臍帶血非造血性功能定向干（祖）細(xì)胞研究進(jìn)展

徐峰波 崔光晶 曹光鑫 綜述 沈柏均 校審

·綜述·

臍帶血非造血性功能定向干（祖）細(xì)胞研究進(jìn)展

徐峰波1崔光晶1曹光鑫1綜述 沈柏均2校審

臍帶血非造血干細(xì)胞（UCB-nHSC）種類多樣，近年來在越來越多的領(lǐng)域凸顯其作用。本文歸納了臍帶血中發(fā)現(xiàn)的胚胎樣干細(xì)胞、非限制性體干細(xì)胞、多系性祖細(xì)胞及多潛能祖細(xì)胞、神經(jīng)祖細(xì)胞的非造血干細(xì)胞的特性，指出目前研究應(yīng)用領(lǐng)域及存在的問題，討論與其他細(xì)胞相比在應(yīng)用方面的優(yōu)缺點，并在此基礎(chǔ)上對UCB-nHSC的研究及應(yīng)用前景做了展望。

臍帶血非造血干細(xì)胞； 極小胚胎樣干細(xì)胞； 非限制性體干細(xì)胞； 多系性祖細(xì)胞； 神經(jīng)祖細(xì)胞

臍帶血中含有豐富的干細(xì)胞，包括造血干細(xì)胞和非造血干細(xì)胞[1]。造血干細(xì)胞研究較多，已在臨床中廣泛應(yīng)用。非造血類干細(xì)胞報道相對較少，但隨著相關(guān)研究的加深，非造血類干細(xì)胞已成為干細(xì)胞研究的新熱點。實際上非造血類干細(xì)胞包括多種種類，從原始的胚胎樣干細(xì)胞到相對成熟的神經(jīng)祖細(xì)胞和內(nèi)皮祖細(xì)胞等[2]，近年來已成為新的研究熱點。與其他來源的干細(xì)胞相比，臍帶血非造血干細(xì)胞（non-hematopoietic stem cells in umbilical cord blood，UCB-nHSC）具有取材方便、功能豐富、應(yīng)用廣泛等優(yōu)點，文中對UCB-nHSC中胚胎樣干細(xì)胞、非限制性體干細(xì)胞、多向分化祖細(xì)胞以及神經(jīng)祖細(xì)胞的重要特性及研究應(yīng)用現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，旨在探討UCB-nHSC研究和應(yīng)用前景，為再生醫(yī)學(xué)提供重要的干細(xì)胞資源。

一、極小胚胎樣干細(xì)胞（very small embryonic-like stem cells，VSELs）

VSELs以其體積小命名，且細(xì)胞數(shù)量很少，近年來研究逐漸增加。2006年3月Kucia等[3]從成年的小鼠骨髓Sca-1+Lin-CD45-細(xì)胞中分離趨化因子受體4陽性細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)一種同時表達(dá)胚胎干細(xì)胞、外胚層干細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞標(biāo)志分子（SSEA-1，Oct-4，Nanog和Rex-1）的特殊干細(xì)胞，該細(xì)胞數(shù)量很少，只占骨髓（mononuclear cell，MNC）的0.02﹪，細(xì)胞體積極小，只有2～4 μm，因此命名。同年，伊利諾伊大學(xué)的Zhao等[4]報道一種在臍帶血中發(fā)現(xiàn)的命名為臍帶血干細(xì)胞（cord blood stem cells，CB-SC）的多分化潛能異質(zhì)細(xì)胞，CB-SC同時具有胚胎干細(xì)胞和造血干細(xì)胞相關(guān)分子標(biāo)志的特征，體外誘導(dǎo)可分化為內(nèi)皮和神經(jīng)細(xì)胞，體內(nèi)可分化為分泌胰島素的細(xì)胞，這是首次從臍帶血中發(fā)現(xiàn)胚胎樣、可跨胚層分化的多能干細(xì)胞報道。Halasa等[5]也獲得人臍帶血VSELs，并證實臍帶血VSELs的多能干細(xì)胞特征，該團(tuán)隊還通過對新生兒VSELs的研究，提出臍帶血中VSELs與胎兒的發(fā)育密切相關(guān)。Shaikh等[6]從人臍帶血分離得到的VSELs表達(dá)Lin-CD45-CD34+CD133+，并表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志Oct4A，Oct4，SSEA4，SOX2，Nanog和 Rex-1以及原始生殖細(xì)胞標(biāo)志STELLA，F(xiàn)RAGILIS。人臍帶血VSELs細(xì)胞直徑比鼠來源的稍大，約4～6 μm。人VSELs體積比紅細(xì)胞小，但胞內(nèi)內(nèi)容物密度大，梯度密度離心分離時與紅細(xì)胞而不是白細(xì)胞一起被分離。另外，也可采用流式細(xì)胞儀經(jīng)過特異性標(biāo)記分選得到。

