堿性成纖維生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌病心力衰竭大鼠心功能的影響

賴增華 竇學(xué)凱 賈春文 姜朝暉

堿性成纖維生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌病心力衰竭大鼠心功能的影響

賴增華 竇學(xué)凱 賈春文 姜朝暉

目的探討堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）轉(zhuǎn)染的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）移植對(duì)心肌病心力衰竭大鼠心功能的影響。方法通過(guò)腹腔注射阿霉素建立心肌病心力衰竭SD大鼠模型，存活33只大鼠隨機(jī)分成3組：模型組、BMSCs組和BMSCs+bFGF組，每組11只。另設(shè)正常對(duì)照組（n=8）。取體外培養(yǎng)的第三代SD大鼠BMSCs，質(zhì)粒-bFGF轉(zhuǎn)染BMSCs，BrdU標(biāo)記后，分別將BMSCs（3×106個(gè)）、bFGF轉(zhuǎn)染的BMSCs（3×106個(gè)）或等體積培養(yǎng)基通過(guò)尾靜脈注射的方法進(jìn)行移植。用生物信號(hào)采集系統(tǒng)檢測(cè)大鼠心功能，大鼠心臟切片行免疫組化了解移植細(xì)胞在受體心臟的存活情況，實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blotting檢測(cè)心室組織bFGF的表達(dá)水平。多組間比較采用單因素方差分析或精確概率法。結(jié)果BMSCs移植4周后，正常對(duì)照組大鼠的心功能指標(biāo)LVSP（121.13±12.28）mmHg，LVDEP（3.86±1.25）mmHg，LV+dP/dt（3671.25±172.50）mmHg/s和 LV-dP/dt（3221.63±259.57）mmHg/s；模型組心功能指標(biāo) LVSP（81.29±12.39）mmHg，LVDEP（16.43±4.12）mmHg，LV+dP/dt（2344.29 ±98.63）mmHg/s和 LV-dP/dt（2244.29±103.10）mmHg/s；BMSCs組心功能指標(biāo) LVSP（97.00 ±6.39）mmHg，LVDEP（12.00±2.73）mmHg，LV+dP/dt（2876.25±118.31）mmHg/s 和 LV-dP/dt（2726.25 ± 303.23）mmHg/s；BMSCs+bFGF 組心功能指標(biāo) LVSP（109.38±12.78）mmHg，LVDEP（9.25 ±1.67）mmHg，LV+dP/dt（3037.50±161.22）mmHg/s 和 LV-dP/dt（3000.13±149.77）mmHg/s，移植組各指標(biāo)均有改善，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=17.29、36.61、111.11、26.54，P均＜0.01）。免疫組織化學(xué)檢查示細(xì)胞移植組大鼠的心室組織切片上可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存在。模型組大鼠心室心肌組織bFGF mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組（1.28±0.06vs1.00±0.00，t=10.46，P＜0.01），BMSCs組高于模型組（1.37±0.05vs1.28±0.06，t=3.39，P＜0.01），而B(niǎo)MSCs+bFGF 組高于 BMSCs組（1.44±0.03vs1.37±0.05，t=2.86，P=0.01）。Western Blotting示，正常對(duì)照組大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)最低，模型組高于正常對(duì)照組（1.31±0.09vs1.00 ±0.00，t=5.48，P=0.01），BMSCs組高于模型組（1.46±0.05vs1.31±0.09，t=2.68，P=0.03），而 BMSCs+bFGF 組高于 BMSCs組（1.84±0.09vs1.46±0.05，t=6.79，P＜0.01）。結(jié)論轉(zhuǎn)染bFGF基因的BMSCs移植可提高阿霉素所致心肌病心力衰竭大鼠心臟的bFGF水平，改善大鼠心功能，其效果優(yōu)于單純BMSCs移植。

堿性成纖維生長(zhǎng)因子； 間充質(zhì)干細(xì)胞； 細(xì)胞移植； 心力衰竭

非缺血性心肌病可引起心室結(jié)構(gòu)改變和心肌壁功能受損，導(dǎo)致心臟功能進(jìn)行性障礙，心臟功能隨時(shí)間不斷惡化，臨床治療棘手[1]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchemal stem cell, BMSCs）具有多向分化潛能的特點(diǎn)，可通過(guò)旁分泌機(jī)制或分化為心肌的方式促進(jìn)非缺血性心肌病所致心力衰竭的心功能恢復(fù)，但效果還不理想[2-4]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fi broblast growth factor, bFGF）具有多重細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)，在多種細(xì)胞的增殖、分化中起重要作用，與心肌損傷及其修復(fù)關(guān)系密切[5]。本研究將Ad-bFGF轉(zhuǎn)染至分離培養(yǎng)的BMSCs中，觀察BMSCs移植對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的心肌病心力衰竭大鼠心功能的改善情況，為利用干細(xì)胞臨床治療心肌損傷奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

