTTi-G及Ti-G均能抑制細(xì)菌生長，在24 h抑菌效果明顯，且ANTTi-G抑制細(xì)菌生長的效果比Ti-G強(qiáng)，而ANTTi及Ti均不能抑制細(xì)菌的生長（圖2）．

圖2 細(xì)菌瓊脂平板抑菌實(shí)驗(yàn)

2．4 成骨細(xì)胞的活性研究 通過免疫熒光觀察7 d后的成骨細(xì)胞黏附（圖3）．由圖可知，黏附于ANTTi及ANTTi-G的成骨細(xì)胞均多于 Ti及 Ti-G組，而ANTTi與ANTTi-G的細(xì)胞黏附無明顯差異，Ti及Ti-G組的細(xì)胞黏附也無明顯差異．第7天和第14天分別檢測總蛋白含量（表 2），第 7天時，ANTTi，ANTTi-G組的總蛋白含量明顯高于 Ti，Ti-G 組（P＜0．05，圖4A）；第14天時，ANTTi，ANTTi-G組的總蛋白含量明顯高于 Ti，Ti-G 組（P＜0．05，圖 4A）．第 3 天及第 7 天通過CCK-8檢測成骨細(xì)胞的增殖（表2），第3天時，Ti、Ti-G、ANTTi、ANTTi-G 的 OD 值比較，四組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0．618，圖 4B）；第 7 天時，ANTTi，ANTTi-G組的 CCK-8值明顯高于 Ti，Ti-G組（P＜0．05，圖4B）．第7天和第14天分別檢測 ALP活性（表2），第 7天時，ANTTi，ANTTi-G 組的活性值明顯高于 Ti，Ti-G 組（P＜0．05，圖 4C）；第 14 天時，ANTTi，ANTTi-G組的ALP活性值明顯高于Ti，Ti-G組（P＜0．05，圖4C）．第14天時，通過茜素紅染色的方法分析四組材料對成骨分化的影響，結(jié)果提示ANTTi及ANTTi-G鈣結(jié)節(jié)明顯多于Ti及Ti-G組，表明ANTTi及ANTTi-G的成骨分化能力強(qiáng)于Ti及Ti-G組（圖5）．

圖3 MC3T3-E1成骨細(xì)胞第7天時在四組材料表面黏附的DAPI核染和纖黏蛋白免疫熒光代表圖

表2 Ti、Ti-G、ANTTi、ANTTi-G 在不同時間成骨細(xì)胞增殖、ALP活性及總蛋白含量值 （mg／L）

圖4 MC3T3-E1成骨細(xì)胞總蛋白含量、增殖及ALP活性檢測

圖5 MC3T3-E1成骨細(xì)胞14天時茜素紅染色的代表圖（圖中紅色結(jié)節(jié)為紅染的鈣結(jié)節(jié)）

3 討論

感染和無菌性松動是關(guān)節(jié)置換手術(shù)失敗的兩大重要原因．術(shù)后6 h是植入物最容易感染的時期，該時間段是預(yù)防細(xì)菌粘附到植入物表面至關(guān)重要的時間窗［8］．關(guān)節(jié)置換手術(shù)過程中，雖然手術(shù)過程中采用如超凈手術(shù)間、標(biāo)準(zhǔn)化的手術(shù)技術(shù)、縮短手術(shù)時間、術(shù)前預(yù)防性使用抗生素等策略用來預(yù)防感染［9-10］，但是感染在關(guān)節(jié)置換中仍然不可避免，并且嚴(yán)重影響了人工關(guān)節(jié)置換的預(yù)后．系統(tǒng)性應(yīng)用抗生素是以往預(yù)防和治療感染的主要方式，同樣也存在很多副作用，比如肝毒性、腎毒性及由于手術(shù)過程中破壞了手術(shù)部位的血供，導(dǎo)致其不能滲透至手術(shù)部位，不能達(dá)到抗感染的目［11-12］．細(xì)菌的初始粘附是細(xì)菌形成生物膜的重要過程，最終能導(dǎo)致局部感染．局部應(yīng)用抗生素能維持局部高濃度的抗生素，抑制細(xì)菌的初始粘附，且無系統(tǒng)毒性［13］．鈦和鈦合金因其良好的生物相容性和生物力學(xué)特性被廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)，納米技術(shù)的發(fā)展更是促進(jìn)了鈦和鈦合金作為載藥平臺在臨床中的應(yīng)用．金黃色葡萄球菌是骨科及關(guān)節(jié)置換手術(shù)術(shù)后感染最常見的細(xì)菌［14］，該細(xì)菌對皮膚和骨骼有高親和性，誘導(dǎo)骨質(zhì)吸收和骨壞死［15］，故本研究中選用金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）．慶大霉素為氨基糖苷類抗生素，對多種細(xì)菌敏感，具有良好的熱穩(wěn)定性，并且該實(shí)驗(yàn)中的金黃色葡萄球菌菌株對慶大霉素敏感［16-17］．因此，在本研究中，使用共沉淀的方法將慶大霉素加載至陽極化的納米管鈦表面來探討其促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物活性以及抑制細(xì)菌生長的能力．