VSELs是最原始的靜息多能干細(xì)胞，成年組織器官中的其他干細(xì)胞可能是其定向分化的結(jié)果。VSELs作為最原始、體型小的靜息干細(xì)胞，其活化可生成形體較大，兼有多向重疊分化潛能的干細(xì)胞，很可能是真正發(fā)揮器官修復(fù)作用的生命機制[7]。Ratajczak等[8]用從臍帶血分離來的VSELs與OP9共培養(yǎng)獲得的造血細(xì)胞，可使致死劑量照射的非肥胖型糖尿病免疫缺陷小鼠重建造血功能，并且移植這些造血細(xì)胞后小鼠的造血功能可持續(xù)4～6周，因此研究者推測，VSELs可能是臍帶血中最原始的造血干細(xì)胞。Ratajczak等研究認(rèn)為，臍帶血VSELs為新生兒提供用于修復(fù)分娩中損傷組織的干細(xì)胞，由此認(rèn)為，VSELs具有可長期再植造血干細(xì)胞（long-term repopulating hematopoietic stem cells，LTHSCs）特性，可作為再生醫(yī)學(xué)中多能干細(xì)胞的重要來源。因此，VSELs具有原始性、體積小、分化能力強的特點，使其在新生兒干細(xì)胞修復(fù)方面作用較大，隨著研究的深入，將在越來越多的領(lǐng)域發(fā)揮作用。

二、非限制性體干細(xì)胞（unrestricted somatic stem cells，USSCs）

2004年，K?gler等[9]報道一種從臍帶血中發(fā)現(xiàn)的多能干細(xì)胞，稱之為USSCs。USSCs從臍帶血MNC中分離得到，但在臍帶血中含量極低。該細(xì)胞類似間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），可黏附生長，細(xì)胞形態(tài)呈梭型，具有高增殖活性。USSCs表面抗原表達(dá)情況與MSCs類似，陽性標(biāo)志分子有：CD13/CD29/CD44/CD90/CD105，但不表達(dá)CD14/CD34/CD45。兩者的不同在于，USSCs不表達(dá)CD50/CD62L/CD106和HAS1，而MSCs呈陽性表達(dá)。USSCs在體內(nèi)外都可以分化成3個不同胚層的細(xì)胞，包括成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、造血細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，將USSCs移植到無創(chuàng)羊胚胎，可得到USSCs來源的造血細(xì)胞、心肌細(xì)胞以及可產(chǎn)生白蛋白的干細(xì)胞。此外，臍帶血USSCs可以在支持MSCs生長的培養(yǎng)基中擴增，同時具備造血支持基質(zhì)的活性和體內(nèi)增強臍帶血CD34+細(xì)胞歸巢的能力，而且USSCs的這種造血支持活性和相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)水平高于骨髓MSCs。以此推斷USSCs是比MSCs更原始的干細(xì)胞，是促進(jìn)臍帶血造血和加快血象恢復(fù)的重要因素。