近交系12周齡雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量200～250 g（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司），bFGF cDNA的質(zhì)粒PBR322-bFGF（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院），注射用鹽酸阿霉素（國(guó)藥準(zhǔn)字H33021980），兔抗人堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體（博士德生物制品公司），LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（美國(guó)Gibco公司），5-溴-2'脫氧尿苷（BrdU）及小鼠抗大鼠Brdu單克隆抗體（美國(guó)Sigma公司），RNA提取試劑盒（日本BioFlux公司），EvoScipt RNA SYBR Green I Master試劑盒（美國(guó)Roche公司），ECL蛋白顯色液（美國(guó)Advansta公司）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

（一）心肌病心力衰竭大鼠模型的建立和分組

45只SD大鼠先隨機(jī)選取8只作為對(duì)照組，余37只大鼠用于復(fù)制心肌病心力衰竭模型。建模方法：注射用阿霉素以生理鹽水稀釋成2 mg/ml，按2 mg/kg大鼠體重的劑量，腹腔注射，每周1次，連續(xù)6周。對(duì)照組大鼠每周腹腔注射同量生理鹽水。6周后，37只建模大鼠存活33只，再隨機(jī)分為3組（每組 11 只）：（1）BMSCs組 ：尾靜脈注射 50 μl（含3×106個(gè)細(xì)胞）；（2）BMSCs+bFGF 組 ：尾靜脈注射50 μl轉(zhuǎn)染bFGF的BMSCs細(xì)胞懸液（含3×106個(gè)細(xì)胞）；（3）模型組尾靜脈注射50 μl培養(yǎng)液。

（二）大鼠BMSCs的純化培養(yǎng)、鑒定

大鼠處死后無(wú)菌條件下獲取股骨和脛骨，剪除干骺端，反復(fù)沖洗骨髓腔，獲取骨髓細(xì)胞。離心，棄上清及脂肪層。重新混懸細(xì)胞，加到淋巴細(xì)胞分離液，以密度梯度離心法分離純化細(xì)胞，接種于含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，37℃、5﹪CO2、90﹪相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用第3代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，細(xì)胞表型符合BMSCs的表型特征：CD90（+）、CD105（+）、CD34（-）、CD44（-）。

（三）熒光染色標(biāo)記的質(zhì)粒-bFGF轉(zhuǎn)染BMSCs

質(zhì)粒擴(kuò)增、純化后，-80℃保存?zhèn)溆?。于?xì)胞移植前進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法進(jìn)行操作。將純化的質(zhì)粒、脂質(zhì)體和骨髓BMSCs室溫下混勻，37 ℃、5﹪ CO2、90﹪相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h。換液，培養(yǎng)36 h后觀察轉(zhuǎn)染情況。

（四）BMSCs的BrdU標(biāo)記

BMSCs移植前，加入終濃度為50 mg/L的BrdU液，于37 ℃、5﹪ CO2、90﹪相對(duì)濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

（五）BMSCs移植

大鼠腹腔阿霉素末次注射后1周，用DMEM培養(yǎng)液將BrdU標(biāo)記好的BMSCs混懸成3×106/50 μl。大鼠經(jīng)戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，經(jīng)尾靜脈注射進(jìn)行細(xì)胞移植。BMSCs組大鼠給予50 μl單純BMSCs，BMSCs+bFGF組給予50 μl bFGF轉(zhuǎn)染的BMSCs，模型組給予50 μl DMEM培養(yǎng)基。

（六）大鼠心功能的測(cè)定

BMSCs移植后4周，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，固定后分離出頸總動(dòng)脈，遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端插入自制硅膠管導(dǎo)管，接RM6240型四道生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)（成都儀器制造廠），測(cè)定大鼠心率（HR）、最大左室收縮壓（LVSP）和左室舒張末壓（LVDEP）以及左室內(nèi)壓最大變化速率（±dP/dt max）。