本研究的結(jié)果顯示，采用電化學(xué)陽極化法獲得的鈦納米結(jié)構(gòu)規(guī)整，納米管徑及管長均適合成骨細(xì)胞生長．Popat等［18］采用凍干法在陽極化的納米管鈦上加載抗生素，150 min后基本上完全釋放完畢，并不能達(dá)到6 h以上，植入物仍然存在很大的感染風(fēng)險．共沉淀方法加載抗生素后釋放曲線顯示抗生素逐漸釋放，雖然在192 h后慶大霉素并沒有完全從材料中釋放出來，但是陽極化納米管鈦及純鈦在加載抗生素192 h后抗生素的濃度分別為 39．9 mg／L 和 32．6 mg／L，其濃度遠(yuǎn)高于最低抑菌濃度（各細(xì)菌的最低抑菌濃度［19］為 ATCC 35984：16 μg／mL，S．a(chǎn)ureus 376：8 μg／mL，S．epidermidis 389：0．125 μg／mL）．細(xì)菌瓊脂平板抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANTTi-G及Ti-G的24 h抑菌效果非常明顯，且ANTTi-G的抑菌效果強(qiáng)于Ti-G．

關(guān)節(jié)置換手術(shù)失敗的另一個重要原因是無菌性松動，而成骨細(xì)胞在移植物表面的生物活性及移植物的骨整合與無菌性松動密切相關(guān)．目前有許多技術(shù)來提高鈦與成骨細(xì)胞的生物相容性，包括提高鈦表面的粗糙度［20］、化學(xué)腐蝕［21-22］、材料表面加載生物活性材料［23］、材料表面加載促進(jìn)成骨細(xì)胞活性的細(xì)胞因子［24-25］等．純鈦表面通過陽極化氧化法，改變鈦表面的形態(tài)和化學(xué)組成，規(guī)則的納米結(jié)構(gòu)及納米管的大小能模擬體內(nèi)骨骼的大小和形態(tài)，提高其與成骨細(xì)胞的生物相容性［26］．本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探討了成骨細(xì)胞在 Ti、Ti-G、ANTTi、ANTTi-G 表面的黏附、增殖、總蛋白含量以及ALP活性，以此來證明陽極化納米結(jié)構(gòu)能促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，提高成骨細(xì)胞的生物相容性．結(jié)果提示成骨細(xì)胞在第7天時ANTTi、ANTTi-G表面的黏附、增殖、總蛋白含量以及ALP活性明顯高于 Ti、Ti-G 組（P＜0．05），ANTTi、ANTTi-G 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）．第 14天時 ANTTi、ANTTi-G表面的黏附、總蛋白含量以及ALP活性明顯高于 Ti、Ti-G 組（P＜0．05），ANTTi、ANTTi-G 組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05）；ANTTi及 ANTTi-G鈣結(jié)節(jié)明顯多于Ti及Ti-G組，表明ANTTi及ANTTi-G的成骨分化能力強(qiáng)于Ti及Ti-G組．因此，本研究表明陽極化納米管鈦能提高成骨細(xì)胞的活性及其與材料的生物相容性．

綜上所述，與傳統(tǒng)的Ti或者ANTTi相比，ANTTi-G有更好的抑菌效果，同樣，與Ti或Ti-G相比，ANTTi-G與成骨細(xì)胞的的生物相容性更好．關(guān)節(jié)置換中，ANTTi-G能作為一種潛在的用來預(yù)防局部感染的新材料應(yīng)用于臨床．

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Research of gentamicin coating on anodized nanotubular titanium in inhibiting bacterial growth and promoting osteoblast activity

LIU Deng-Hui1， HE Chong-Ru2， ZHANG Yu3， ZHAN Ce2， LIU Zhong-Tang21Department of Orthopedics， the 113th Hospital of PLA， Ningbo 315040， China；2Department of Orthopedics，3Department of Radiology，Changhai Hospital Affiliated to the Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

AIM： To investigate whether gentamicin coating on anodized nanotubular titanium （ANTTi-G）can inhibit bacterial growth and promote osteoblast activity．METHODS： Anodized nanotubular titanium （ANTTi） was obtained by anodic oxidation．The gentamicin was then loaded onto ANTTi by co-precipitation，and the release profile of gentamicin was measured．The bacteriostatic ability of ANTTi-G was tested by antibacterial test of agar plate．The effect of ANTTi-G on osteoblast activity was measured by detecting the the adhesion， total protein content， proliferation，ALP activity and the number of calcium nodules of the osteoblasts．RESULTS：The antibiotics loaded by co-precipitation was gradually released over time．The antibacterial effect of ANTTi-G and Ti-G were significantly stronger than those of ANTTi and Ti group．On the 7th day， the adhesion， proliferation， total protein content and ALP activity of osteoblast on the surface of ANTTi-G and ANTTi groups were significantly higher than those of the Ti and Ti-G groups （P＜0．05）．On the 14th day， the adhesion， total protein content，ALP activity and number of calcium nodules of osteoblasts on the surface of ANTTi-G and ANTTi groups were significantly higher than those of Ti and Ti-G groups （P＜0．05）．CONCLUSION：ANTTi-G has a better antibacterial effect than ANTTi alone or conventional titanium implants．ANTTi also has more optimal biocompatibility compared with conventional titanium implant loaded with gentamicin．This study introduced something related to ANTTi-G，which can be used as a new kind of implant with the potential of preventing local infections for joint replacement surgeries．

anodized nanotubular titanium； gentamicin； infection； aseptic loosening； joint replacement

R-33；R318．08

A

2095-6894（2017）11-22-05

2017-07-15；接受日期：2017-08-05

國家自然科學(xué)基金（81371936）；上海市科學(xué)技術(shù)委員會（14JC1493102）

劉登輝．博士．研究方向：慢性骨髓炎．

E-mail：LDH870118＠ 163．com

劉忠堂．博士，教授．研究方向：慢性骨髓炎．

E-mail：surgeon_liu＠ 163．com