近來研究發(fā)現(xiàn)，β-磷酸三鈣-藻酸鹽-明膠（beta tricalcium phosphate alginate gelatin，BTAG）3D支架可促進(jìn)人臍帶血來源的USSCs向軟骨細(xì)胞分化[10]。研究中實驗組的USSCs被包裹在BTAG的支架中誘導(dǎo)培養(yǎng)，對照組在無支架的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系中。免疫組化檢測表明，含支架組在培養(yǎng)21 d后細(xì)胞外基質(zhì)中強烈表達(dá)USSCs來源的Ⅱ型膠原蛋白，可觀察到未完全分化的細(xì)胞（圖1a），但在無支架培養(yǎng)體系未檢測到粘多糖的表達(dá)（圖1b）。PCR檢測表明，實驗組中軟骨特異性標(biāo)記物、蛋白聚糖聚合物、Ⅰ型和Ⅱ型膠原蛋白以及骨形成蛋白（BMP-6）的mRNA表達(dá)水平高于對照組。可見，BTAG可為USSCs向軟骨分化提供合適的生長環(huán)境，這為USSCs的臨床應(yīng)用提供研究方向。

圖1 波長594nm-倒置顯微鏡（Olympus, Japan）下觀察存在3D支架和無支架條件下培養(yǎng)USSCs的特征（阿爾新藍(lán)染色）[10]

K?gler等[11]研究認(rèn)為，USSCs是臍帶血中具有基質(zhì)細(xì)胞特性的一類干細(xì)胞，它和臍帶血多能基質(zhì)細(xì)胞（cord blood multipotent stromal cells，CB-MSCs）的成脂分化能力不同，前者不響應(yīng)成脂誘導(dǎo)，不表達(dá)脂肪前體細(xì)胞標(biāo)志δ 樣 1型同源物（delta like 1 homologue，DLK-1）和同源框（homeobox，HOX）基因，而 CB-MSCs與骨髓來源的MSCs類似，可形成脂質(zhì)空泡并表達(dá)人HOX基因。目前已有多個研究團(tuán)隊分別從臍帶血中制備得到USSCs和CBMSCs細(xì)胞系，但兩種細(xì)胞是原本并行存在于臍帶血，還是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中可從其他細(xì)胞轉(zhuǎn)化，有待進(jìn)一步研究。據(jù)Karagianni推測[12]，臍帶血來源的所有基質(zhì)細(xì)胞原本只是USSC而非MSC樣細(xì)胞，并且它們可能是在外因如地塞米松的刺激下獲得成脂的能力，然而該假設(shè)機制尚需進(jìn)一步的實驗證實。Kluth等[13]研究發(fā)現(xiàn)，相比于CB-MSC，USSC可增加造血細(xì)胞擴增，促進(jìn)胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1（insulin-like growth factor binding protein 1，IGFBP1）的表達(dá)，但胰島素生長因子2（insulin-like growth factor，IGF）的表達(dá)水平則較低，后者對成脂分化具有與胰島素一樣重要的調(diào)節(jié)作用，該實驗結(jié)果提示，DLK-1可能不是抑制USSCs成脂分化的唯一因素。

臍帶血USSCs增殖分化作用的機制研究較少，一般認(rèn)為臍帶血USSC自我更新和分化與轉(zhuǎn)錄因子Nanog和Rex-1密切相關(guān)。Langroudi等[14]通過siRNA干擾實驗證實Nanog和Rex-1在USSCs誘導(dǎo)分化中的作用。研究顯示，Nanog敲除可促進(jìn)成骨標(biāo)志物、骨鈣素和骨橋蛋白的表達(dá)，并可得到茜素紅染色陽性的骨細(xì)胞，這說明USSCs已向骨細(xì)胞分化。USSCs敲除基因后經(jīng)油紅染色呈陽性，這意味著USSCs已向成脂分化。而USSCs敲除REX-1可增加神經(jīng)細(xì)胞分化的標(biāo)志MAP Ⅱ及Nestin表達(dá)。然而，用上述兩種siRNA共同干擾，評估指標(biāo)卻沒有任何變化。因此，可見Nanog基因控制著USSCs向骨和脂肪的分化，REX-1基因被抑制將導(dǎo)致USSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化。Langroudi等認(rèn)為，這兩種轉(zhuǎn)錄因子是USSCs自我更新的核心活化劑，同時也受到其他因素影響，該結(jié)果顯示在USSCs自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中存在一個正向反饋機制。