（七）心臟標(biāo)本免疫組織化學(xué)分析

大鼠心功能測(cè)定完畢后處死，取出部分心室組織，4﹪甲醛固定，常規(guī)梯度酒精脫水，石蠟包埋后切片，行BrdU免疫組織化學(xué)染色，按試劑盒SABC法進(jìn)行操作。光學(xué)顯微鏡觀察，高倍鏡下每張切片任取5個(gè)視野，計(jì)算每個(gè)視野的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值作為每組的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

（八）實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠心室組織bFGF mRNA表達(dá)

大鼠處死后取心室組織，液氮保存。勻漿后加入裂解液，Trizol法提取組織總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行Realtime PCR檢測(cè)，采用兩步法反應(yīng)，Reps：40，95 ℃，5 s，60 ℃，32 s。了解各組bFGF mRNA水平和最佳抑制時(shí)間，抑制率≥75﹪、維持≥72 h為有效系列。bFGF上游引物：5'-CGC CGCGCACCAGGGGCCGG-3'，下游引物 ：5'-ATGG CCACATCTAATCTCAT-3’。內(nèi)參 GAPDH，上游引物 ：5'-GACGACATCAAGAAGGTGGT -3’，下游引物 ：5'- AAACTGTGAAGAGGGGCAGA-3'（上海申工生物公司合成）。

（九）Western Blotting檢測(cè)大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)

取液氮保存的心室組織，充分研漿，加入裂解液提取總蛋白，Bradford比色法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白經(jīng)10﹪ PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后加入稀釋的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，加入二抗，室溫下繼續(xù)孵育1 h。利用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法曝光、顯影、定影，標(biāo)定Marker，進(jìn)行掃描與分析。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理

采用SPSS12.0版統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。心功能指標(biāo)、BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)、bFGF表達(dá)水平等

結(jié) 果

一、各組大鼠存活情況比較

BMSCs移植前，造模大鼠均有不同程度的中毒癥狀，包括精神委靡、腹瀉、皮毛無(wú)光澤、進(jìn)食減少、腹水等，癥狀進(jìn)行性加重。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，對(duì)照組8只大鼠全部存活（100﹪），而模型組存活 7只（63.64﹪），BMSCs組存活8只（72.73﹪），BMSCs+bFGF組存活8只（72.73﹪）。各組間存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.32）。

表1 各組大鼠經(jīng)BMSCs移植術(shù)后第4周左室功能比較（± s）

表1 各組大鼠經(jīng)BMSCs移植術(shù)后第4周左室功能比較（± s）

注 ：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05 ；與模型組比較，bP＜0.05 ；與 BMSCs組比較，cP＜0.05

分組 n LVSP（mmHg） LVDEP（mmHg） LV+dP/dt（mmHg/s） LV-dP/dt（mmHg/s）正常對(duì)照組 8 121.13±12.28 3.86±1.25 3671.25±172.50 3221.63±259.57模型組 7 81.29±12.39a 16.43±4.12a 2344.29± 98.63a 2244.29±103.10a BMSCs組 8 97.00± 6.39ab 12.00±2.73ab 2876.25±118.31ab 2726.25±303.23ab BMSCs+bFGF 組 8 109.38±12.78abc 9.25±1.67abc 3037.50±161.22abc 3000.13±149.77bc F值 17.29 36.61 111.11 26.54 P 值 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01

二、經(jīng)BMSCs移植術(shù)后第4周各組大鼠心功能比較

與正常對(duì)照組相比，模型組LVSP、LV+dP/dt和 LV-dP/dt均下降（t=6.86、18.02、8.53，P均 ＜0.01），而LVDEP 升高（t=9.30，P＜0.01），表明心力衰竭的大鼠模型已成功建立。與模型組相比，BMSCs組大鼠的LVSP、LV+dP/dt 和 LV-dP/dt均升高（t= 2.70、7.22、4.22、P均＜0.05），而LVDEP 降低（t=3.28，P＜0.01）；與模型組相比，BMSCs+bFGF組大鼠的LVSP、LV+dP/dt和 LV-dP/dt也均升高（t=4.83、9.41、6.59、P均＜0.05），而 LVDEP 降低（t= 5.31，P＜0.01）。與 BMSCs組相比，BMSCs+bFGF組大鼠的LVSP、LV+dP/dt 和LV-dP/dt均 升 高（t= 2.20、2.27、2.46，P 均＜0.05），而 LVDEP 降低（t= 2.11，P＜0.05）（表 1）。

三、心室組織切片BrdU免疫組織化學(xué)檢查結(jié)果

正常對(duì)照組、模型組大鼠心室組織切片上均未見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞,而細(xì)胞移植組大鼠的心室組織切片上可見(jiàn)BrdU陽(yáng)性細(xì)胞存在，在心肌間及血管壁上可見(jiàn)呈棕黃色的BrdU陽(yáng)性標(biāo)記的移植細(xì)胞（圖1）。BMSCs+bFGF組心室組織切片每高倍視野的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與BMSCs組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.13±1.89vs4.13±1.73，t=1.11，P=0.28）。

四、BMSCs移植對(duì)大鼠心室組織bFGF mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組大鼠心室組織的bFGF表達(dá)情況，以正常對(duì)照組心室組織bFGF mRNA表達(dá)水平的相對(duì)定量值為1，其余各組大鼠心室組織bFGF mRNA表達(dá)的相對(duì)定量值除以正常對(duì)照組×100﹪表示。結(jié)果顯示，模型組bFGF mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組（1.28±0.06vs1.00±0.00，t=10.46，P＜0.01），BMSCs組高于模型組（1.37±0.05vs1.28±0.06，t=3.39，P＜0.01），而B(niǎo)MSCs+bFGF組高于 BMSCs組（1.44±0.03vs1.37±0.05，t=2.86，P=0.01），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心臟心臟切片的BrdU免疫組化（SABC，×400）

五、BMSCs移植對(duì)大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)的影響

Western Blotting法檢測(cè)結(jié)果如圖2、圖3所示，正常對(duì)照組大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)最低，模型組bFGF蛋白表達(dá)水平高于正常對(duì)照組（1.31 ± 0.09vs1.00 ± 0.00，t=5.48，P=0.01），BMSCs組高于模型組（1.46 ± 0.05vs1.31 ± 0.09，t=2.68，P=0.03），而 BMSCs+bFGF 組大鼠心室組織bFGF mRNA表達(dá)量最高，高于BMSCs組（1.84 ± 0.09vs1.46 ± 0.05，t=6.79，P＜0.01）。

圖2 Western Blotting法檢測(cè)BMSCs移植對(duì)大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)的影響

圖3 Western Blotting法檢測(cè)BMSCs移植對(duì)大鼠心室組織bFGF蛋白表達(dá)的影響

討 論

非缺血性心肌病是由于心臟冠狀動(dòng)脈病變以外的原因所導(dǎo)致的一大類心肌疾病，發(fā)病隱匿，早期可無(wú)癥狀，發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已發(fā)展到慢性充血性心力衰竭階段[1]。與缺血性心肌病（主要是冠心?。┎煌?，血管重建等手段并不能使非缺血性心肌病的病情得到緩解，晚期病人只能進(jìn)行心臟移植。因此尋求新的治療方法具有重要臨床意義。本研究采用阿霉素誘導(dǎo)建立心肌病心力衰竭大鼠模型，這一成熟的造模方法已被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[2-4,6]。本研究中發(fā)現(xiàn)，造模大鼠在連續(xù)腹腔注射阿霉素后，出現(xiàn)了進(jìn)行性加重的心力衰竭異常癥狀，包括精神委靡、皮毛無(wú)光澤、消瘦、腹水（表現(xiàn)為腹部逐漸膨隆），甚至死亡；大鼠處死后，發(fā)現(xiàn)均有不同程度的腹水、肝淤血、胸水。生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)行左心功能檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組 LVSP、LV+dP/dt 和 LV-dP/dt均下降，而 LVDEP升高。這些癥狀、體征及檢查指標(biāo)，符合文獻(xiàn)所報(bào)道的心力衰竭判斷標(biāo)準(zhǔn)，表明心力衰竭的大鼠模型已成功建立[2-4,6]。