三、多系性祖細(xì)胞（multilineage progenitor cells，MLPCs）和多潛能祖細(xì)胞（multipotent progenitor cells，MPCs）

MLPCs是一種報道較少但確定存在于臍帶血中數(shù)量很少的多能干細(xì)胞[15]，可通過抗體親和分離培養(yǎng)基分離得到。新分離的MLPCs呈白細(xì)胞樣形態(tài)，表達(dá)CD45、CD34、CD133、CD9、Nestin、SSEA-3、SSEA-4和幾種 MSC 的標(biāo)志如 ：CD13、CD29、CD44、CD73、CD90 和 CD105。培養(yǎng)擴增后細(xì)胞形態(tài)變?yōu)槔w維細(xì)胞樣，且丟失造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34、CD133和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志SSEA-3、SSEA-4，但仍表達(dá)MSC的標(biāo)志。而且，MLPCs也可以從臍帶血MSCs中通過單細(xì)胞克隆獲得[16]。MLPCs因擴增細(xì)胞類型范圍更廣、可塑性更高而區(qū)分于MSCs。與臍帶血MSCs和骨髓MSCs相比，臍帶血MLPC顯著的表型特征是高表達(dá)CD9。微量測定分析顯示，MLPCs是一類相對靜止的原始細(xì)胞，相對于骨髓MSC，它具有更寬的可塑性，也不能簡單地歸入哪一類胚層細(xì)胞。據(jù)報道，MLPCs可以分化成3個胚層中任意種類的細(xì)胞，例如內(nèi)胚層的肝胰前體細(xì)胞、成熟干細(xì)胞和Ⅱ型肺泡細(xì)胞；中胚層的脂肪細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞以及外胚層的神經(jīng)元細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。盡管MLPCs具有廣泛的擴增能力和較高的可塑性，但不具備胚胎干細(xì)胞樣的自發(fā)分化和畸胎瘤形成能力，這也預(yù)示MLPCs將成為再生醫(yī)學(xué)關(guān)注的重要干細(xì)胞來源。

MPCs由Lee等[17]在凍存的臍帶血中分離提取，該類細(xì)胞不表達(dá)造血干細(xì)胞常見的標(biāo)志物CD34和CD133，高表達(dá)CD14、CD45、CD33及SSEA-4，由此可與其他干細(xì)胞分離。Lee等通過分離培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，MPCs可分化成神經(jīng)組織特異的細(xì)胞群，包括神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，這提示MPCs在未來同種異體細(xì)胞治療中可發(fā)揮作用。在成功分離MPCs后，Moon等[18]通過研究發(fā)現(xiàn)MPCs在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下可誘導(dǎo)分化成肝細(xì)胞系，表達(dá)肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如白蛋白、肝細(xì)胞核因子（hepatocyte nuclear factor，HNF）-1α、HNF-4、角蛋白（CK）-8、CK-18等。其中，能夠分泌白蛋白說明臍帶血來源的MPCs具有多向分化潛能并有分化成功能性肝細(xì)胞系的能力。MPCs誘導(dǎo)后，在基因和蛋白水平均能表現(xiàn)肝細(xì)胞合成、代謝等特性[19]，這也提示MPCs可能會成為組織工程或肝細(xì)胞治療的重要來源。因此，隨著研究的深入，MPCs將會在多種領(lǐng)域發(fā)揮作用，成為重要的細(xì)胞治療來源。