BMSCs具有多向分化潛能，在特定的誘導(dǎo)環(huán)境下可分化為心肌細(xì)胞，在細(xì)胞移植治療方面具有巨大的應(yīng)用前景[7-8]。早期的研究發(fā)現(xiàn)，心肌局部注射BMSCs，局部的心臟微環(huán)境可誘導(dǎo)移植到體內(nèi)的BMSCs分化為心肌樣細(xì)胞，后者可與原有心肌產(chǎn)生同步收縮，改善心臟功能[9]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs具有特殊的“歸巢”作用，受損心肌局部的微環(huán)境改變，可誘發(fā)靜脈注射的BMSCs遷移到受損心肌處[10-11]。因此，本研究采用尾靜脈注射的方法進(jìn)行BMSCs移植。移植后心臟標(biāo)本的免疫組織化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，在移植大鼠心臟標(biāo)本的心肌間及血管壁上可見(jiàn)BrdU標(biāo)記的移植細(xì)胞，表明有部分移植的BMSCs細(xì)胞“歸巢”到受損心臟并在局部生存。

目前已有多個(gè)研究證實(shí)，采用BMSCs移植可改善阿霉素所致心肌病心力衰竭動(dòng)物的心功能，但效果還不理想[2-4,6]。此外，越來(lái)越多的研究表明，BMSCs移植改善心功能的作用機(jī)制，除了直接分化為心肌樣細(xì)胞外，更主要機(jī)制可能在于通過(guò)BMSCs的旁分泌作用，即通過(guò)釋放多種細(xì)胞因子、抗凋亡因子、生長(zhǎng)因子而促進(jìn)心肌內(nèi)源性修復(fù)、改善心功能[12-13]。鑒于BMSCs是基因治療的理想靶細(xì)胞，如果能將在心臟修復(fù)中起重要作用的目的細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)染至BMSCs后再進(jìn)行移植，將基因治療與細(xì)胞移植結(jié)合起來(lái)，必將增強(qiáng)BMSCs的旁分泌作用，促進(jìn)心功能的恢復(fù)。

bFGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子蛋白家族中的一員，是一種廣譜的有絲分裂原，可刺激血管形成、促進(jìn)創(chuàng)傷愈合，具有廣泛的生物學(xué)作用[14]。bFGF與心肌肥大關(guān)系密切，其經(jīng)AMPK傳遞的信號(hào)途徑是介導(dǎo)壓力超負(fù)荷所致心肌肥大的重要機(jī)制之一。研究證實(shí)，心力衰竭發(fā)生后，心臟組織bFGF的表達(dá)上升，且與心臟射血分?jǐn)?shù)呈正相關(guān)[15]。心肌細(xì)胞是多肽生長(zhǎng)因子調(diào)控的靶細(xì)胞，而bFGF可以自分泌及（或）旁分泌發(fā)揮作用[16]。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs旁分泌的細(xì)胞因子中，包括了bFGF等促血管生長(zhǎng)因子，對(duì)受損心肌產(chǎn)生保護(hù)作用[13]。作為一種重要的目的基因，bFGF已被廣泛用于BMSCs的基因修飾，移植治療顱腦損傷、肺動(dòng)脈高壓、糖尿病、心肌梗塞等疾病[17-20]，但目前尚無(wú)采用bFGF基因修飾的BMSCs移植治療非缺血性心肌病的報(bào)道。

BFGF含量與本研究將bFGF基因成功轉(zhuǎn)入BMSCs，再進(jìn)行BMSCs移植，以使BMSCs分泌更多的bFGF，改善微環(huán)境，促進(jìn)心功能的恢復(fù)。本研究實(shí)時(shí)定量PCR和Western Blotting結(jié)果顯示，正常大鼠心室組織bFGF水平很低，在阿霉素誘導(dǎo)心肌損傷后，bFGF水平升高，可能與機(jī)體在心肌受損后的自我修復(fù)作用有關(guān)。BMSCs移植可增加心臟局部的bFGF水平，說(shuō)明了BMSCs可通過(guò)上調(diào)bFGF水平而促進(jìn)心功能恢復(fù)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。而B(niǎo)MSCs+bFGF組大鼠心室組織bFGF水平最高，證實(shí)bFGF基因修飾后的BMSCs移植，可極大提高心臟局部的bFGF水平而發(fā)揮修復(fù)作用。BMSCs+bFGF組心室組織切片每個(gè)高倍視野的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)高于BMSCs組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而B(niǎo)MSCs+bFGF組大鼠心臟組織bFGF蛋白的水平則升高，因此我們推測(cè)，其bFGF蛋白可能來(lái)源于“歸巢”至心臟的BMSCs在心臟局部表達(dá)bFGF以及未歸巢的BMSCs所分泌的bFGF兩方面。與bFGF表達(dá)水平相一致的是，BMSCs組和BMSCs+bFGF組大鼠的心功能指標(biāo)均較模型組好轉(zhuǎn)，而B(niǎo)MSCs+bFGF組大鼠的心功能指標(biāo)改善更為顯著。

綜上所述，轉(zhuǎn)染bFGF基因的BMSCs移植可提高阿霉素所致心肌病心力衰竭大鼠心臟的bFGF水平，改善大鼠心功能，其效果優(yōu)于單純BMSCs移植。關(guān)于BMSCs的移植數(shù)量和基因轉(zhuǎn)染的臨床安全性、具體的作用機(jī)制等尚有待進(jìn)一步研究。

1 彭澍, 吳平生. 曲美他嗪治療中國(guó)人群非缺血性心肌病慢性心力衰竭臨床療效的Meta分析[J]. 臨床薈萃, 2011, 26(21):1848-1851, 1855.

2 肖麗, 智永超. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合環(huán)磷酸腺苷葡胺治療心力衰竭大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 16(2):118-120.

3 艾金偉, 劉盈, 劉楚繁, 等. 自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療擴(kuò)張性心肌病:安全和有效性的Meta分析[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2017,38(5):780-788.

4 侯永蘭, 楊東偉. 靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)心肌病心力衰竭心功能的影響[J]. 2016, 20(23):3413-3418.

5 何作云, 馮兵, 周小波. 急性壓力超負(fù)荷心臟局部堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子和腎素血管緊張素系統(tǒng)的變化及其意義[J]. 中華心血管病雜志, 1999, 27(1):64-67.

6 王本臻, 毛成剛, 李榮, 等. 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞肌肉注射對(duì)多柔比星誘導(dǎo)擴(kuò)張型心肌病大鼠心功能及心肌超微結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中華實(shí)用兒科臨床雜志, 2016, 31(1):28-32.

7 Huang J, Zhang Z, Guo J, et al. Genetic modi fi cation of mesenchymal stem cells overexpressing CCR1 increases cell viability, migration,engraftment, and capillary density in the injured myocardium[J]. Circ Res, 2010, 106(11):1753-1762.

8 Van Den Akker F, Deddens JC, Doevendans PA, et al. Cardiac stem cell therapy to modulate in fl ammation upon myocardial infarction[J].Biochim Biophys Acta, 2013, 1830(2):2449-2458.

9 Tse HF, Kwong YL, Chan JK, et al. Angiogenesis in ischaemic myocardium by intramyocardial autologous bone marrow mononuclear cell implantation[J]. Lancet, 2003, 361(9351):47-49.

10 Kocher AA, Schuster MD, Szabolcs MJ, et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function[J]. Nat Med, 2001, 7(4):430-436.

11 Ciulla MM, Lazzari L, Pacchiana R, et al. Homing of peripherally injected bone marrow cells in rat after experimental myocardial injury[J]. Haematologica, 2003, 88(6):614-621.

12 馮吉. 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的旁分泌作用[J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2011, 40(13):1332-1333.

13 Tang YL, Zhao Q, Qin X, et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction[J]. Ann Thorac Surg,2005, 80(1):229-236; discussion 236-237.

14 丁煥文, 何錫煌. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的生物學(xué)功能[J]. 中華創(chuàng)傷雜志, 1995 (3):189-191.

15 李琦, 張榮利, 李貽奎, 等. 心肌梗死后心力衰竭大鼠超聲心動(dòng)指標(biāo)與體內(nèi)VEGF,BNP的變化關(guān)系[J]. 現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2009,24(1):73-75.

16 倪菁, 李偉明, 郭榮. 細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路對(duì)心肌肥大調(diào)控作用的研究進(jìn)展[J]. 臨床與病理雜志, 2017, 37(1):168-176.

17 張琳, 居士明, 王敢, 等. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子修飾的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)顱腦損傷模型大鼠神經(jīng)功能的改善機(jī)制分析[J]. 臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2016, 15(12):1137-1140.

18 宋燕峰, 曹潔. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療肺動(dòng)脈高壓[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2015, 19(6):918-922.

19 田雪品, 劉海英. 堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子基因真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療糖尿病[J]. 中國(guó)組織工程研究, 2016,20(36):5385-5391.