四、神經(jīng)祖細(xì)胞（neuronal progenitor cells，NPCs）

2002年Buzańska等[20]從臍帶血中分離得到NPCs，它具有形成神經(jīng)細(xì)胞球和神經(jīng)分化的潛能。研究者通過CD34免疫磁珠負(fù)篩選，去除表達(dá)CD34和CD45的細(xì)胞后，再經(jīng)細(xì)胞表面分子特異吸附法富集得到神經(jīng)前體細(xì)胞。這些神經(jīng)前體細(xì)胞在表皮生長因子（EGF）存在條件下，低細(xì)胞密度培養(yǎng)可得到球狀神經(jīng)元。Buzańska的研究團(tuán)隊還建立非永久基因克隆型的臍帶血神經(jīng)干細(xì)胞系（umbilical cord blood neuronal stem cells UCB-NSCs），該細(xì)胞系可通過培養(yǎng)維持其神經(jīng)祖細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的不同階段[21]。從UCB-NSCs來源的神經(jīng)細(xì)胞球可以表達(dá)神經(jīng)干/祖細(xì)胞標(biāo)志nestin和膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），并能分化成神經(jīng)纖維、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞系。McGuckin等從不表達(dá)造血細(xì)胞標(biāo)志（CD45，CD33，CD7和glycophorin-A）的臍帶血MNC中誘導(dǎo)獲得類似神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞球，其采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)體系包含胸腺蛋白、Flt-3配體和c-kit配體（TPOFLK）。

研究者通過實驗還發(fā)現(xiàn)[22]，臍帶血MNC中存在神經(jīng)細(xì)胞分化潛能的細(xì)胞，體外可形成神經(jīng)細(xì)胞球并能分化成神經(jīng)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞（圖2）。新分離的p75NTR+細(xì)胞可表達(dá)各種神經(jīng)脊細(xì)胞的特異標(biāo)志，如Slug、Snail、Twist、Wnt-1和Sox9，由此可推斷這部分細(xì)胞起源于神經(jīng)脊干細(xì)胞。

臍帶血來源的具有神經(jīng)分化潛能的UCB-nHSC，具有多向分化潛能和長期培養(yǎng)可塑性。對于UCB-nHSC的應(yīng)用前景，Domanska等[22]認(rèn)為，目前仍缺少足夠的理論知識，急需的不是開展相關(guān)臨床應(yīng)用實驗研究，而應(yīng)該根據(jù)現(xiàn)有基礎(chǔ)進(jìn)行動物實驗研究以提供充足的證據(jù)，發(fā)掘成體干細(xì)胞的生物學(xué)特征，這對深入發(fā)揮人干細(xì)胞的潛力有重要意義。另外，神經(jīng)干（祖）細(xì)胞移植物的免疫原性尚未充分研究。總體而言，只有在解決神經(jīng)干細(xì)胞移植治療達(dá)到何種療效程度、發(fā)揮作用的機制是什么等問題后，才能決定是否移植UCB來源的神經(jīng)干（祖）細(xì)胞來治療人類腦病。

圖2 UCB-NSCs可形成的神經(jīng)球免疫組化結(jié)果[22]

事實上，已證實人臍帶血移植可以促進(jìn)中風(fēng)[23]、肌肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥[24-25]、外傷性腦損傷[26]以及脊髓損傷小鼠的功能恢復(fù)[27-28]，但目前并未確定是哪些細(xì)胞在改善功能中起作用。因為移植的細(xì)胞，甚至包括腦內(nèi)輸注細(xì)胞，難以在腦部找到，行業(yè)內(nèi)人員更傾向于認(rèn)同細(xì)胞通過分泌營養(yǎng)因子增強腦部修復(fù)的內(nèi)源性機制。

Sun等[29]的研究表明UCB-nHSC有望用于神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷的修復(fù)或定向誘導(dǎo)分化后用于遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病中替代異常細(xì)胞。干細(xì)胞治療需要體外制備大量干細(xì)胞，并建立可直接有效分化成特定的神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)條件。UCB作為這種神經(jīng)修復(fù)的干細(xì)胞來源容易獲得，且不會產(chǎn)生像人胚胎細(xì)胞ESCs帶來的倫理問題。因此，UCB是一種神經(jīng)修復(fù)干細(xì)胞的重要來源。

五、展望

UCB-nHSC是再生醫(yī)學(xué)發(fā)展的重要資源，并能在一定程度上避免多能或全能干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)倫理問題，必將受到臨床應(yīng)用的廣泛歡迎。

應(yīng)該看到，目前報道的UCB-nHSC中，有些干細(xì)胞種類定義的范圍可能存在相互重疊的情況，這些干細(xì)胞一般根據(jù)細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)者以及他們采取的分離和擴增的方法來命名。UCB-nHSC的研究重點關(guān)注干細(xì)胞的起源、分化潛能和致瘤性，其實用性有待進(jìn)一步研究。另外，擴增或誘導(dǎo)分化為臨床移植所需數(shù)量的特定干細(xì)胞的方法尚未完全建立。需說明的是，臍帶血中的VSELs并未發(fā)現(xiàn)致瘤性，雖然這些細(xì)胞有效分離和擴增的方法尚未形成固定體系，但已受到未來臨床應(yīng)用研究的重視。近期研究表明，體細(xì)胞可以被重編程強制表達(dá)四種轉(zhuǎn)錄因子，包括Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4，從而使細(xì)胞返祖到一種多能狀態(tài)，稱為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）。iPSCs具有多向分化能力，且可來自自體的體細(xì)胞不會引起免疫排斥作用，又能夠避開醫(yī)學(xué)倫理問題，因此有望成為再生醫(yī)學(xué)期待的重要細(xì)胞來源。盡管如此，目前iPSCs重編程的效率極低以及致瘤性傾向的問題阻礙iPSCs的臨床應(yīng)用。正因如此，相對于iPSCs未來應(yīng)用存在的問題，胎盤（臍帶）血中存在的低抗原性、無致瘤性、易制備、不使用病毒載體和基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的臍帶血多能干細(xì)胞，將會在再生醫(yī)學(xué)中顯現(xiàn)重要價值。

UCB-nHSC以其特有的原始性、多樣性、多能性等特征，將會吸引越來越多的科研人員進(jìn)行深入研究，對再生醫(yī)學(xué)及前沿技術(shù)推廣應(yīng)用有重要作用，必將對廣大患者帶來希望。

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Research progress of non-hematopoietic functional committed progenitor/stem cells in umbilical cord blood

Xu Fengbo, Cui Guangjing, Cao Guangxin, Shen Baijun.1Yinfeng Biological Group,Jinan 250101, China;2Shandong Cord Blood Bank, Jinan 250101, China

Shen Bojun, Email: sbj915@yeah.net

There are a variety of non-hematopoietic stem cells in the umbilical cord blood and their potential use in non-hematopoietic fields have attracted great attention in recent years. This review summarizes the characteristics of embryonic-like stem cells, unrestricted somatic stem cells,multilineage progenitor cells, multipotent progenitor cells and neuronal progenitor cells which were found in the umbilical cord blood. The clinical application and existing problems of these cells are discussed. Finally, the prospect of the research and application are also presented.

Non-hematopoietic stem cells in umbilical cord blood; Very small embryoniclike stem cells; Unrestricted somatic stem cells; Multilineage progenitor cells; Neuronal progenitor cells

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.05.009

250101 濟(jì)南，銀豐生物工程集團(tuán)有限公司1；250101 濟(jì)南，山東省臍帶血造血干細(xì)胞庫2

沈柏均，Email：sbj915@yeah.net