20 王曉艷, 蘇又蘇, 蘇卓娃, 等. hbFGF基因治療心肌梗死的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志, 2009, 7(6):707-709.

2017-05-19）

（本文編輯：李少婷）

賴增華，竇學(xué)凱，賈春文，等.堿性成纖維生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)心肌病心力衰竭大鼠心功能的影響[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（5）：271-276.

Influence of transplantation with basic fibroblast growth factor gene-transfected bone mesenchymal stem cells on heart function in rats with heart failure

Lai Zenghua, Dou Xuekai,Jia Chunwen, Jiang Chaohui. Department of Cardiology, the 174th Hospital of the PLA, Affiliated Chenggong Hospital of Xiamen University, Xiamen 360001, China

Lai Zenghua, Email: laizenghua1984@163.com

ObjectiveTo explore the influence of transplantation with basic fibroblast growth factor (bFGF) gene-transfected bone mesenchymal stem cells (BMSCs) on heart function in rats with heart failure.MethodsA heart failure model of SD rats was induced by intraperitoneal injection with adriamycin. The 33 survived rats were randomly divided into 3 groups: a model group, a BMSCs group and a BMSCs+bFGF group (n=11 for all). Another 8 rats served as control.BMSCs at the third passage were transfected with bFGF and labeled with BrdU. BMSCs (3×106),bFGF-transfected BMSCs (3×106), or culture medium were respectively transplanted into rats via the tail vein. Cardiac function was evaluated with the use of a physiological recorder. The hearts were analyzed by immunohistochemical staining to identify the transplanted BrdU-labeled cells.The expressions of bFGF protein and mRNA in the heart tissues were respectively determined by Western Blotting and real time PCR. One-Way ANOVA or Fisher's exact test was used in the analysis as appropriately.ResultsFour weeks after transplantation, hemodynamic measurements showed LVSP (121.13±12.28) mmHg, LVDEP (3.86±1.25) mmHg, LV +dP/dt (3671.25±172.50) mmHg/s,LV-dP/dt (3221.63±259.57) mmHg/s in the normal control group; LVSP (81.29±12.39) mmHg,LVDEP (16.43±4.12) mmHg, LV+dP/dt (2344.29±98.63) mmHg/s, LV-dP/dt (2244.29±103.10)mmHg/s in the model group; LVSP (97.00±6.39) mmHg, LVDEP (12.00±2.73) mmHg, LV+dP/dt(2876.25±118.31) mmHg/s, LV-dP/dt (2726.25±303.23) mmHg/s in the BMSCs group, and LVSP(109.38±12.78) mmHg, LVDEP (9.25±1.67) mmHg, LV+dP/dt (3037.50±161.22) mmHg/s, LV-dP/dt (3000.13±149.77) mmHg/s in the BMSCs+bFGF group. The parameters were all significantly improved (F=17.29, 36.61, 111.11 and 26.54 respectively，Pall＜0.01) after the transplantation.BrdU-labeled transplanted BMSCs could be found in the hearts of the recipients. The expression of bFGF mRNA in the heart tissues were significantly increased in the model group (1.28±0.06) than in the control group (t=10.46，P＜0.01); in the BMSCs group (1.37±0.05) than in the model group (t=3.39,P＜0.01); and in the BMSCs+bFGF group (1.44±0.03) than in the BMSCs group (t=2.86,P=0.01). As shown by Western Blotting test, the bFGF protein expression level of the heart tissues was the lowest in the normal control, but significantly higher in the model group than in the control group(1.31±0.09vs1.00±0.00,t=5.48,P=0.01), in the BMSCs group than in the model group (1.46 ±0.05vs1.31±0.09,t=2.68,P=0.03), and in the BMSCs+bFGF group than in the BMSCs group(1.84±0.09vs1.46±0.05,t=6.79,P＜0.01).ConclusionTransplantation with BMSCs or bFGF-transfected BMSCs can both improve cardiac function in rats with adriamycin-induced heart failure,while the effect of bFGF-transfected BMSCs may be better than BMSCs only.

Basic fibroblast growth factor; Mesenchymal stem cells; Cell transplantation; Heart failure

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.004

360001 廈門，中國(guó)人民解放軍第一七四醫(yī)院（廈門大學(xué)附屬成功醫(yī)院）心內(nèi)科

賴增華，Email：laizenghua1984@163.com